植物在其营养生长和生殖生长阶段需要氮。氮通过土壤矿化、应用氮 肥或者这二者而可为植物所利用。然而估计应用于农作物的50％-70％的氮 从植物-土壤系统中丧失[Peoples，M.B.et al.，“Minimizing Gaseous Losses of Nitrogen，”In Nitrogen Fertilizer in the Environment(Bacon，P.E.，ed.)Marcel Dekker，pp.565-606(1995)]。氮是最昂贵的植物营养素之一，氮肥不总是可 以以合理成本获得且氮肥的过量应用可导致径流中的污染问题。玉米是通 常需要氮肥以发挥其遗传潜力的农业重要植物的实例。
发明概述
本发明涉及转基因植物，该植物具有增加的氮利用效率、逆境耐性或 者这二种性质，其已经使用包括调节植物中氮利用的核酸序列的新载体构 建体转化。本发明还涉及用以转化植物的分离的载体以及涉及用于检测转 化的植物中感兴趣的核苷酸序列的表达的抗体。本发明还涉及在植物中表 达相应于调节植物中氮利用的核酸序列的核酸分子的方法。
特别地，用于转化植物的载体已经使用选自如下的核苷酸序列构建： SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO： 22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、 SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：38以及其 变体、片段和互补序列。这些载体包含5’DNA启动子序列和3’终止子序列， 其中所述核酸序列、DNA启动子序列和终止子序列是可操纵地连接的，以 允许所述核苷酸序列转录。在一些实施方案中，所述启动子序列可以是组 成型植物启动子或者组织特异性启动子。
本发明还包括多克隆抗体，包含由选自如下的核苷酸序列编码的多肽 的多克隆抗体：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO： 9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、 SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36以及SEQ ID NO：38。
本发明还包括用选自如下的一或多个核苷酸序列转化的植物：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO： 24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：38以及其变体和片段。所述植物 选自水稻、玉米、大豆、芸苔(cauola)、小麦、苜蓿、大麦、黑麦、棉花、 向日葵、花生、甘薯、豆(bean)、豌豆(pea)、马铃薯、油菜(oilseed rape)、 高粱、饲草(forage grass)、牧草(pasture grass)、草坪草以及甘蔗。本发明还 包括这种植物的组成部分、从这种植物产生的植物种子以及用本发明的载 体构建体转化的植物种子。
本发明还包括用选自如下的一或多个核苷酸序列转化的宿主细胞：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO： 11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、 SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36以及SEQ ID NO：38。所述宿主 细胞可以是细菌细胞或者植物细胞。
本发明还包括在植物中表达由氮调节的核酸分子的方法，所述方法包 括提供用本发明的载体构建体转化的转基因植物或者植物种子，以及在有 效条件下生长所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物，所 述条件是在所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物中表达 所述核酸分子的条件。转基因植物的生长有效增加所述转基因植物或者由 所述转基因植物种子长成的植物的氮摄取，和/或增加所述转基因植物或者 由所述转基因植物种子长成的植物的氮利用效率。本发明还包括前述方法， 其中提供转基因植物或者转基因植物种子。本发明还包括前述方法，其中 所述植物选自水稻、玉米、芸苔、小麦、苜蓿、大麦、黑麦、棉花、向日 葵、花生、甘薯、豆、豌豆、马铃薯、油菜、高粱、饲草、牧草、草坪草 以及甘蔗。
本发明还包括通过在植物中表达由氮调节的核酸分子而改良植物逆境 耐性的方法，所述方法包括提供用本发明的载体构建体转化的转基因植物 或者植物种子并且在有效条件下生长所述转基因植物或者由所述转基因植 物种子长成的植物，所述条件是在所述转基因植物或者由所述转基因植物 种子长成的植物中表达所述核酸分子的条件。
本发明还包括通过在植物中表达由氮调节的核酸分子而改变植物形态 学的方法，所述方法包括提供用本发明的载体构建体转化的转基因植物或 者植物种子并且在有效条件下生长所述转基因植物或者由所述转基因植物 种子长成的植物的步骤，所述条件是在所述转基因植物或者由所述转基因 植物种子长成的植物中表达所述核酸分子的条件。
本发明还包括载体构建体，其包含编码选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO： 5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39的氨基酸序列的核苷酸序列、5’ DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA启动子序列 以及终止子序列可操纵地连接以允许所述核苷酸序列转录。
本发明还包括包含由植物中氮调节的核苷酸序列的载体构建体，其中 所述核苷酸序列选自核苷酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO： 7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO： 28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36和 SEQ ID NO：38；与如下核苷酸序列具有至少95％序列相同性的核苷酸序列： SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO： 11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO： 32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或者SEQ ID NO：38，其中所述核苷酸 序列由植物中氮调节；编码选自如下氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、 SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39；以及编码与如下氨基酸序列具 有至少95％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、 SEQ ID NO：37或者SEQ ID NO：39，其中所述核苷酸序列由植物中氮调节； 其中所述构建体进一步包含5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述 核苷酸序列、DNA启动子序列以及终止子序列是可操纵地连接的以允许所 述核苷酸序列的转录。
优选实施方案详述
更有效利用氮的植物品种的开发将降低氮的过量施用、节约农场主的 生产成本、帮助不能获得肥料的发展中国家的农场主获益并且降低与应用 过量氮肥相关的污染。一种已经用于开发具有改良的氮利用的植物品种的 方法依赖于常规的植物育种技术。
需要开发更有效地吸收和利用氮的植物栽培种。植物学家已经采用简 略语氮利用效率(NUE)，且已经开发了各种测量和评估NUE的方法[Craswell， E.T.and Godwin，D.C.(1984)The efficiency of nitrogen fertilizers applied to cereals grown in different climates.In Advances in Plant Nutrition(Vol.1) (Tinker，P.B.and Lauchli，A.，eds)，pp.1-55，Praeger Publishers；Steenbjerg，F. and Jakobsen，S.T.(1963)Plant nutrition and yield curves.Soil Sci.95，69-90； Siddiqi，M.Y.and Glass，D.M.(1981)Utilization index：a modified approach to the estimation and comparison of nutrient utilization efficiency in plants.J.Plant Nutr.4，289-302；Moll，R.H.et al.(1982)Analysis and interpretation of factors which contribute to efficiency of nitrogen utilization.Agron.J.74，562-564]。在 定义中有一些差异。一些定义基于总生物量，而其它定义基于产生的谷物 的重量。另一组定义使用从土壤中提取氮的效率加以描述。用于改良谷物 产量所应用的氮的效率可以通过农学利用率(AE)即生理学效率和利用效率 的乘积或者摄取效率与利用效率的乘积NUEg进行测量。其它定义将生理学 因素考虑在内。
如在本说明书中所用，术语氮利用效率或者NUE被定义为包括在同化 途径中任何主要氮代谢库大小的可测量改变(例如可包括如下一或多项的可 测量改变：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬 酰胺、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、 植物部分的总蛋白质含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)，或者植 物示出在较低的施氮肥水平提供相同或提高的产量，或者植物示出当与未 用本发明的氮调节的核酸构建体转化的植物相比时在相同施氮肥水平提供 提高的产量。“可测量改变”可包括氮同化途径的任何成分(代谢库)的量的 增加或降低。改变可包括所述途径中一或多个代谢库的降低或增加，或者 一或多个库的降低伴随一或多个其它库的增加，例如当氮同化途径中一个 中间体被用于产生另一个中间体或者所述途径的产物时。例如，在谷氨酸 向谷氨酰胺的转化中，谷氨酸的水平可降低而谷氨酰胺的水平可增加。因 此，虽然不受任何特别的理论或机制的束缚，一或多个这些库中的任何改 变均提示氮被植物更有效地利用。
氮利用效率的增加可以与同化途径中任何主要氮代谢库大小中大约 5％、大约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、 100％、125％、150％、大约200％或者更高的可测量改变相关。在一个实施 方案中，本发明的转基因植物当与不含本发明的氮调节序列的植物相比时 从环境摄取增加的氮。“氮调节序列”是指应答暴露于氮而被调节(例如增加 或降低，或者上调或下调)的核苷酸或氨基酸序列，“调节氮利用的核苷酸序 列”是指编码与氮代谢相互作用的蛋白质的核苷酸序列。
本发明进一步提供了通过在植物中表达一或多个氮调节核苷酸序列而 改良植物逆境耐性的方法。在一个实施方案中，所述氮调节核苷酸序列是 SEQ ID NO：2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、 36或38，或者其变体和片段。在另一个实施方案中，所述氮调节核苷酸序 列是编码SEQ ID NO：3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、 31、33、35、37或39的核苷酸序列，或者其变体和片段。
如本文所用，术语“逆境(stress)”或“逆境条件(stress condition)”是指 植物、植物细胞等暴露于对植物的代谢、生长、发育、繁殖和/或存活(统称 “生长”)具有不利作用的物理或化学剂或者条件。逆境可以通过例如环境 因素如水(例如灌溉、干旱、脱水)、厌氧条件(例如低水平氧)、异常渗透条 件、盐度或温度(例如高热/温热、寒冷、严寒、霜冻)、营养素缺乏如氮缺 乏或者暴露于污染物或者通过激素、第二信使或者其它分子而施加于植物。 厌氧逆境例如是由于足以产生逆境应答的氧水平降低(低氧或缺氧)。灌溉逆 境可以是由于植物、植物部分、组织或分离的细胞在液体介质中长期或短 暂浸泡所致，例如在季风、多雨季节、洪水或者过量灌溉植物等期间发生。 寒冷逆境或者热逆境可以是分别由于温度从特定植物物种的最佳生长温度 范围降低或升高而发生。本领域技术人员易于确定且已知这种最佳生长温 度范围。脱水逆境可以通过细胞、组织、器官或者完整植物的水分丧失、 膨压降低、或者水含量降低而引起。干旱逆境可由于水的匮乏或者供给细 胞、组织、器官或生物体的水减少而引起或者与之相关。盐逆境可以与细 胞的胞内或胞外环境的渗透压波动相关或者由其引起。渗透逆境可以与例 如植物细胞的胞内或胞外环境中分子浓度的改变相关或者由其引起，特别 是在所述分子不能穿过植物细胞膜而隔离(partitioned)的情况中。
逆境耐性的改良可以在指定逆境条件下对植物性能进行任何定量或定 性测量而评定并且与在相同逆境条件下生长的未用本发明的氮调节序列转 化的植物的性能进行对比。因此，所述植物可表现为改良的氮含量、改变 的氨基酸或蛋白质组成、健壮的生长特性、增加的营养体产量(vegetative yield)或者更好的种子产量和品质。这些植物可以通过检查如下任何参数而 鉴别：1)生长速度，根据湿重或干重的增长速度测量；2)成熟植物的营养体 产量，根据鲜重或干重测量；3)种子或果实产量；4)种子或果实重量；5)植 物的总氮含量；6)果实或种子的总氮含量；7)植物的游离氨基酸含量；8)果 实或种子的游离氨基酸含量；9)植物的总蛋白质含量；以及10)果实或种子 的总蛋白质含量。检测这些参数的程序和方法为本领域技术人员所熟知。 这些方法可包括测量酶/蛋白质水平的酶测定法和免疫测定法；测量各种植 物组织的氨基酸组成、游离氨基酸库或者总氮含量的测定法；根据鲜重随 着时间的增加测量生长速度；或者根据总干重和/或总种子重量测量植物产 量。
细菌或植物细胞的转化
本发明提供了新的核苷酸序列，其调节植物中氮利用效率。本发明还 提供了本发明的氮调节蛋白质的氨基酸序列。
