利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法
专利汇可以提供利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用葡萄白粉菌接种葡萄离体 叶片 快速鉴定抗病性的方法。其技术方案是：葡萄白粉菌菌株小种分离、纯化与侵染；通过rDNA序列扩增与进化分析而获得高致病性的葡萄白粉菌菌株NAFU1；并分析该菌株的保存与扩繁；利用该菌株接种葡萄离体叶片，用台盼蓝 染色 接种后不同时间病叶，通过观察孢子萌发早晚、生长快慢、菌丝长短及有无细胞 坏死 出现等指标，快速准确的检测葡萄的抗病性。本发明保存扩繁的白粉菌产孢量大，孢子新鲜，致病性强，克服了传统田间鉴定周期长、重复性差、受 气候 影响的缺点，不但可以提高大规模检测葡萄种质资源抗病性效率，而且对开展大规模快速鉴定葡萄种质资源及其杂种后代和转基因葡萄植株抗病性具有直接参考价值。，下面是利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法专利的具体信息内容。
1.利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法，其特征是通过以下技术方案实现的：
a.葡萄白粉菌菌株小种分离与纯化
在葡萄白粉病发病盛期，在葡萄园采集严重感染葡萄白粉菌的叶片，采用单孢分离法，从采摘的病叶经分离纯化获得葡萄白粉菌，并对分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，选择其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定需要，即为鉴定用葡萄白粉菌菌株小种；
b.葡萄白粉菌菌株小种侵染
采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌菌株小种接种葡萄健康叶片，检测菌株小种对葡萄的侵染过程；
c.葡萄白粉菌菌株小种rDNA序列扩增
收集菌株小种纯化后的白粉菌分生孢子，提取该白粉菌基因组DNA，用白粉菌保守区通用引物ITS4和NS7进行PCR扩增，得到菌株小种保守区DNA片段序列；
d.葡萄白粉菌菌株小种进化分析
用葡萄白粉菌菌株小种保守区DNA片段序列在NCBI进行序列比对及进化分析，表明获得了一个新的葡萄白粉菌菌株；
e.葡萄白粉菌菌株小种保存与扩繁
采用直接扫落接种在盆栽葡萄叶片上，摩擦接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片和喷洒接种插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片三种保存方法，对葡萄白粉菌菌株小种进行保存与扩繁；
f.用葡萄白粉菌菌株小种接种葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片鉴定抗病性
取葡萄种质资源、葡萄杂交后代及转基因葡萄植株离体叶片，压片接种葡萄白粉菌菌株小种，分别在接种后不同时间段采样，用台盼蓝染色，普通显微镜观察，通过统计孢子萌发及菌丝生长情况，检测葡萄对白粉病抗性。
2.根据权利要求1所述的利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法，其特征是通过以下步骤用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种大田栽植葡萄种质资源离体叶片鉴定抗病性：
a.葡萄白粉菌菌株NAFU1分离与纯化
在葡萄白粉病发病盛期，在发病严重的葡萄园采集感染葡萄白粉菌的叶片，置于冰壶中带回实验室，选取病原菌发病症状明显的新鲜病叶置于密封袋中，待其发病达到特别明显后，从感染白粉菌的病叶上扫落白粉菌到新鲜的葡萄叶片上，然后将接种后的葡萄叶片置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，10-15d后，得到单克隆菌落，待该白粉菌单克隆长到直径为1cm时，用小毛笔蘸取该单克隆菌落再接种到新鲜、干净的葡萄叶片上进行培养，10-15d后再次重复此过程，共重复五次这种单克隆菌落分离过程，将分离纯化获得葡萄白粉菌病原菌菌株编号，分别保存，经对上述分离的葡萄白粉菌菌株进行致病性鉴定，其中一个菌株感病迅速，致病性强，符合鉴定要求，遂将其保存扩繁，命名为NAFU1；