可以对本发明的氮调节核苷酸序列进行修饰以获得或者增强在植物细 胞中的表达。本发明的氮调节序列可以提供在表达盒中以在感兴趣的植物 中表达。“植物表达盒”包括能导致在植物细胞中从开放读框中表达蛋白质 的DNA构建体。所述盒包括5′-3′转录方向的与本发明的DNA序列可操纵 地连接的转录起始区(即启动子)以及在植物中起作用的转录和翻译终止区 (即终止区)。所述盒可另外含有被共转化进生物体中的至少一个其它基因， 如选择标记基因。或者，所述其它基因可以提供在多个表达盒上。这种表 达盒具有多个限制位点，用以插入氮调节序列使之在调节区的转录调节下。
“启动子”是指发挥指导下游编码序列转录功能的核酸序列。启动子 与其它转录和翻译调节核酸序列(也称作控制序列)在一起是感兴趣的DNA 序列表达所必需的。优选地，启动子是已知在导入了本发明的核苷酸序列 的生物体中刺激转录的启动子。
启动子与植物宿主和/或本发明的DNA序列可以是天然的或者类似的， 或者是外源或异源的。另外，启动子可以是天然序列或者是合成序列。在 启动子与植物宿主是“天然”或者“同源”的情况中，所述启动子是指在 导入所述启动子的天然植物中发现的启动子。在启动子与本发明的DNA序 列是“外源”或者“异源”的情况中，所述启动子是指与本发明的DNA序 列可操纵地连接的非天然或非自然发生的启动子。“异源”通常是指核酸序 列与其存在于之中的细胞或者天然基因组的一部分不是内源的核酸序列， 但是已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微轰击(microprojection) 等技术加入细胞中。“可操纵地连接”是指启动子与第二个序列之间的功能 性连接，其中所述启动子序列起始并介导相应于第二个序列的DNA序列的 转录。通常“可操纵地连接”是指连接的核酸序列是邻近的，且在需要连 接两个蛋白质编码区的情况中是邻近并且位于相同读框中。
在一个实施方案中，启动子是组成型启动子。用于植物中的合适的组 成型启动子包括：来自植物病毒的启动子，如花生褪绿条死病花椰菜花叶 病毒(chlorotic streak caulimovirus，PC1SV)启动子(美国专利No.5,850,019)； 花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812)； 小球藻病毒甲基转移酶基因启动子(美国专利No.5,563,328)以及玄参花叶病 毒(FMV)全长转录启动子(美国专利No.5,378,619)；如水稻肌动蛋白这样的 基因启动子(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163-171)；遍在蛋白基因启动 子(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen et al. (1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)，包括TrpPro5启动子(美国专利申请No. 10/377,318；2005年3月16日提请)；pEMU启动子(Last et al.(1991)Theor. Appl.Genet.81：581-588)；MAS启动子(Velten et al.(1984)EMBO J.3： 2723-2730)；玉米H3组蛋白启动子(Lepetit et al.(1992)Mol.Gen.Genet. 231：276-285和Atanassova et al.(1992)Plant J.2(3)：291-300)；欧洲油菜 (Brassica napus)ALS3(PCT申请WO 97/41228)；以及各种农杆菌基因的 启动子(见美国专利No.4,771,002、5,102,796、5,182,200和5,428,147)。
在另一个实施方案中，启动子是组织特异性启动子。常用的组织特异 性启动子的列表可见于Moore et al.(2006)Plant J.45(4)：651-683中的综述， 该文献以其全部内容并入本文作参考。
这种构建体通常也含有5′和3′非翻译区。这种构建体可含有“信号序 列”或者“前导序列”以促进感兴趣的肽的共翻译或者翻译后转运至一定 的胞内结构如叶绿体(或者其它质体)、内质网或者高尔基体或者被分泌。例 如，基因可以被工程化为含有信号肽以促进肽转移进内质网中。“信号序列” 是指已知或者推测导致共翻译或翻译后的肽转运穿过细胞膜的序列。在真 核细胞中，这典型包括分泌进高尔基体中，一些导致糖基化。“前导序列” 是指这样的任何序列，当其被翻译时导致氨基酸序列足以触发肽链共翻译 转运至亚细胞细胞器。因此，其包括通过进入内质网、进入液泡、质体包 括叶绿体、线粒体等而靶向转运和/或糖基化的前导序列。。也可以优选工程 化植物表达盒使其含有内含子，由此内含子的mRNA加工为表达所需。
“3′非翻译区”是指位于编码序列下游的核苷酸序列。多腺苷酸化信号 序列及编码能影响mRNA前体3′末端添加聚腺苷酸段(tracts)的调节信号的 其它序列是3′非翻译区。“5′非翻译区”是指位于编码序列上游的核苷酸序 列。
其它上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是增强启动子区域表 达的核苷酸序列。增强子为本领域所熟知，包括但不限于SV40增强子区域 和35S增强子元件。
终止区与转录起始区可以是天然的，可以与本发明的氮调节序列是天 然的，或者可以衍生自另一来源。实用的终止区可得自根癌农杆菌(A. tumefaciens)的Ti-质粒，如章鱼碱合酶及胭脂氨酸合成酶终止区，或者马 铃薯蛋白酶抑制剂II序列(PinII)，如Liu et al.(2004)Acta Biochim Biophys Sin 36(8)：553-558所述。也见于Guerineau et al.(1991)Mol. Gen.Genet. 262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe et al. (1990)Gene 91：151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903； 以及Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。
在适当情况下，可以优化基因以增加在转化的宿主细胞中的表达。也 就是说，基因可以通过使用改良表达的宿主细胞优选密码子合成，或者可 以通过使用宿主优选的密码子使用频率的密码子合成。通常基因的GC含量 将增加。见例如Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11论述的宿 主优选的密码子使用。本领域已知合成宿主优选的基因的方法。见例如美 国专利No.6,320,100、6,075,185、5,380,831和5,436,391，美国公布的申请 No.20040005600和20010003849，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res. 17：477-498，所述文献在此并入本文作参考。
在一个实施方案中，感兴趣的核酸靶向叶绿体以表达。在这种方式中， 在感兴趣的核酸未直接插入叶绿体中时，表达盒将另外含有编码转运肽的 核酸以指导感兴趣的基因产物到达叶绿体。这种转运肽为本领域所已知。 见例如Von Heijne et al.(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark et al. (1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun. 196：1414-1421；以及Shah et al.(1986)Science 233：478-481所述。
被靶向于叶绿体的感兴趣的核酸可以优化为在叶绿体中表达，以解决 在植物细胞核与该细胞器之间密码子使用中的差异。在这种方式中，感兴 趣的核酸可以通过使用叶绿体优选密码子合成。见例如在此并入作参考的 美国专利No.5,380,831所述。
典型地，这种“植物表达盒”被插入“植物转化载体”中。“转化载体” 是指细胞有效转化必需的DNA分子。这种分子可以由一或多个表达盒组 成，且可以组织成一个以上的“载体”DNA分子。例如二元载体是这样的 植物转化载体，其利用两个非邻近的DNA载体编码植物细胞转化所有必需 的顺式和反式作用功能(Hellens and Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。“载体”是指设计为在不同宿主细胞之间转移的核酸构 建体。“表达载体”是指在外源细胞中具有掺入、整合及表达异源DNA序 列或片段能力的载体。
这种植物转化载体可以包含为实现植物转化所需的一或多个DNA载 体。例如，本领域通常利用包含一个以上连续DNA节段的植物转化载体。 本领域通常将这些载体称作“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载 体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA节段的大小 和复杂性非常大，且有利于区别各个DNA分子的功能。二元载体典型含有 质粒载体，其含有T-DNA转移所需的顺式作用序列(如左边界和右边界)、 被工程化能在植物细胞中表达的选择标记，以及“感兴趣的核苷酸序列”(被 工程化能在希望产生转基因植物的植物细胞中表达的核苷酸序列)。在这个 质粒载体上还存在细菌复制所需的序列。顺式作用序列的排列方式是使得 有效转移进植物细胞中并且在其中表达。例如，选择标记基因和感兴趣的 基因位于左边界与右边界之间。通常第二个质粒载体含有反式作用因子， 其介导T-DNA从农杆菌转移至植物细胞。如本领域所已知，这个质粒通常 含有毒力功能(Vir基因)，使得农杆菌感染植物细胞，并且通过在边界序列 裂解以及vir-介导的DNA转移而转移DNA(Hellens and Mullineaux(2000) Trends in Plant Science，5：446-451)。一些类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、 GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。第二个质粒载体对于通 过其它方法例如是显微轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇法等转化植物 不是必需的。
可用于本发明构建体中的改变或改良的变体
可用于本发明中的核苷酸序列和氨基酸序列可以通过各种方法改变， 而且这些改变可产生编码蛋白质的序列，所述蛋白质与由本文揭示的氮调 节序列编码的蛋白质具有不同的氨基酸序列。
可用于本发明的核苷酸序列包括SEQ ID NO：2、4、7、9、11、13、15、 17、22、24、26、28、30、32、34、36和38所示序列，以及其变体、片段 和互补序列。如本文所用，术语“核苷酸序列”或者“核酸分子”包括DNA 分子(例如cDNA或者基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷 酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链分子但 优选是双链DNA。“互补序列”是指与指定核苷酸序列充分互补的核苷酸 序列，由此其可以与指定核苷酸序列杂交，从而形成稳定双链体。由这些 核苷酸序列编码的氮调节蛋白质的相应氨基酸序列示于SEQ ID NO：3、5、 8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37和39，以及 其变体和片段。本发明还包含如下核酸分子的应用，所述核酸分子包含编 码部分长度的氮调节蛋白质的核苷酸序列及其互补序列。
是这些氮调节核苷酸序列的片段的核酸分子也可用于本发明。“片段” 是指编码氮调节蛋白质的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可编码 氮调节蛋白质的生物学活性部分，或者其可以是在下文所述方法中可用作 杂交探针或PCR引物的片段。是氮调节核苷酸序列的片段的核酸分子根据 指定用途包含本文揭示的全长氮调节核苷酸序列的至少大约15、20、50、 75、100、200、300、350或者至少大约400个连续的核苷酸或者直至全长 序列核苷酸。“连续”核苷酸是指彼此紧密相邻的核苷酸残基。
是这些氮调节多肽的片段的多肽也可用于本发明中。“片段”是指编码 SEQ ID NO：3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、 35、37或39所示氮调节蛋白质的氨基酸序列的一部分，且其保留氮利用效 率。氮调节蛋白质的生物学活性部分可以是这样的多肽，即例如长度为10、 25、50、100、125、150、175、200、250、300、350、400或更多个氨基酸。 这种生物学活性部分可以通过重组技术制备，并评估其氮利用效率。如本 文所用，片段包含SEQ ID NO：3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、 27、29、31、33、35、37或39所示序列的至少8个连续氨基酸。然而，本 发明也包含其它片段，如超过大约10、20、30、50、100、150、200、250、 300、350或400个氨基酸的任何蛋白质片段。
本发明还包含变体核酸分子或者变体氨基酸序列在本发明的方法和组 合物中的应用。氮调节核苷酸序列的“变体”包括那些序列，其编码本文 揭示的氮调节蛋白质但是由于遗传密码的简并性而有所不同的序列，以及 与上述序列基本相同的那些序列。天然发生的等位基因变体可以通过熟知 的分子生物学技术鉴别，例如在下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技 术。变体核苷酸序列还包括通过合成获得的核苷酸序列，其已经例如通过 使用定点诱变技术产生但是其仍编码本发明揭示的氮调节蛋白质，如下文 论述。可用于本发明中的变体蛋白质是生物学活性的，即其保留希望的天 然蛋白质生物学活性，即氮利用效率和/或改良的逆境耐性。
“变体”是指具有与SEQ ID NO：3、5、8、10、12、14、16、18、23、 25、27、29、31、33、35、37或39所示氨基酸序列具有至少大约60％、65％、 大约70％、75％、80％、85％、或者90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或者99％相同性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体还包 括由在严格条件下与SEQ ID NO：2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、 26、28、30、32、34、36或38所示核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子 编码的多肽。变体包括由于诱变而导致氨基酸序列不同的多肽。本发明涵 盖的变体蛋白质是生物学活性的，即其仍具有天然蛋白质的希望的生物学 活性，即保留氮利用效率和/或改良的逆境耐性。
可用于本发明中的优选的氮调节蛋白质由与SEQ ID NO：2、4、7、9、 11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示核苷酸序列 基本相同的核苷酸序列编码。术语“基本相同的”是指利用本文描述的序 列对比程序之一使用标准参数与参考序列相比具有至少大约60％或65％ 序列相同性、大约70％或75％序列相同性、大约80％或85％序列相同性、 或者大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％ 序列相同性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员意识到可以对这些值 适当调节以通过考虑到密码子简并性、氨基酸相似性、读框位置等因素确 定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应相同性。
为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸的相同性百分比，对序列进行 排列以进行最佳对比。两个序列之间的相同性百分比是所述序列共有的相 同位置数的函数(即相同性百分比＝相同位置数/总位置数(例如重叠位置)× 100)。在一个实施方案中，两个序列是相同长度的。两个序列之间的相同性 百分比可以使用与下文描述的那些相似的技术确定，允许或不允许缺口。 在计算相同性百分比时，典型计算精确匹配。
两个序列之间的相同性百分比的确定可以使用数学算法完成。用于对 比两个序列的数学算法的非限制性例子是Karlin and Altschul(1990)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 87：2264中描述的算法，由Karlin and Altschul(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877加以修改。将这种算法与Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403所述的BLASTN和BLASTX程序组合。 BLAST核苷酸检索可以利用BLASTN程序进行，score＝100、wordlength＝ 12，以获得与本发明氮调节核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检 索可以利用BLASTX程序进行，score＝50、wordlength＝3，以获得与本发 明氮调节蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口对比以进行对比， 可以利用Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389所述的Gapped BLAST。或者，可以使用PSI-Blast进行重复检索，检测分子之间的距离关 系。见Altschul et al.(1997)supra。当利用BLAST、Gapped BLAST和 PSI-Blast程序时，可以使用各自程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参 数。见www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列对比的另一个数学算法的非限制性 例子是ClustalW算法(Higgins et al.(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。 ClustalW对比序列并排列对比了完整氨基酸或DNA序列，因此可以提供关 于完整氨基酸序列的序列保守性数据。ClustalW算法用于一些可商购的 DNA/氨基酸分析软件包中，例如the Vector NTI Program Suite的ALIGNX 模块(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。在利用ClustalW进行氨基酸序 列排列对比之后，可以确定氨基酸相同性百分比。用于分析ClustalW序列 对比的一个非限制性软件程序例子是GENEDOCTM。GENEDOCTM(Karl Nicholas)可以评定多个蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和相同性。用 于序列对比的数学算法的另一个非限制性例子是Myers and Miller(1988) CABIOS4：11-17所述算法。将这个算法与ALIGN程序(2.0版)组合，后者是 GCG序列对比软件包(得自Accelrys，Inc.，9865 Scranton Rd.，San Diego， California，USA)的一部分。当利用ALIGN程序对比氨基酸序列时，可以使 用PAM120权重残基表(weight residue table)、缺口长度罚分为12以及缺 口罚分为4。
优选的程序是GAP version 10，其使用Needleman and Wunsch(1970)J. Mol.Biol.48：443-453所述算法。GAP Version 10可以使用如下参数：核苷 酸序列的相同性百分比和相似性百分比使用GAP Weight为50和Length Weight为3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的相同性百分比 和相似性百分比使用GAP Weight为8和Length Weight为2，以及 BLOSUM62评分矩阵。也可以使用等价程序。“等价程序”是指这样的任 何序列对比程序，其对于质询的两个序列而言，当与通过GAP Version 10 产生的相应序列排列对比结果进行对比时，产生具有相同核苷酸或氨基酸 残基匹配和相同序列相同性百分比的序列对比结果。
技术人员会进一步意识到在本发明的核苷酸序列中可以通过突变导入 变化，从而导致编码的氮调节蛋白质的氨基酸序列变化，而不改变所述蛋 白质的生物学活性。因此，变体分离的核酸分子可以通过在本文揭示的相 应核苷酸序列中导入一或多个取代、添加或者缺失而产生，由此在编码的 蛋白质中导入一或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术导入 突变，例如定点诱变和PCR介导的诱变。这种变体核苷酸序列也包含在本 发明中。
例如，保守氨基酸取代可以在一或多个预定的、优选非必需氨基酸残 基进行。“非必需”氨基酸残基是在氮调节蛋白质的野生型序列中可以被改 变但是不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是为生物活性所 必需的残基。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基 酸残基置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中有详细说明。 这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性 侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，无电荷极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链 氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲 硫氨酸、色氨酸)，β-分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及 芳族侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保留功能的氨 基酸取代可以在非保守区域进行。通常这种取代不是针对保守氨基酸残基 或者保守基序中的氨基酸残基进行，这种残基是蛋白质活性必需的。然而 本领域技术人员理解功能变体在保守残基中可具有少量保守或非保守的改 变。保守的且为蛋白质活性必需的残基的例子包括例如在已知参与氮同化 作用的相似或相关序列的对比中包含的在所有蛋白质之间均相同的残基。 保守的但是可允许保守氨基酸取代且仍保留活性的残基的例子包括例如在 已知参与氮同化作用的相似或相关序列的对比中包含的在所有蛋白质之间 仅具有保守取代的残基。
或者，变体核苷酸序列可以通过沿着所有或部分编码序列随机导入突 变例如通过饱和诱变而产生，对所得突变体筛选赋予氮利用效率的能力以 鉴别保留活性的突变体。在诱变之后，编码的蛋白质可以重组表达，蛋白 质的活性可以通过使用标准测定技术确定。
使用例如PCR、杂交等方法可以鉴别相应的氮调节序列，这种序列与 本发明的序列基本相同。见例如Sambrook J.，and Russell，D.W.(2001) Molecular Cloning：A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)以及Innis，et al.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，NY)。在杂交方法中，所 有或部分氮调节核苷酸序列可用于筛选cDNA或基因组文库。构建这种 cDNA和基因组文库的方法为本领域所已知，在Sambrook and Russell，2001， supra中揭示。
本发明的核苷酸或氨基酸序列的变体或片段通常编码保留全长氮调节 蛋白质的生物学活性(即保留氮利用效率)的蛋白质片段。“保留氮利用效率” 是指所述变体或片段具有SEQ ID NO：3、5、8、10、12、14、16、18、23、 25、27、29、31、33、35、37或39所示全长氮调节蛋白质或者SEQ ID NO： 2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36、或38 所示全长氮调节核苷酸序列的至少大约30％、至少大约50％、至少大约70％ 或者至少大约80％的氮利用效率和/或逆境耐性。监测氮利用效率的方法包 括检测同化途径中任何主要氮代谢库大小的变化(例如硝酸盐、亚硝酸盐、 氨、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、 甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、植物部分的总蛋白质含量、植物部 分的总氮含量和/或叶绿素含量中可测量的变化)或者检测与不含有或者不 表达本发明的氮调节序列的植物相比，植物以较低的氮肥水平提供相同或 增加的产量的能力或者植物在相同氮肥水平提供增加的产量的能力。“相 同”或“较低”氮肥水平是指通常应用于不表达本发明的氮调节序列的植 物的氮的水平。本领域已知大多数(如果不是所有)感兴趣的植物品种的 足够的氮水平。其它指导可见于例如Hewitt(1966)Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition，2nd ed.，Farnham Royal(Bucks)， Commonwealth Agricultural Bureaux；以及Hewitt(1975)Plant Mineral Nutrition，London，English University Press。
可用于本发明中的多肽序列可以通过各种方式改变，包括氨基酸取代、 缺失、截短和插入。这种处理方法为本领域所已知。例如，本文揭示的氮 调节蛋白质的氨基酸序列变体可以通过核苷酸序列中的突变而制备。这也 可以通过各种形式的诱变和/或定向进化中的一种实现。在一些情况中，氨 基酸序列中编码的改变基本上不影响蛋白质的功能。这种变体具有希望的 氮利用效率。然而，本发明的氮调节序列改变或改良氮利用的能力可以通 过使用这种技术之一在本发明组合物上进一步改良。例如，可以在DNA复 制期间呈现高比率碱基错掺入的宿主细胞例如XL-1 Red(Stratagene，La Jolla， CA)中表达本文揭示的核苷酸序列。在这种菌株增殖之后，可以分离DNA(例 如通过制备质粒DNA或者通过PCR扩增以及将所得PCR片段克隆进载体 中)，如本文在别处所述将DNA转化进植物中并测量氮利用效率。
或者，可以在氨基或羧基末端对许多蛋白质的蛋白质序列进行改变而 基本不影响其活性。这可包括通过现代分子学方法导入的插入、缺失或者 改变，所述分子学方法例如为PCR，包括依靠在PCR扩增中使用的寡核苷 酸中包含氨基酸编码序列而改变或延伸蛋白质编码序列的PCR扩增。或者， 加入的蛋白质序列可包括完整的蛋白质编码序列，如本领域常用于产生融 合蛋白的那些序列。这种融合蛋白通常用于(1)增加感兴趣的蛋白质的表达， (2)导入结合结构域、酶活性或者表位以促进蛋白质纯化、蛋白质检测或者 本领域已知的其它实验性应用，或者(3)使蛋白质靶向亚细胞细胞器分泌或 翻译，例如靶向革兰氏阴性细菌的周质空间或者真核细胞的内质网，后者 通常导致蛋白质糖基化。
本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还包含衍生自诱变和重组程序如 DNA改组的序列。使用这种程序，一或多个不同的氮调节蛋白质编码区可 用于产生具有希望性质的新的氮调节蛋白质。以这种方式，从包含具有充 分的序列相同性且可以在体外或体内同源重组的序列区域的一群相关序列 多核苷酸中产生重组多核苷酸文库。例如，使用这种方法，编码感兴趣的 结构域的序列基序在用于本发明中的氮调节序列与其它已知的氮调节序列 之间可以改组以获得编码具有改良的感兴趣的性质如改良的氮利用的蛋白 质的新序列。本领域已知这种DNA改组的方法。见例如Stemmer(1994)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751、Stemmer(1994)Nature 370：389-391、 Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15：436-438、Moore et al.(1997)J.Mol. Biol.272：336-347、Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509、Crameri et al.(1998)Nature 391：288-291以及美国专利No. 5,605,793和5,837,458所述。