b.葡萄白粉菌菌株NAFU1侵染
为进一步检测NAFU1对葡萄的侵染过程，采用压片接种法，用保存的新鲜白粉菌接种移栽7周的葡萄组培苗健康叶片，在接种后1d、2d、3d、4d、5d、7d、10d采样，台盼蓝染色，普通显微镜下观察菌丝生长，NAFU1接种葡萄叶片1d，孢子仅膨大，但尚未萌发，接种葡萄叶片3d，孢子开始萌发，菌丝生长正常，接种葡萄叶片10d后，菌丝生长旺盛，遍布葡萄叶片，可以看见明显的附着孢，表明白粉菌生长良好，可以用于后续的快速检测；
c.葡萄白粉菌菌株NAFU1rDNA序列扩增
收集NAFU1纯化后的白粉菌分生孢子0.1-0.2g，置入1.5ml离心管中，常规CTAB法提取NAFU1基因组DNA，无菌水溶解DNA，以NAFU1基因组DNA为模板，用白粉菌保守区通用引物ITS4：5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'和NS7：5'GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC3'进行PCR扩增，反应程序为：94℃3min，94℃30S，50℃30S，72℃1min，30个循环；72℃10min，
4℃10min，高保真LA酶，扩增出一条800-1000bp单一条带，将扩增出的葡萄白粉菌DNA片段连接到pMD19-T克隆载体，提取质粒，将酶切鉴定正确的菌液送北京华大公司测序，得到葡萄白粉菌保守区DNA片段的序列；
d.葡萄白粉菌菌株NAFU1进化分析
将得到的葡萄白粉菌NAFU1保守区DNA片段的序列在NCBI进行序列比对，用MEGA5.0软件，构建进化树，分析葡萄白粉菌菌株NAFU1的进化关系，确认NAFU1是葡萄白粉菌，可以用于后续的快速检测；
e.葡萄白粉菌NAFU1保存与扩繁
对分离纯化得到的葡萄白粉菌NAFU1进行保存，先后尝试以下三种保存方法：
e.1直接接种在盆栽葡萄叶片上：取感病葡萄叶片，用刷子将白粉菌孢子扫到盆栽健康葡萄叶片上，置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，
10-15d后，可见到明显的病斑；
e.2取离体葡萄叶片插于MS固体培养基中，用病叶摩擦接种离体叶片，然后置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度50-75％，10-15天后，可见到明显的病斑；
e.3收集病叶，在无菌水中涮洗，将孢子溶于水中，喷洒接种于插于MS固体培养基上的离体葡萄叶片，然后置于光照培养箱中，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度
50-75％，15-20天后，可见到明显的病斑；
f.用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种大田栽植葡萄种质资源离体叶片鉴定抗病性取大田栽植葡萄种质资源离体叶片，压片接种葡萄白粉菌NAFU1，分别在接种后0，24，
48和96h采样，将样品置于10ml离心管中，加入浓度为0.67mg/ml台盼蓝2ml，煮沸12min，冷却后，在离心管中加入水合氯醛3ml，静置24h后，倒去废液，重复三次，直到叶片蓝色褪去，然后用普通显微镜观察菌丝生长情况，刚接种时孢子尚未萌发，接种后24h，感病材料‘无核白’葡萄清晰可见菌丝生长，其余葡萄叶片上只见孢子萌发，未见明显菌丝，接种后
48h，感病材料‘无核白’葡萄菌丝生长更加旺盛，感病野生葡萄株系白河-13可以看见明显的菌丝生长，但没有‘无核白’葡萄多，抗病葡萄如白河35-1菌丝更少，接种后96h，感病材料‘无核白’葡萄不但菌丝生长更加旺盛，而且可以看见明显、成熟的孢子梗，但抗病葡萄如白河35-1、通化-3叶片上菌丝较短，且出现明显的细胞坏死，表明植物抗病性出现，通过观察孢子萌发早晚、生长快慢、菌丝长短及有无细胞坏死出现等指标，可以快速、准确检测该葡萄的抗病性；
3.根据权利要求2所述的利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法，其特征在于：
f.用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种葡萄杂交后代植株离体叶片鉴定抗病性
f.1葡萄杂交后代植株准备
将葡萄杂交后代种子播种于温室，播种基质为泥炭：珍珠岩：蛭石＝8:1:1，温度
22±1℃，光照强度12000LX，相对湿度70-85％，待播种生长6周后，取健康、正常叶片用于后续检测；
f.2台盼蓝染色
以上述温室播种生长6周、健康、正常的葡萄杂交后代为材料，分别剪取从顶端向下第
3、第4片叶片，插于清水中，用压片法接种葡萄白粉菌NAFU1，在接种后4-5d采样，将样品置于10ml离心管中，加入浓度为0.67mg/ml台盼蓝2ml，煮沸12min，冷却后，在离心管中加入水合氯醛3ml，静置24h后，倒去废液，重复三次，直到叶片蓝色褪去；
f.3镜检观察
在奥林巴斯普通光学显微镜下观察经上述台盼蓝染色的叶片，接种5d后，感病葡萄株系可以看见明显的菌丝生长，而且可以看见明显、成熟的孢子梗，但抗病葡萄叶片上菌丝较短，且出现明显的细胞坏死，表明植物抗病性出现。
4.根据权利要求2所述的利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法，其特征在于：
f.用葡萄白粉菌菌株NAFU1接种温室转基因葡萄植株离体叶片鉴定抗病性
f.1温室转基因葡萄植株准备
将生长健壮的转基因葡萄组培苗移栽于炼苗室，移栽基质为泥炭：珍珠岩：蛭石＝
8:1:1，温度22±1℃，光照强度10000LX，相对湿度90-95％，待移栽生长8周后，移栽于温室中，温度22±1℃，光照强度13000LX，相对湿度70-80％，继续生长4周后，取健康、正常叶片用于后续检测；
f.2台盼蓝染色
以上述温室移栽生长4周、健康、正常的转基因葡萄为材料，分别剪取从顶端向下第3、第4片叶片，插于清水中，用压片法接种葡萄白粉菌NAFU1，在接种后4-5d采样，将样品置于
10ml离心管中，加入浓度为0.67mg/ml台盼蓝2ml，煮沸12min，冷却后，在离心管中加入水合氯醛3ml，静置24h后，倒去废液，重复三次，直到叶片蓝色褪去；
f.3镜检观察
在奥林巴斯普通光学显微镜下观察经上述台盼蓝染色的叶片，接种5d后，未转基因葡萄可以看见明显的菌丝生长，而且可以看见明显、成熟的孢子梗，但抗病葡萄叶片上菌丝较短，且出现明显的细胞坏死，接种15d后，未转基因葡萄在叶片清晰可见一层白粉，而转基因葡萄未见明显白粉，出现一些坏死斑，表明植物抗病性出现。
利用葡萄白粉菌接种葡萄离体叶片快速鉴定抗病性的方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
12min，冷却后，在离心管中加入水合氯醛3ml，静置24h后，倒去废液，重复三次，直到叶片蓝色褪去，然后用普通显微镜观察菌丝生长情况，如附图4所示，刚接种时孢子尚未萌发，接种后24h，感病材料‘无核白’葡萄清晰可见菌丝生长，其余葡萄叶片上只见孢子萌发，未见明显菌丝，接种后48h，感病材料‘无核白’葡萄菌丝生长更加旺盛，感病野生葡萄株系白河-13可以看见明显的菌丝生长，但没有‘无核白’葡萄多，抗病葡萄如白河35-1菌丝更少，接种后96h，感病材料‘无核白’葡萄不但菌丝生长更加旺盛，而且可以看见明显、成熟的孢子梗，但抗病葡萄如白河35-1、通化-3叶片上菌丝较短，且出现明显的细胞坏死，表明植物抗病性出现，通过观察孢子萌发早晚、生长快慢、菌丝长短及有无细胞坏死出现等指标，可以快速、准确检测该葡萄的抗病性；
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