植物转化
本发明的方法包括在植物中导入一或多个氮调节核苷酸序列。在一些 实施方案中，仅一个本发明揭示的氮调节序列被导入植物中。在其它实施 方案中，导入至少2个、至少3个、至少4个或者更多个所述序列。在导 入多个序列的情况中，每个核苷酸序列均不相同。如果两个核苷酸序列在 至少一个核苷酸位置不同则认为这两个序列是不相同的。因此，不相同的 核苷酸序列包括编码相同氨基酸序列的两或多个不同的核苷酸序列(例如已 经优化以在植物中表达的一或多个)以及编码至少两个不同氨基酸序列的两 或多个不同的核苷酸序列。
“导入”是指为植物提供包含一或多个氮调节序列的一或多个构建体， 由此所述构建体得以进入植物细胞的内部。本发明的方法不需要使用将核 苷酸构建体导入植物的特殊方法，仅是所述核苷酸构建体得以进入至少一 个植物细胞的内部即可。将核苷酸构建体导入植物中的方法为本领域所已 知，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法以及病毒介导的方法。
通常植物转化方法包括将异源DNA转移进靶植物细胞(例如不成熟或 成熟胚，悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，随后应用最大 阈值水平的合适选择(依赖于选择标记基因)从未转化的一组细胞中回收转 化的植物细胞。典型将外植体转移至新鲜供应的相同培养基中并常规培养。 随后，转化的细胞在被置于补加了最大阈值水平选择剂(即抗生素，如壮观 霉素和卡那霉素)的再生培养基中之后分化为芽(shoot)。然后将芽转移至选 择性生根培养基中以回收生根的芽或小植物。随后使该转基因小植物生长 为成熟植物并产生能育种子(例如Hiei et al.(1994)The Plant Journal 6： 271-282；Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750所述)。将外植 体转移至新鲜供应的相同培养基中并常规培养。关于产生转基因植物的技 术和方法的一般描述见Ayres and Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13：219-239和Bommineni and Jauhar(1997)Maydica 42：107-120所 述。由于转化的材料含有许多细胞，因此转化和未转化的细胞均存在于任 何选定的靶愈伤组织或组织或细胞中。杀死未转化的细胞并且使得转化的 细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。通常除去未转化的细胞的能力是 对快速回收转化的植物细胞以及成功产生转基因植物的一个限制。然后可 以使用分子和生物化学方法证实转基因植物的基因组中整合的感兴趣的异 源基因的存在。
转基因植物的产生可以通过许多方法进行，所述方法包括但不限于通 过农杆菌在植物细胞中导入异源DNA(农杆菌介导的转化)、用与粒子附着 的异源外源DNA轰击植物细胞以及各种其它非粒子直接介导的方法(例如 Hiei et al.(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750；Ayres and Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13：219-239；Bommineni and Jauhar(1997)Maydica 42：107-120所述) 转移DNA。
转化叶绿体的方法为本领域所已知。见例如Svab et al.(1990)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：913-917；Svab and Maliga(1993)EMBO J.12：601-606所述。所述方 法依赖于基因枪输送含有选择标记的DNA并且通过同源重组使得所述 DNA靶向于质体基因组。此外，质体转化可以通过核编码的及质体指导的 RNA聚合酶的组织优选表达反式激活沉默的质体携带转基因而实现。这种 系统已经在McBride et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中 报道。
细菌细胞的转化是通过本领域已知的一些技术实现的，所述技术包括 但不限于电穿孔或者化学转化(见例如Ausubel，ed.(1994)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，Indianapolis，IN所述)。赋予 对毒性物质抗性的标记可用于从未转化的细胞(不含有或者不表达检测 DNA的那些细胞)中鉴别转化的细胞(含有及表达检测DNA的细胞)。
在本发明的一个方面中，本发明的核苷酸序列可用作标记以评定细菌 或植物细胞的转化。在这种方式中，转化是通过如上述监测氮利用效率评 定。
植物细胞的转化可以通过相似方式实现。“植物”是指完整植物或者植 物的组成部分包括植物器官(例如叶、茎干、根等)、种子、植物细胞、繁殖 体、胚和后代。植物细胞可以是分化的或者未分化的(例如愈伤组织、悬浮 培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。“转基因植物” 或者“转化的植物”或者“稳定转化的”植物或者细胞或者组织是指在植 物细胞中已经掺入或者整合了外源核酸序列或者DNA片段的植物。“稳定 转化”是指导入植物中的核苷酸构建体整合进植物的基因组中且能被植物 后代遗传。
已经转化的细胞可以根据常规方式生长为植物。见例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5：81-84所述。然后使这些植物生长，并且用相 同的转化植株或者不同的植株授粉，鉴别组成型表达希望的表型特征的所 得杂交体。生长两或多个世代以保证希望的表型特征的表达得以稳定保持 和遗传，然后收获种子以保证希望的表型特征的表达已经实现。以这种方 式，本发明提供了在其基因组中稳定掺入本发明的核苷酸构建体例如本发 明的表达盒的转化的种子(也称作“转基因种子”)。
通过调节氮利用增加植物产量的方法
本发明提供了增加植物产量的方法。所述方法包括将本发明揭示的氮 调节核苷酸序列导入植物或者植物细胞中，由此氮利用效率的增加相应于 植物产量的增加。如本文所定义，植物的“产量”是指由植物产生的生物 量的质量和/或数量。“生物量”是指任何测量的植物产物(例如植物的任何 组成部分，如种子、茎、根、谷粒、叶等)。生物量生产中的增加是测量的 植物产物的产量的任何改良。植物产量增加具有一些商业用途。例如，植 物叶生物量的增加可增加为人和动物消费的叶类植物的产量。此外，叶生 物量的增加可用于增加产生得自植物的药物或工业产品。产量的增加可包 括具有任何统计学意义的增加，包括但不限于与其中未导入本发明的调节 氮利用的核苷酸序列的植物的产量相比，所述植物的产量增加至少1％、至 少3％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、 至少100％或更高。
植物
本发明可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植 物。感兴趣的植物的例子包括但不限于玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、 十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、 大麦和油菜、芸苔属植物(Brassica sp.)、苜蓿、黑麦、小米、红花、花生、 甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、 番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、坚果、杏、燕麦、蔬菜、草(例如饲草、 草坪草或牧草)、观赏植物、果树以及针叶树。
蔬菜包括但不限于洋葱、番茄、莴苣、绿豆、利马豆、豌豆，以及Curcumis 属成员如黄瓜、甜瓜和香瓜。观赏植物包括但不限于杜鹃花、绣球花属植物、 芙蓉属植物、玫瑰、郁金香、水仙花、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优 选本发明的植物是农作物(例如玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花 科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、 油菜等)。
本发明特别适合单子叶植物家族的任何成员，包括但不限于玉米、水 稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、薯蓣、洋葱、香蕉、 椰子和椰枣(date)。
植物转化的评估
在将异源外源DNA导入植物细胞中之后，异源基因在植物基因组中的 转化或整合可通过各种方法证实，例如分析与整合的基因相关的核酸、蛋 白质和代谢物。
PCR分析是在植入土壤之前的早期阶段筛选转化的细胞、组织或芽中 掺入的核苷酸序列存在的一种快速方法(Sambrook and Russell(2001) Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。使用特异于感兴趣的基因或者农杆菌载体背 景等的寡核苷酸引物进行PCR。
植物转化可以通过基因组DNA的Southern印迹分析证实(Sambrook and Russell，2001，supra)。通常从转化体中提取总DNA，用合适的限制酶消 化，在琼脂糖凝胶中分级分离并转移至硝化纤维素或尼龙膜上。然后根据 标准技术将该膜或“印迹”用例如放射标记的32P靶DNA片段探查以证实 植物基因组中导入的基因的整合(Sambrook and Russell，2001，supra)。
在Northern分析中，根据本领域常用的标准方法从转化体的特定组织 中分离RNA，将其在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，印迹于尼龙滤膜上 (Sambrook and Russell，2001，supra)。然后根据本领域已知方法通过将所述 滤膜与衍生自本发明多核苷酸的放射性探针杂交以检测由本发明的核苷酸 序列编码的RNA的表达(Sambrook and Russell，2001，supra)。
可以对所述转基因植物进行Western印迹和生物化学测定以确定由氮 调节基因编码的蛋白质的存在情况，这通过标准方法(Sambrook and Russell， 2001，supra)使用结合所述氮调节蛋白质上存在的一或多个表位的抗体进 行。例如，通过本发明的方法产生的多克隆抗体可用于检测氮调节蛋白质 的存在。
抗体
本发明还包含用于本发明中的多肽或者其变体或片段的抗体。产生抗 体的方法为本领域所熟知(见例如Harlow and Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.； 美国专利No.4,196,265所述)。
实验
材料和方法
这个计划的大多数起始遗传材料以玉米表达序列标签或“EST”形式提 供，得自鉴别应答氮而被上调或下调的潜在基因的微阵列实验。所述微阵 列实验鉴别了可能用于转化的几百个候选物。虽然这些序列能预测应答氮 波动的基因转录，但是它们未提供对于应答氮水平而被调节的基因或者调 节氮水平的基因的明确鉴别。基于基因组选择标准筛选来自微阵列实验的 候选EST以分析并确定少量优选候选物随后用于如本说明书描述的转基因 表达中。首先检验进入这个计划的所有EST序列(即“计划基因(project gene)”)以鉴别可以编码应答植物氮水平的蛋白质的开放读框。在EST中典 型存在多个开放读框。最后，基于多重标准选择各个计划基因，所述标准 包括开放读框的大小，其中优先选择较长的开放读框，并推测翻译的基因 的功能，其中各个开放读框被翻译，然后进行BLAST搜索以鉴别蛋白质同 源物。在鉴别同源物的情况中，我们推断所述基因很可能编码具有相似功 能的蛋白质。这个信息用于评定基因是否编码与植物中氮同化作用相关的 蛋白质功能。
通过这种选择方法，从每个EST中选择个体基因靶。选自每个EST的 完整基因序列在下文实施例中揭示。EST序列之一(N-EST 77-A01)用作进入 计划的两个不同基因(N-EST77A和N-EST77B)以及一个其它EST(EST N-EST76-H12)的来源。我们发现可以对EST进行修饰以产生比未修饰的 EST中存在的开放读框长的开放读框。概括而言，三个开放读框组合产生 一个较长的基因(N-EST76A)。
在一些情况中，由微阵列实验提供的DNA样品用作所有随后的DNA 克隆步骤的原材料。在EST样品不合适的情况中，产生合成序列。N-EST76b 基因是购自Blue Heron Biotechnology，Inc.(Bothell，WA)的合成基因。每个 EST以及每个合成基因的基因序列通过DNA测序证实，之后亚克隆每个基 因以进行蛋白质过表达。
蛋白质过表达和纯化
将针对计划选择的每个基因均亚克隆进促进蛋白质在大肠杆菌(E.coli) 中过表达的表达载体中。进行蛋白质过表达以使得各个蛋白质得以纯化。 纯化的蛋白质可用于在一对兔中产生每种蛋白质的多克隆抗体。最后，所 述多克隆抗体可用于检测转基因植物中靶蛋白质的存在。
使用本领域已知的方法，将每个计划基因均亚克隆进大肠杆菌表达载 体pRSF1b(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中。所得克隆通过DNA测 序证实并用于诱导每种蛋白质在大肠杆菌中的表达。然后如本领域所已知 的那样使用钴亲和树脂(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA)纯化 表达的His标记的蛋白质。
植物转化
将各自的计划基因亚克隆进载体中以进行玉米的农杆菌介导的转化。 在载体构建和农杆菌转化之后，通过本领域已知的Southern印迹方法证实 载体。然后使通过这些检测的阳性农杆菌菌株在固体培养基上生长，产生 细胞计数以进行大规模转化实验。
如下实验描述了植物载体构建与植物转化的方法。
进行植物转化的载体的构建
通过PCR从玉米EST序列或者合成基因中扩增每个计划基因的开放读 框(ORF)。在PCR期间在ORF的每个末端加入限制位点(例如BamH I和Asc I)。此外，在基因的起始密码子的立即5’加入核苷酸序列ACC以增加翻译 效率(Kozak(1987)Nucleic Acids Research 15：8125-8148；Joshi(1987)Nucleic Acids Research 15：6643-6653)。将PCR产物亚克隆进中间载体(例如pRSF-1b) 中并使用本领域熟知的技术测序以保证在PCR期间未导入突变。含有计划 基因的质粒用例如BamH I和Pst I消化并分离和纯化含有完整ORF的片段。
然后将含有计划ORF的纯化的DNA片段亚克隆进质粒如pSB11(Japan tobacco，Inc.)中，例如在BamH I和Pst I位点以完成植物表达载体。所述植 物表达载体含有例如磨擦草属(Tripsacum)遍在蛋白启动子、TripPro5启动子 (2006年3月16日申请的美国专利申请系列No.11/377,318，在此并入本文 作参考)以及PinII终止子(An et al.(1989)The Plant Cell 1：115-122)形成最终 的质粒，在此称作pSB11-1A。pSB11-1A是这样组成的，即含有例如启动 子-NUE基因-终止子构建体的DNA片段可以由适当的限制酶切割并且也 用于例如通过气雾束注射(aerosol beam injection)转化进植物中。pSB11-1A 的结构通过限制消化和凝胶电泳以及通过对各种克隆连接处进行测序而证 实。
使用本领域熟知的三亲株杂交(triparental mating)方法将质粒转移至还 携带质粒pSB1(Japan tobacco，Inc.)的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 菌株LBA4404中，并且铺板于含有抗生素的培养基上。质粒pSB11-1A携 带壮观霉素抗性但是是窄谱宿主范围的质粒且不能在农杆菌中复制。当通 过同源重组将pSB11-1A整合进广谱宿主范围的质粒pSB1中时产生抗生素 抗性集落。所得共合体产物通过Southern杂交证实。携带该共合体的农杆 菌菌株可用于转化植物，例如通过PureIntro方法(Japan tobacco，Inc.)转化。
通过农杆菌介导的转化方法转化植物
在授粉8-12天后收集耳穗(ear)。从耳穗中分离胚，并将大小为 0.8-1.5mm的那些胚用于转化。将胚盾片侧向上铺板于合适的保温培养基 中，在25℃于黑暗中保温过夜。然而，非必须将所述胚保温过夜。将胚与 含有适合Ti质粒介导的转移的载体的农杆菌菌株接触5-10分钟，然后铺板 于共培养基上培养3天(于黑暗中25℃)。在共培养之后，将外植体转移至 恢复期培养基(recovery period media)中培养5天(于黑暗中25℃)。根据利用 的特定选择方法的性质和特性将外植体在选择培养基中保温直至8周。在 选择期之后，将所得愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观测到成熟体 细胞胚形成。然后将所得成熟体细胞胚置于低光照条件下，开始本领域已 知的再生过程。使所得芽在生根培养基上生根，并将所得植物转移至培育 罐(nursery pot)中并且使其增殖为转基因植物。此时，分离叶样品并且通过 PCR证实感兴趣基因的存在。
以此方式产生的所有植物均生长至结种并与分离自Hi-II植物(Iowa State University，Ames，Iowa)的花粉杂交。受精的植物生长直至成熟。从各 个植物中收获成熟种子并且如果需要则保存以在T1代进行进一步检测。
转基因植物中的蛋白质表达
代表性的转基因玉米转化事件(transgenic maize event)中的蛋白质表 达通过Western印迹评估。简言之，在温室中生长4周后取叶样品并立即在 干冰上冷冻。提取总蛋白质(P-PER植物蛋白质提取试剂盒，Pierce)，通过 Bradford测定法确定蛋白质浓度。将各个植物蛋白质样品通过电泳分离，转 移至硝化纤维素上，使用本领域已知的方法将固定的蛋白质与兔多克隆抗 血清接触。利用ECL Plus Western印迹检测系统(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway，NJ)观测结合的抗体复合物。
氮测定方法
在氮测定的准备中，从组织培养转移至温室2或4周后(对于T1植物为发 芽后4周)的植物中切下叶。将该材料在干冰上速冻，在加工之前于-80℃贮 存。
硝酸盐
将50mg叶材料(鲜重，无中脉)冻干以进行干重测定。然后将脱水的叶 组织在存在新鲜Milli Q水的条件下使用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不锈 钢珠研磨。将研磨的叶组织通过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤并注射 进Agilent 1100 HPLC中，以1.8mM碳酸钠和1.7mM碳酸氢钠的混合物的流动 相以1.5ml/分钟运行。使用配有保护柱的IonPac AS9-SC离子层析柱分离离 子。以再循环模式使用具有自生式抑制器(self-regenerating suppressor)的 阴离子自抑制电导率(anion auto-suppressed conductivity)进行分析。将样 品与每个样品运行中包含的内部标准对比。
铵
将50mg叶材料(鲜重，无中脉)在存在60％甲醇的条件下使用 MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不锈钢珠研磨。将经研磨的叶组织通过0.45μm 聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤并注射进配有3.3m、63℃不锈钢线圈和冷却的 自动取样器的Agilent 1100 HPLC中。流动相含有3mM邻苯二醛(OPA)、 10mMβ-巯基乙醇和100mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)，以0.4ml/分钟运行。荧光 (激发410nm，发射470nm)和二极管阵列检测(410nm)用于量化叶提取物中的 铵。每个运行中均包含内部铵标准以进行对比。
通过HPLC分析氨基酸
将50mg叶材料(鲜重，无中脉)冻干以进行干重测定。然后将脱水的叶 组织在存在新鲜Milli Q水的条件下用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不锈钢 珠研磨。将经研磨的叶组织通过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤并注射 进Agilent 1100 HPLC中，使用配有保护柱的Zorbax Eclipse AAA、4.6×75 mm反相柱。冷却的自动取样器用于混合叶提取物与400mM硼酸盐缓冲液 (pH 10.2)、在甲醇中的1％邻苯二醛/1％3-巯基丙酸，然后在注射之前将其 用水稀释。注射程序的详细描述如下：将0.5μl样品加入2.5μl硼酸盐缓冲液 中，以最大速度混合两次。在保持0.5分钟后，将针置于水中以从针尖除去 残余物，然后加入0.5μl OPA溶液。将此组合的3.5μl溶液以最大速度混合六 次。将针再次置于水中漂洗针尖，然后置于含有新鲜水的小瓶中。接着向 样品混合物中加入32μl Milli Q水，并将18μl以最大速度混合两次。然后将 样品溶液注射进HPLC中，在5分钟内泵运行2ml/min流动相的具有0-26％乙 腈/甲醇/水(45∶45∶10)(B)梯度的40mM Na2HPO4(pH7.8)(A)，随后是2分钟的 100％保持B，然后是2分钟的100％A。天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬 氨酸的量化通过二极管阵列检测法(328-348nm)和荧光检测法(激发340nm， 发射450nm)进行。将样品与每个样品运行中包含的天冬酰胺、谷氨酰胺、 谷氨酸和天冬氨酸的内部标准对比。
总氨基酸
将50mg叶材料(鲜重，无中脉)冻干以进行干重测定。然后将脱水的叶 组织在存在新鲜Milli Q水的条件下使用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不锈 钢珠研磨。将经研磨的叶组织通过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤。叶 提取物在水中稀释，加入茚三酮试剂溶液(在DMSO和乙酸锂缓冲液中的茚 三酮和还原茚三酮，pH5.2)。然后将样品用厚箔带密封，在90℃加热10分钟， 精确冷却2分钟，在590nm在分光光度计中读数。将数值与每个样品分析期 间包含的内部标准对比。
总蛋白质
将50mg叶材料(鲜重，无中脉)冻干以进行干重测定。然后将脱水的叶 组织在存在新鲜Milli Q水的条件下使用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不锈 钢珠研磨。将经研磨的叶组织通过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤。向 在水中稀释的叶样品中加入Bio-Rad蛋白质染料，进行Bradford蛋白质测定， 在595nm在分光光度计中读数，并且与测定中包含的内部蛋白质标准对比。
叶绿素
将50mg叶材料(鲜重，无中脉)在存在60％甲醇的条件下使用 MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不锈钢珠研磨。将经研磨的叶组织通过1.0μm A/B玻璃纤维滤膜过滤，将100μl提取物置于Corning 3370平底微量培养板 中，在分光光度计中读数，空白孔含等体积的60％甲醇。使用SoftMax Pro 软件将光路长换成1cm。使用Porra，R.J.Photosynthesis Research，73：149-156， 2002所述等式计算叶绿素含量。
实施例1：候选EST的鉴别
每个候选氮调节基因的核苷酸序列信息在申请人爱荷华州立大学Dr. Pat Schnable指导下进行的差别氮微阵列实验中产生。这个微阵列实验用做 初始筛选以选择与氮条件也许相关的EST亚群(sub-set)。
从在微阵列中示出一些差异的大量EST序列中(具有3’和5’数据的136 个序列)在生物信息学分析之后进一步选择。这个分析包括核查International Nucleotide Sequence数据库(位于NCBI)中的核苷酸序列相似性，核查蛋白 质数据库如NCBI和Swisspro中预测的蛋白质相似性，研究关于已知或预 测功能的信息以及核查专利局的核苷酸和蛋白质数据库。使用这些分析结 果以及支持性关键信息选择EST亚群在玉米中进行与氮利用效率相关的转 基因过表达。对于每个EST序列，鉴别了开放读框并翻译为氨基酸序列。 候选的氮调节序列列于表1中。
在植物中过表达氮调节序列的载体构建
随后将每个候选氮调节EST的开放读框导入植物表达载体中。使用本领 域熟知的方法，应用两个不同的选择标记系统，使得可以在存在选择剂的 条件下选择转化的植物。
用氮调节基因转化玉米
所述植物载体可用于植物转化实验，通过使用上述方法将氮调节基因 导入玉米基因组中。
表1：氮调节序列
  EST名称  EST序列  (SEQ ID NO：) 开放读框 (SEQ ID NO：)  蛋白质序列 (SEQ ID NO：)   pAX号   N-EST213  1 2  3   pAX2411   pAX2410   N-EST45-C08 4  5   pAX3404   N-EST77-A1  6 7  8   pAX3405   N-EST77-B1  6 9  10   pAX3406   N-EST61-A10 11  12   pAX2422   N-EST88-H03 13  14   pAX2425   N-EST15 15  16   pAX2437   N-EST42-B12 17  18   pAX2435   N-EST76a2  19 22  23   pAX2433   N-EST76b2  19 24  25   pAX2431   N-EST31-A10 26  27   pAX2441   N-EST43 28  29   pAX2443   N-EST264 30  31   pAX2437   N-EST28 32  33   pAX2439   N-EST13A-A08 34  35   pAX2454   N-EST13E-E07 36  37   pAX2457   N-EST55C-C10 38  39   pAX2460
1见实施例2
2见实施例3
实施例2：两种玉米蛋白N-EST 77A、N-EST 77B
本发明描述了赋予转基因玉米(Zea mays)增强的氮利用的玉米基因序 列(ESTN-EST77-A01)的应用。两个开放读框与高活性的植物启动子和末端 连接以在整合进玉米基因组中之后表达每种蛋白质。异位表达的蛋白质将 增强玉米植物利用可利用氮的能力。
生物信息学分析表明与NCBI数据库中其它序列没有显著的序列同源 性。一部分序列示出与其它物种而不是玉米中的CCAAT-结合转录因子具有 一些同源性。当核苷酸序列是从微阵列实验中获得的时也有一预测的蛋白 质序列。预测的蛋白质在本文称作N-EST77A。核苷酸序列检验表明所述核 苷酸可以编码另一种蛋白质(随后得以证实)，该蛋白质序列被称作 N-EST77B。这第二个蛋白质不是根据微阵列实验获得的任何信息预测的。
为了表达N-EST 77B，将第一个氨基酸由亮氨酸改变为甲硫氨酸以改 良蛋白质表达。
实施例3：玉米蛋白N-EST76
这个实施例描述了赋予转基因玉米(Zea mays)增强的氮利用的玉米基 因序列(EST N-EST76-H12)的应用。这个特殊的EST具有与所谓“bZIP”类 转录因子同源的部分核苷酸序列。对于本发明，在植物中过表达两个单独 的基因构建体。一个构建体(N-EST76a)含有修饰形式的N-EST76-H12EST 以使得较长的开放读框在玉米中被表达。当与天然EST中的基因序列相比 时，这个修饰的基因含有3个取代。还产生第二个基因，其在基因的3’末 端加入碱性区亮氨酸拉链序列。所得基因被称作“N-EST76b”。
全长克隆序列看起来含有编码蛋白质的两个不同区域，108个氨基酸的 蛋白质I和122个氨基酸的蛋白质II。然而，意识到如果全长克隆未精确测 序以及在该克隆中间测序中产生错误，则移码也许人为产生不应在此的一 个新的起始密码子，因此提示两个区域仅有一个较长区域。为了适应这种 可能性，假定存在两个较短区域及存在一个较长区域这两种情况进行序列 分析。简而言之，核苷酸序列搜索报告的结果表明“I”序列与来自水稻的 假定蛋白具有一些同源性(基因组DNA来自水稻基因组程序)，与一些推定 的bZIP TF具有较低同源性。核苷酸专利数据库搜索示出序列I与认为是转 录因子的序列具有一些同源性(E＝2e-06)(例如WO03007699)。来自微阵列 测定的蛋白质I的推测的氨基酸序列用于搜索数据库，发现无明显hits。然 而，当使用GenBank工具或者ExPasy工具再翻译核苷酸序列I时，发现推 测的蛋白质序列具有：(1)对GenBank蛋白质数据库的hits(例如E＝9e-09)， 提示的功能是bZIP转录因子；(2)对专利蛋白质数据库的hits(例如 E＝7e-05)，功能与bZIP转录因子(特别是来自水稻的)相关或者与ABA 应答元件结合蛋白(主要来自拟南芥属(Arabidopsis)，例如美国专利No. 6,245,905所述)相关。
DNA序列的证实
对含有N-EST76-H12的DNA构建体进行测序以证实由微阵列测定提 供的序列。这个测序揭示了在SEQ ID NO：19第1121位的一个单核苷酸取 代，其中“G”代替“C”。这个取代位于针对N-EST76描述的开放读框中， 导致蛋白质序列中谷氨酰胺被取代为谷氨酸。完整N-EST76-H12EST的正 确DNA序列示于SEQ ID NO：19。
产生N-EST76a和N-EST76b的克隆策略
N-EST76-H12中DNA序列含有3个开放读框，其由两个终止密码子和 一个移码分隔。应用的克隆策略是消除终止密码子和移码以产生与已知 bZIP蛋白更相似且因此当表达时更可能正确发挥功能的连续开放读框。此 外，bZIP蛋白在该蛋白质的C末端典型含有一个碱性区亮氨酸拉链。 N-EST76-H12不含有这个结构域。因此产生第二个蛋白质，其是在N-EST76 蛋白的末端添加一个碱性区亮氨酸拉链结构域。
N-EST76-H12中终止密码子和移码的消除
对于这个实施例，修饰EST N-EST76-H12(SEQ ID NO：19)描述的玉米 序列以产生与全长bZIP蛋白更具同源性的较长的开放读框。这需要对 N-EST76序列进行3处修饰：
在核苷酸444位胸腺嘧啶由胞嘧啶取代，
在核苷酸673位腺嘌呤由鸟嘌呤取代，
在核苷酸722位之后加入鸟嘌呤。
前两个取代除去N-EST76 EST读框3中存在的一对终止密码子。最后 的改变(在核苷酸722位之后加入)导入一个移码，使得读框3与读框2连接 产生与全长bZIP蛋白更同源的读框。所述DNA序列示于SEQ ID NO：22， 从所得构建体中表达的蛋白质被称作“N-EST76a”(SEQ ID NO：23)。
为N-EST76a添加碱性区亮氨酸拉链
此外，我们产生了第二个基因，其中在N-EST76a的3’末端添加编码碱 性区亮氨酸拉链的DNA片段。这个拉链结构域在N-EST76的EST中不存 在，在此添加以产生N-EST76-衍生蛋白质，其与文献中描述的bZIP蛋白 更相似。因此，产生除了在C末端具有添加的拉链结构域之外与N-EST76a 均相同的蛋白质。这个新的DNA序列示于SEQ ID NO：24，所述蛋白质被 称作“N-EST76b”(SEQ ID NO：25)。
这些克隆策略在下文概述。
为计划选择bZIP结构域
为此计划通过使用blastx搜索算法选择与翻译的N-EST76a序列具有高 度同源性的蛋白质进行bZIP结构域的选择。这种方法可以鉴别与N-EST76a 蛋白具有显著同源性的水稻bZIP蛋白。这种水稻bZIP蛋白(登记号 BAD17130)的蛋白质序列在本文示于SEQ ID NO：20，具有由SEQ ID NO： 20的第275-357位氨基酸表示的bZIP结构域。
编码完整水稻bZIP蛋白的DNA序列示于SEQ ID NO：21，编码碱性 区亮氨酸拉链的DNA片段由SEQ ID NO：21的第826-1074位核苷酸表示。 经玉米密码子使用优化这个bZIP DNA序列，然后加入N-EST76a基因序列 的3’末端(N-EST76-H12中第1130位核苷酸)，产生N-EST76b基因序列(SEQ ID NO：24)。
实施例4：转基因玉米转化事件的产生以及表达N-EST76a和N-EST76b的 玉米植物中的氮同化作用
如先前的实施例所述，构建植物转化载体pAX2433和pAX2431以指导 N-EST76a和N-EST76b蛋白在玉米中过表达。
将每个载体通过电穿孔导入根癌农杆菌菌株中。这个菌株还含有载体 pSB1，使得pSB1与pAX2433或pAX2431在体内重组产生可以指导N-EST76a 或N-EST76b盒插入玉米基因组中的载体。每种重组载体(pAG2433、 pAG2431)的形成通过农杆菌菌株的Southern印迹杂交证实。
使用本领域已知的方法将含有pAG2433或pAG2431的农杆菌菌株与玉 米胚共培养。在共培养之后，使胚在选择培养基上生长。然后将在存在选 择剂的条件下存活的选择性生长的个体移至再生培养基中，使用本领域已 知方法使其生长为小植物阶段。
表达N-EST76a、N-EST76b的玉米植物中的氮同化作用
氮测定，T0转化事件
本领域已经揭示了量化植物中氮中间体的一系列测定法。在此利用这 些测定法分析共24株含有N-EST76a基因的转基因植物及6株含有 N-EST76b基因的植物。在温室土壤中生长4周后从每株植物中取样。这些 植物看起来表型正常。对叶样品进行处理以确定其硝酸盐、天冬酰胺、谷 氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、铵、总氨基酸、叶绿素和总蛋白质水平。这 个分析中还包含用仅含选择标记的构建体(无N-EST76a或N-EST76b)转化 的植物。这些植物同样在4周取样，称作“非GOI”植物。对这两种类型 的植物进行的氮测定结果示于下表2。


实施例5：N-EST213抗体的产生
产生合成肽以匹配N-EST213的N末端片段(SEQ ID NO.3的前20个氨 基酸)和N-EST213的C末端片段(SEQ ID NO.3的后20个氨基酸)。使用本领 域已知的方法用这些肽对兔进行免疫，以产生N-EST213肽的多克隆抗体。
实施例6：使用N-EST213基因产生转基因玉米转化事件以及表达N-EST213 的玉米植物(T0植物)中的氮同化作用
过表达N-EST213蛋白的转基因玉米植物的产生
如先前实施例所述构建植物转化载体pAX2411以指导N-EST213蛋白在 玉米中的过表达。将pAX2411载体通过电穿孔导入根癌农杆菌菌株中。这个 菌株还含有载体pSB1，使得pSB1与pAX2411在体内重组产生可指导 N-EST213盒插入玉米基因组中的载体。这个重组载体(pAG2411)的形成通过 农杆菌菌株的Southern印迹杂交证实。
使用本领域已知的方法将含有pAG2411的农杆菌菌株与玉米胚共培养。 然后将在存在选择剂的条件下存活的选择性生长的个体转化事件移至再生培 养基中并使用本领域已知方法使其生长为小植物阶段。
令人惊奇地发现用N-EST213 DNA转化的一些植物展示与众不同的表型。 这些植物与未转化的植物相比明显较矮，沿着茎干存在“节点压缩(nodal compression)”。这项研究中的20株植物中的7株植物呈现这种“矮”表型。另 外8株植物记录为“中等”高度，另外4株植物高度记录为“高”。较矮的植 物生长雄花穗(tassel)和耳穗，但是这两个器官有时较小，而且外壳有时脱色或 者未完全形成。
表达N-EST213的玉米植物中的氮同化作用
本领域已经揭示了量化植物中氮中间体的一系列测定法。这些测定法在 此用于分析含有N-EST213基因的共23株转基因植物。在温室的土壤中生长 4周后，从每株植物中取样。对这些叶样品进行处理以确定其硝酸盐、天冬酰 胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、铵、总氨基酸、叶绿素和总蛋白质水平。 这些氮测定结果示于下表3中。


实施例7：转基因玉米转化事件的产生及表达N-EST45的玉米植物(T0和T1 植物)中的氮同化作用
过表达N-EST45蛋白的转基因玉米植物的产生
如先前实施例所述构建植物转化载体pAX3404以指导N-EST45蛋白在玉 米中的过表达。
将pAX3404载体通过电穿孔导入根癌农杆菌菌株中。这个菌株还含有载 体pSB1，使得pSB1与pAX3404在体内重组产生可以指导N-EST45盒插入 玉米基因组中的载体。这个重组载体(pAG3404)的形成通过农杆菌菌株的 Southern印迹杂交证实。
使用本领域已知的方法将含有pAG3404的农杆菌菌株与玉米胚共培养。 在共培养之后使胚在选择培养基中生长。然后将在存在选择剂的条件下存活 的选择性生长的个体转化事件转移至再生培养基中，使用本领域已知方法使 其生长为小植物阶段。这些植物看起来表型正常。
表达N-EST45的玉米植物中的氮同化作用
氮测定，T0转化事件
本领域已经揭示了量化植物中氮中间体的一系列测定法。这些测定法在 此用于分析含有N-EST45基因的共16株转基因植物。在温室的土壤中生长4 周后从每株植物中取样。对这些叶样品进行处理以确定其硝酸盐、天冬酰胺、 谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、铵、总氨基酸、叶绿素和总蛋白质水平。分 析中还包含用仅含有选择标记(无N-EST45)的构建体转化的植物。这些植物同 样在4周后取样并被称作“非GOI”植物。对这两种类型植物进行的氮测定 结果示于下表5中。

氮测定，T1转化事件
检验T0 N-EST45玉米转化事件中存在的氮水平并且选择一些植物鉴 定为T1植物。选择转化事件(植物#)3755、3759、3760、3765、3773和3781。 选择非-GOI转化事件3822和3828作为阴性对照。为了产生T1转化事件， 从每株T0转化事件中收集花粉并且对Hi-II(A188x B73)植物的耳穗授粉。 在种子形成并收获种子之后，使这些干燥的杂交种子在土壤中发芽。在种 植大约2周后鉴别含有N-EST45基因(或者非GOI植物中的选择标记基因) 的分离种(segregant)并使其生长直至4周。这些植物看起来表型正常。在第 4周从这些转化事件中取叶样品并进行与针对T0植物相同的氮检测方案 (硝酸盐、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、铵、总氨基酸、叶绿 素和总蛋白质)。这些氮测定的结果示于表6。

实施例8：转基因玉米转化事件的产生以及表达N-EST61的玉米植物中的 氮同化作用
如先前实施例所述构建植物转化载体pAX2422以指导N-EST61蛋白在 玉米中的过表达。
将pAX2422载体通过电穿孔导入根癌农杆菌菌株中。这个菌株还含有 载体pSB1，使得pSB1与pAX2422在体内重组产生可以指导N-EST61盒 插入玉米基因组中的载体。这个重组载体(pAG2422)的形成通过农杆菌菌株 的Southern印迹杂交证实。
使用本领域已知的方法将含有pAG2422的农杆菌菌株与玉米胚共培 养。在共培养之后，使胚在选择培养基中生长。然后将在存在选择剂的条 件下存活的选择性生长的个体转化事件转移至再生培养基中，使用本领域 已知方法使其生长为小植物阶段。这些植物看起来表型正常。
表达N-EST61的玉米植物中的氮同化作用
氮测定，T0转化事件
本领域已经揭示了量化植物中氮中间体的一系列测定法。这些测定法 在此用于分析含有N-EST61基因的共8株转基因植物。在温室的土壤中生 长4周后从每株植物中取样。对这些叶样品进行处理以确定其硝酸盐、天 冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、铵、总氨基酸、叶绿素和总蛋白 质水平。分析中还包含用仅含有选择标记(无N-EST61)的构建体转化的植 物。这些植物同样在4周后取样并被称作“非GOI”植物。对这两种类型 植物进行的氮测定结果示于下表7中。

实施例9：转基因玉米转化事件的产生以及表达N-EST15的玉米植物中的 氮同化作用
如先前实施例所述构建植物转化载体pAX2437以指导N-EST15蛋白在 玉米中的过表达。
将pAX2437载体通过电穿孔导入根癌农杆菌菌株中。这个菌株还含有 载体pSB1，使得pSB1与pAX2437在体内重组产生可以指导N-EST15盒 插入玉米基因组中的载体。这个重组载体(pAG2437)的形成通过农杆菌菌株 的Southern印迹杂交证实。
使用本领域已知的方法将含有pAG2437的农杆菌菌株与玉米胚共培 养。在共培养之后，使胚在选择培养基中生长。然后将在存在选择剂的条 件下存活的选择性生长的个体转化事件转移至再生培养基中，使用本领域 已知方法使其生长为小植物阶段。这些植物看起来表型正常。
表达N-EST15的玉米植物中的氮同化作用
氮测定，T0转化事件
本领域已经揭示了量化植物中氮中间体的一系列测定法。这些测定法 在此用于分析含有N-EST15基因的共8株转基因植物。在温室的土壤中生 长4周后从每株植物中取样。对这些叶样品进行处理以确定其硝酸盐、天 冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、铵、总氨基酸、叶绿素和总蛋白 质水平。分析中还包含用仅含有选择标记(无N-EST15)的构建体转化的植 物。这些植物同样在4周后取样并被称作“非GOI”植物。对这两种类型 植物进行的氮测定结果示于下表8中。

实施例9：转基因玉米转化事件的产生以及表达N-EST28的玉米植物中的 氮同化作用
如先前实施例所述构建植物转化载体pAX2439以指导N-EST28蛋白在 玉米中的过表达。
将pAX2439载体通过电穿孔导入根癌农杆菌菌株中。这个菌株还含有 载体pSB1，使得pSB1与pAX2439在体内重组产生可以指导N-EST28盒 插入玉米基因组中的载体。这个重组载体(pAG2439)的形成通过农杆菌菌株 的Southern印迹杂交证实。
使用本领域已知的方法将含有pAG2439的农杆菌菌株与玉米胚共培 养。在共培养之后使胚在选择培养基中生长。然后将在存在选择剂的条件 下存活的选择性生长的个体转化事件移至再生培养基中，使用本领域已知 方法使其生长为小植物阶段。这些植物看起来表型正常。
表达N-EST28的玉米植物中的氮同化作用
氮测定，T0转化事件
本领域已经揭示了量化植物中氮中间体的一系列测定法。这些测定法 在此用于分析含有N-EST28基因的共5株转基因植物。在温室的土壤中生 长4周后从每株植物中取样。对这些叶样品进行处理以确定其硝酸盐、天 冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、铵、总氨基酸、叶绿素和总蛋白 质水平。分析中还包含用仅含有选择标记(无N-EST28)的构建体转化的植 物。这些植物同样在4周后取样并被称作“非GOI”植物。对这两种类型 植物进行的氮测定结果示于下表9中。

实施例11：转基因玉米转化事件的产生以及表达N-EST88、N-EST42、 N-EST31、N-EST264的玉米植物中的氮同化作用
如先前实施例所述构建植物转化载体pAX2424(N-EST88)、pAX2435 (N-EST42)、pAX2441(N-EST31)和pAX2437(N-EST264)以指导N-EST88、 N-EST42、N-EST31和N-EST264蛋白在玉米中的过表达。
将每种载体通过电穿孔导入根癌农杆菌菌株中。这个菌株还含有载体 pSB1，使得pSB1与pAX2424、pAX2435、pAX2441或pAX2437在体内重 组产生可以指导N-EST28盒插入玉米基因组中的载体。这些重组载体 (pAG2424、pAG2435、pAG2441或pAG2437)的形成通过农杆菌菌株的 Southern印迹杂交证实。
使用本领域已知的方法将含有pAG2424、pAG2435、pAG2441或 pAG2437的农杆菌菌株与玉米胚共培养。在共培养之后使胚在选择培养基 中生长。然后将在存在选择剂的条件下存活的选择性生长的个体转化事件 移至再生培养基中，使用本领域已知方法使其生长为小植物阶段。这些植 物看起来表型正常。
实施例12-指导N-EST43、N-EST13A、N-EST13E或N-EST55C蛋白在转 基因玉米转化事件中过表达的质粒的产生
如先前实施例所述构建植物转化载体pAX2443(N-EST43)，pAX2454 (N-EST13A)，pAX2457(N-EST13E)和pAX2460(N-EST55C)以指导N-EST43， N-EST13A，N-EST13E或N-EST55C蛋白在玉米中的过表达。
将每种载体通过电穿孔导入根癌农杆菌菌株中。这个菌株还含有载体 pSB1，使得pSB1与pAX2443、pAX2454、pAX2457或pAX2460在体内重 组产生可以指导N-EST43、N-EST13A、N-EST13E或N-EST55C盒插入玉 米基因组中的载体。这些重组载体(pAG2443，pAG2454，pAG2457或 pAG2460)的形成通过农杆菌菌株的Southern印迹杂交证实。
前文的描述和图表包含本发明举例的实施方案。本文描述的实施方案 和方法基于本领域技术人员的能力、经验和优选权而可以改变。以一定顺 序列出的方法步骤对于所述方法的步骤的顺序不构成任何限制。前文的描 述和图表只是解释和例证了本发明，本发明非限于此。本领域技术人员在 不偏离本发明范围的条件下可以对本发明进行修改和改动。
序列表
SEQ ID NO：1
TCGACTGGAGCACGAGGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAAATCACCTAGCTAGAAAGGAGAGCACC
GAGCGCTGCACCACTACTGCTGATATGAGCACCTGAACCTTCTGGGCAACCACATCGTCCCTGCCCCTGAT
CATCCGCAGCAGCCATGGCGCAGCAGCAGGAGAAGAAGCAGCAGCAGAGGGGGAAGCTGCAGAGGGTGCTA
AGGGAGCAGAAGGCTCGGCTCTACATCATCCGCCGATGCGCGTCATGCTCCTCTGCTGGAGTGACTGATCC
ATCTCAAGCATGCATGATAAACCTGTGCTCTTTTTTTTTCCTTCTGTTTTTTCCCCTCTTTTTCCCATCCT
TTTCACCTTGCCACTTTGGTGGGCG
SEQ ID NO：2
ATGGCGCAGCAGCAGGAGAAGAAGCAGCAGCAGAGGGGGAAGCTGCAGAGGGTGCTAAGGGAGCAGAAGGC
TCGGCTCTACATCATCCGCCGATGCGCGTCATGCTCCTCTGCTGGAGTGACTGA
SEQ ID NO：3
MAQQQEKKQQQRGKLQRVLREQKARLYIIRRCVVMLLCWSD
SEQ ID NO.：4
ATGTGCATTGCTGCATGGATTTGGCAGGCTCACCCTGTGCACCAACTCCTCCTGCTTCTCAACAGAGATGA
GTTCCACAGCAGGCCTACAAAAGCAGTAGGATGGTGGGGTGAAGGCTCAAAGAAGATCCTTGGTGGCAGGG
ATGTGCTTGGTGGAGGAACATGGATGGGGTGCACCAAGGATGGAAGGCTTGCCTTCCTGACCAATGTGCTT
GAACCAGATGCCATGCCCGGTGCACGGACTAGGGGAGATCTGCCTCTCAAATTCCTGCAGAGCAACAAGAG
CCCACTCGAAGTTGCAACTGAAGTGGCAGAAGAAGCTGATGAATACAATGGCTTCAACCTCATACTAGCTG
ATCTAACAACAAATATCATGGTTTATGTGTCAAACCGGCCTAAGGGTCAGCCTGCAACAATTCAACTCGTG
TCACCAGGACTCCATGTGCTGTCCAATGCAAGGCTAGATAGCCCTTGGCAGAAGGCAATTCTCCTCGGTAA
AAACTTCAGGGAGCTTCTTAGGGAGCATGGTGCTGATGAGGTTGAAGTGAAGGATATAGTTGAGAGGCTAA
TGACTGACACCACAAAGGCTGACAAAGATAGACTGCCAAACACTGGTTGTGATCCCAACTGGGAGCATGGT
CTGAGCTCCATCTTCATTGAGGTGCAAACTGACCAAGGGCCCTATGGGACACGGAGCACAGCCGTTTTATC
AGTGAACTATGATGGCGAAGCTAGCTTGTACGAGAAGTATCTTGAGAGTGGTATATGGAAGGATCACACAG
TGAGTTACCAGATAGAGTAG
SEQ ID NO：5
MCIAAWIWQA HPVHQLLLLL NRDEFHSRPT KAVGWWGEGS KKILGGRDVL GGGTWMGCTK
DGRLAFLTNV LEPDAMPGAR TRGDLPLKFL QSNKSPLEVA TEVAEEADEY NGFNLILADL
TTNIMVYVSN RPKGQPATIQ LVSPGLHVLS NARLDSPWQK AILLGKNFRE LLREHGADEV
EVKDIVERLM TDTTKADKDR LPNTGCDPNW EHGLSSIFIE VQTDQGPYGT RSTAVLSVNY
DGEASLYEKY LESGIWKDHT VSYQIE
SEQ ID NO：6
ATTCCCGTCTTACCTAGCGCTAGGGTTAGTACGCGTCCACGGCGACGACCTCTGCGCGGAGTGTGCTCCGA
TTGGCTGGCCTCCTCGATCCTCCTTCCCGCGAACGCACGCGCGCGCGAGGGAGAGGTTGAGACTTGAGAGA
TAGACGAAAGACGAAACAAGGGAAGGAGACGCCGTGCTCGCCTATTGGCCGCCGCCTCCGCTCCTTCGCGC
CCAATGGCTTCTGCAGCATATCAATATCATGCAGCATAGCAGTACTCAGACCCTTACTACGCAGGCGTTGT
TGCTCCCTATGGAAGTCAAGATGTGTGTCCGAGGAGCCTGTCTATGTGAACGCCAAGCAGTACCGCGGCAT
TCTAAGACGGCGGCAGTCACGTGCCAAGGCCGAGCTTGAGAGAAAGCGCTGGTCAAAGCAAGAAAGCCGTA
TCTTCACGAGTCCCCGTCATCAGCACGCGATGACGAGGAGGGCGAGAGGGAACGGTGGACGCTTCCTAAAC
ACGAAGAAGAGTGACCGTGTCCCTCCTGATGACTTGATACAGCTACGACGACACAACGAGGCTTGAAGAGG
TAGCGGTCTGGCTGGCATCCTAGAGCAGCGGTTTCTGTCCACAGGCACGTGCATCTGAGACCGGATCCGTA
GCTCCACTCCACAGCATATGCGCAGCCCATCCATCTCGTGCACACTTG
SEQ ID NO：7
ATGCAGCATAGCAGTACTCAGACCCTTACTACGCAGGCGTTGTTGCTCCCTATGGAAGTCAAGATGTGTGT
CCGAGGAGCCTGTCTATGTGAACGCCAAGCAGTACCGCGGCATTCTAAGACGGCGGCAGTCACGTGCCAAG
GCCGAGCTTGA
SEQ ID NO：8
MQHSSTQTLT TQALLLPMEV KMCVRGACLC ERQAVPRHSK TAAVTCQGRA
SEQ ID NO：9
TTGAGAGATAGACGAAAGACGAAACAAGGGAAGGAGACGCCGTGCTCGCCTATTGGCCGCCGCCTCCGCTC
CTTCGCGCCCAATGGCTTCTGCAGCATATCAATATCATGCAGCATAGCAGTACTCAGACCCTTACTACGCA
GGCGTTGTTGCTCCCTATGGAAGTCAAGATGTGTGTCCGAGGAGCCTGTCTATGTGAACGCCAAGCAGTAC
CGCGGCATTCTAAGACGGCGGCAGTCACGTGCCAAGGCCGAGCTTGAGAGAAAGCGCTGGTCAAAGCAAGA
AAGCCGTATCTTCACGAGTCCCCGTCATCAGCACGCGATGACGAGGAGGGCGAGAGGGAACGGTGGACGCT
TCCTAAACACGAAGAAGAGTGACCGTGTCCCTCCTGATGACTTGATACAGCTACGACGACACAACGAGGCT
TGA
SEQ ID NO：10
LRDRRKTKQG KETPCSPIGR RLRSFAPNGF CSISISCSIA VLRPLLRRRC CSLWKSRCVS
EEPVYVNAKQ YRGILRRRQS RAKAELERKR WSKQESRIFT SPRHQHAMTR RARGNGGRFL
NTKKSDRVPP DDLIQLRRHN EA
SEQ ID NO：11
ATGACTGCTCACCAGACTTGCTGCGATGATGCCGTTGCCGCCGGCACTGCACCGGCTGCC
AGGAGGAGGCGCCTCAAATTGACGAGGCCGTCGGCCTCGCTCTTGATGGCGAGGAAGCTA
AGGAAGAAGGCTGCCGGCAGCAAACGCCCAAGGGCGGCAGCGTCGAGGAAGCGCGCGATG
GCGATCAGGAGGAAGATGGAAGCGCTGAGGCTGCTCGTGCCACTCTGCGGCCGAGACAAC
GGCTCGGTGACCGGTGGGGCGGTCGAACGACTGGACGAGCTCCTCATGCACGCCGCCGGG
TACATCCTGCGCCTCCAGATGCAGGTCAGAGTGATGCAGCTTATGGTCCATGCACTAAAT
GACCGGCCCGAGGATTAA
SEQ ID NO：12
MTAHQTCCDDAVAAGTAPAARRRRLKLTRPSASLLMARKLRKKAAGSKRPRAAASRKRAMAIRRKMEALRL
LVPLCGRDNGSVTGGAVERLDELLMHAAGYILRLQMQVRVMQLMVHALNDRPED
SEQ ID NO：13
ATGTCGGCGGCGCTCGCGGTGACGGACGAGGTGGCCCTGCCGATCCGGGCGGTGGGGGAT
CTAGCGGCCGCCGCCGAGGTCTCGCGGGAGGAGGTCGCCGTCATCACCCAGTGCGCGGCG
CTCGGTGGGAAGTTGCCTTTTGAAGATGCATCAGTTGGTGCGGTTCTTGCAGTCATTAAA
AACGTGGAAAGCTTGAGGGAGCAATTGGTTGCTGAAATCAGGCGGGTGCTGAAAGCTGGT
GGAAGAGTATTGGTGCAGAGCCCTGCACCCTCATCCAGTCAGAAGCCGAACACTGATATT
GAGCGCAAGTTACTGATGGGTGGATTTGCTGAAGTGCAATCTTCTGCTGCAAGCTCGCAG
GATAGCGTGCAATCTGTTACAGTTAAGGCAAAGAAGGCTAGCTGGAGCATGGGCTCTTCT
TTTCCCCTTAAGAAAACAACAAAAGCCCTTCCCAAGATTCAAATTGACGACGACTCTGAT
CTGATTGATGAAGACAGTCTCTTGACTGAGGAGGACCTGAAGAAACCACAACTTCCAGTT
GTTGGGGACTGTGAGGTGGGGGCAGCAAAGAAAGCATGCAAGAACTGTACTTGTGGCAGG
GCTGAGGCCGAGGAGAAGGTTGGGAAGCTGGAGCTCACTGCGGAGCAGATCAATAACCCT
CAGTCAGCTTGTGGCAGTTGTGGGTTGGGTGATGCCTTCCGCTGTGGAACCTGTCCCTAC
AGAGGTCTTCCACCATTCAAGCCTGGCGAGAAGGTTTCCTTGTCTGGCAACTTCCTTGCT
GCTGACATATGA
SEQ ID NO：14
MSAALAVTDEVALPIRAVGDLAAAAEVSREEVAVITQCAALGGKLPFEDASVGAVLAVIKNVESLREQLVA
EIRRVLKAGGRVLVQSPAPSSSQKPNTDIERKLLMGGFAEVQSSAASSQDSVQSVTVKAKKASWSMGSSFP
LKKTTKALPKIQIDDDSDLIDEDSLLTEEDLKKPQLPVVGDCEVGAAKKACKNCTCGRAEAEEKVGKLELT
AEQINNPQSACGSCGLGDAFRCGTCPYRGLPPFKPGEKVSLSGNFLAADI
SEQ ID NO：15
ATGGCGATGCAGACGGGGGTCGCGACCTCCAAGGTCCTCATCCTCGTCGGTGCAGGGATGACGGGCTCGAT
CCTGCTGCGGAATGGCCGCTTATCTGATGTGTTGGGAGAACTCCAGGAGATTATGAAGGGTGTAAATCAAG
GAACTTCTTCGGGTCCCTATGACATTGCACTTATTCAAGCTCAGATTCGGAATTTAGCGCAAGAAGTCAGA
GATTTGACATTGTCAAAGCCCATTACCATACTGAATGGCAAATCTGACTCGGGAGGCAGTTTATCATCCTA
CATACTGCCAGCAGCAGCAGTTGGAGCAATGGGTTATTGCTACATGTGGTGGAAGGGGTTGTCTCTCTCAG
ATGTCATGTTTGTCACAAAACACAACATGGCAAATGCTGTTCAGAGCATGTCAAAGCAGTTGGAGCAAGTT
TCATCAGCACTAGCTGCAACAAAAAGACATCTAACTCAACGGCTTGAGAATTTGGATGGCAAAATGGATGA
ACAAGTAGAGGTCTCCAAAGCTATTAGAAATGAGGTCAATGATGTTAAAGATGACCTGTCTCAAATTGGAT
TTGATGTCGAATCAATTCAGAAAATGGTTGCTGGATTGGAGGGAAAGATCGAGTTACTTGAGAACAAACAG
GACGTGGCTAATACTGGTATCTGGTATCTCTGCCAAGTAGCAGGCGGTTTAAAAGATGGAATAAACACCAG
GTTTTTCCAGGAAACCAGTGAGAAGCTGAAGCTCTCACATTCAGCTCAACCTGAAAACAAGCCAGTGAAGG
GGCTTGAATTTTTTTCGGAAAGCACCATGGAACAGAAAGTAGCTGACTCCAAACCAATTGCGGTGACAGTC
GACGCTGAGAAGCCTGAGAAAACCGCTGCTGTAATGGGCACCACAGTGCACAGGTCTATCAGGTTCTCATA
TCGGAAGGCAGGCCTTGCTTTGTGA
SEQ ID NO：16
MAMQTGVATS KVLILVGAGM TGSILLRNGR LSDVLGELQE IMKGVNQGTS SGPYDIALIQ
AQIRNLAQEV RDLTLSKPIT ILNGKSDSGG SLSSYILPAA AVGAMGYCYM WWKGLSLSDV
MFVTKHNMAN AVQSMSKQLE QVSSALAATK RHLTQRLENL DGKMDEQVEV SKAIRNEVND
VKDDLSQIGF DVESIQKMVA GLEGKIELLE NKQDVANTGI WYLCQVAGGL KDGINTRFFQ
ETSEKLKLSH SAQPENKPVK GLEFFSESTM EQKVADSKPI AVTVDAEKPE KTAAVMGTTV
HRSIRFSYRK AGLAL
SEQ ID NO：17
ATGTGCTCGGTAGCGAGGCTGGCGTTTGTGCTTGCACTGGCCATAGCCGCCTCGTCAATTGAGGTTGCGGA
GAGCAGAGATTTTAATATCTTTGCTCAGGGCAGCTTGCCTGATGCAACCAAGGGATCGTCTGGTCTAGCTG
CAACCAGTGGAAAGTTGTGTCAGTTATGCGAGCAGTACTCATCCGAGGCGCTCCTCTATCTCACACAAAAC
GAGACCCAGACTGAGATTCTTAGCATTCTACACCATGAATGTGCCAGCCTTGCCCCTCTCAAACAGCAGTG
CATCACGCTGGTTGACTACTACGTACCCCTTTTCTTCTTGGAGGTCTCCATGGTTACCCCTGAGAAGTTCT
GCGAGTCGATGCATCTCTGCAAGAAGGGGATGAAGATTAGCCTACCCACCCGGGAGGGTACTTGTGGTTTG
TGCCACCATGTTGTTGTTGAAATTCTTATCATGCTTAAAGACCCCAACATGCAGCTGGAAGTAATCGACCT
ACTCACCAAAACATGCAGCAAGGCGCAGAACTATGAACAGTAG
SEQ ID NO：18
MCSVARLAFV LALAIAASSI EVAESRDFNI FAQGSLPDAT KGSSGLAATS GKLCQLCEQY
SSEALLYLTQ NETQTEILSI LHHECASLAP LKQQCITLVD YYVPLFFLEV SMVTPEKFCE
SMHLCKKGMK ISLPTREGTC GLCHHVVVEI LIMLKDPNMQ LEVIDLLTKT CSKAQNYEQ
SEQ ID NO：19
GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAAATCCATCCATTCCCCTCGCCAAGCCGCCACGGCCTGACTTT
CCCTCCCGCACACCCGCGACCATACAGGCAAGTCAGGCATACACCAACAACGCTCGTCGTGCACCTCGCGC
CTCAGGTCACCCCACCAAATTCCTCTTGATACGCCGAATTTCTTTTGCTAATTCTGCTACCTCCTGTCGCT
AAGCCACCATATTCAGTCTAACCCCTGCTCTGAGCTCACCTGATTGGCGGCTCCGTTCGGCCTCTGGGCCT
GGGTGTACCGACTACCGAGGGCTCTTTCGAAATGTCAATTGGGTCGAGTTTGGTGGGCTACGTGAAGCATG
GATGAATTTCCCGGCTGGAAGCGGGAGGCGGCAGCAGCATCCGGGGCCGGAGCACCTGTCGCCGATGACGC
CGCTCCCGCTGGCGCGGTAGGGGTCGGTCTACTCGCTCACGTTCGACGAGTTCCAGAGCTCGCTCGGTGGG
GCCACCAAGGACTTCGGATCCATGAACATGGACGAGCTCCTCCGCAACATCTGGTCGGCGGAGGAGACACA
CAGCGTCACAGCTGCGGACCATGCCGCGCGGGCGCCGTACGTCCAGTGCCAGGGCTCGCTCACCCTCCCCT
GCACGCTCAGCCAGAAGACCGTCGACGAGGTCTAGCGTGACCTCGTGTGCAACGGTGGAGGACCCTCCGAC
GAGGCTGTGGCGCCGCCCCACCGGCCCAACGGCAGCCGACGCTCGGGGAGATCATGCTGGAGGAGTTCCTC
GTCCGCGCCGGCGTGGTGAGGGAGGACATGATGGCGGCGGCGCCCGTACCACCAGCGCCGGGTTGCCCACC
ACCTCATCTGCAACCGCCAATGCTGTTTCCACATGGCAATGTGTTTGCTCCCTTAGTGCCTCCGCTCCAAT
TCGGGAATGGGTTTGTGTCGGGGGCTCTCAGTCAGCAGCAGGGAGGTGTTCTTGAGGCCCCGGCGGTATCG
CCGCGGCCGGTGACGGCAAGCGGGTTCGGGAAGATGGAAGGAGACGACTTGTCGCATCTGTCGCCATCACC
GGTGTCGTACGTTTTTTTGTGCTGGTTTGAGGGGAAGGAAGCCACCAGCTGTGGAGAAGGTGGTTGAGAGG
AGGCAACGCC
SEQ ID No：20
mdfpggsgrq qqlppmtplp larqgsvysl tfdefqstlg gvgkdfgsmn mdellrsiwt
aeeshavgaa ttttattasv aaaehaavga ppvqrqgslt lprtlsqktv devwrdmmcf
ggggastapa aaeppppahr qqtlgeitle eflvragvvr edmsvppvpp aptptaaavp
pppppqqqtp mlfgqsnvfp pmvpplslgn glvsgavghg gggaaslvsp vrpvssngfg
kmeggdlssl spspvpyvfk gglrgrkapg iekvverrqr rmiknresaa rsrqrkqaym
meleaevakl kelndelqkk qdemleqqkn evlermsrqv gptakriclr rtltgpw
SEQ ID NO：21
atg gattttccgg gagggagcgg
gaggcagcag cagctgccgc cgatgacgcc gctgccgttg gcgaggcagg ggtcggtgta
ctcgctcacg ttcgacgagt tccagagcac gctgggcggg gtcgggaagg acttcgggtc
gatgaacatg gacgagctcc tccgcagcat ctggacggcc gaggagtcgc acgccgtcgg
cgccgccacg acgacgacgg cgacgacggc gtccgtggcg gcggcggagc acgcggcggt
gggggcgccg cccgttcaga ggcaggggtc gctgaccctc ccccgcacgc tcagccagaa
gaccgtcgac gaggtctggc gcgacatgat gtgcttcggt ggcggcggcg cctccaccgc
gccggccgcc gcggagcccc cgccgccggc gcaccggcag cagacgctcg gggagatcac
gctggaggag ttcctcgtgc gggccggcgt ggtgagggag gacatgtcgg tcccgcccgt
cccgccggcg ccgactccta cggcggctgc tgtacctccc ccgccgccgc cgcagcagca
gacgccgatg ttgttcggtc agagcaatgt gttccctccg atggtgcctc cgctctcgct
gggaaatggg ctggtctcgg gagctgtcgg acacggcggt ggtggtgccg cgtcgttggt
ttcgccggtg aggccggtct cgtccaatgg cttcggcaag atggaaggcg gggacctgtc
gtcgctgtcg ccatcgccgg tgccgtacgt tttcaaaggt gggctgaggg gaaggaaggc
accgggcatc gagaaggttg tcgagagaag acagcggcgg atgatcaaga acagggagtc
tgccgcgagg tcgcgccaga ggaaacaggc atatatgatg gaattggaag ctgaggtagc
aaaacttaag gagctgaacg atgaactcca gaaaaagcag gatgaaatgt tggagcagca
aaagaatgag gttctagaga gaatgagccg acaagttgga ccgacagcaa agagaatttg
ccttcggagg actctgacgg gtccatggtg a
SEQ ID NO：22
ATGAATTTCCCGGCTGGAAGCGGGAGGCGGCAGCAGCATCCGGGGCCGGAGCACCTGTCGCCGATGACGCC
GCTCCCGCTGGCGCGGCAGGGGTCGGTCTACTCGCTCACGTTCGACGAGTTCCAGAGCTCGCTCGGTGGGG
CCACCAAGGACTTCGGATCCATGAACATGGACGAGCTCCTCCGCAACATCTGGTCGGCGGAGGAGACACAC
AGCGTCACAGCTGCGGACCATGCCGCGCGGGCGCCGTACGTCCAGTGCCAGGGCTCGCTCACCCTCCCCTG
CACGCTCAGCCAGAAGACCGTCGACGAGGTCTGGCGTGACCTCGTGTGCAACGGTGGAGGACCCTCCGACG
AGGCTGTGGCGGCCGCCCCACCGGCCCAACGGCAGCCGACGCTCGGGGAGATCATGCTGGAGGAGTTCCTC
GTCCGCGCCGGCGTGGTGAGGGAGGACATGATGGCGGCGGCGCCCGTACCACCAGCGCCGGGTTGCCCACC
ACCTCATCTGCAACCGCCAATGCTGTTTCCACATGGCAATGTGTTTGCTCCCTTAGTGCCTCCGCTCCAAT
TCGGGAATGGGTTTGTGTCGGGGGCTCTCAGTCAGCAGCAGGGAGGTGTTCTTGAGGCCCCGGCGGTATCG
CCGCGGCCGGTGACGGCAAGCGGGTTCGGGAAGATGGAAGGAGACGACTTGTCGCATCTGTCGCCATCACC
GGTGTCGTACGTTTTTTTGTGCTGGTTTGAGGGGAAGGAAGCCACCAGCTGTGGAGAAGGTGGTTGA
SEQ ID NO：23
MNFPAGSGRR QQHPGPEHLS PMTPLPLARQ GSVYSLTFDE FQSSLGGATK DFGSMNMDEL
LRNIWSAEET HSVTAADHAA RAPYVQCQGS LTLPCTLSQK TVDEVWRDLV CNGGGPSDEA
VAAAPPAQRQ PTLGEIMLEE FLVRAGVVRE DMMAAAPVPP APGCPPPHLQ PPMLFPHGNV
FAPLVPPLQF GNGFVSGALS QQQGGVLEAP AVSPRPVTAS GFGKMEGDDL SHLSPSPVSY
VFLCWFEGKE ATSCGEGG
SEQ ID NO：24
ATGAATTTCCCGGCTGGAAGCGGGAGGCGGCAGCAGCATCCGGGGCCGGAGCACCTGTCGCCGATGACGCC
GCTCCCGCTGGCGCGGCAGGGGTCGGTCTACTCGCTCACGTTCGACGAGTTCCAGAGCTCGCTCGGTGGGG
CCACCAAGGACTTCGGATCTATGAACATGGACGAGCTCCTCCGCAACATCTGGTCGGCGGAGGAGACACAC
AGCGTCACAGCTGCGGACCATGCCGCGCGGGCGCCGTACGTCCAGTGCCAGGGCTCGCTCACCCTCCCCTG
CACGCTCAGCCAGAAGACCGTCGACGAGGTCTGGCGTGACCTCGTGTGCAACGGTGGAGGACCCTCCGACG
AGGCTGTGGCGGCCGCCCCACCGGCCCAACGGCAGCCGACGCTCGGGGAGATCATGCTGGAGGAGTTCCTC
GTCCGCGCCGGCGTGGTGAGGGAGGACATGATGGCGGCGGCGCCCGTACCACCAGCGCCGGGTTGCCCACC
ACCTCATCTGCAACCGCCAATGCTGTTTCCACATGGCAATGTGTTTGCTCCCTTAGTGCCTCCGCTCCAAT
TCGGGAATGGGTTTGTGTCGGGGGCTCTCAGTCAGCAGCAGGGAGGTGTTCTTGAGGCCCCGGCGGTATCG
CCGCGGCCGGTGACGGCAAGCGGGTTCGGGAAGATGGAAGGAGACGACTTGTCGCATCTGTCGCCATCACC
GGTGTCGTACGTTTTTTTGTGCTGGTTTGAGGGGAAGGAAGCCACCAGCTGTGGACAAGGTGGTGAGAGAA
GACAGAGGAGGATGATCAAGAACAGGGAGTCTGCCGCGAGGTCGAGGCAGAGGAAACAGGCATATATGATG
GAATTGGAAGCTGAGGTAGCAAAGCTCAAGGAGCTGAACGACGAGCTCCAGAAGAAGCAGGACGAGATGCT
GGAGCAGCAGAAGAACGAGGTGCTGGAGAGGATGTCC
AGGCAGGTGGGCCCAACCGCCAAGAGGATTTGCCTGAGGAGGACCCTGACCGGCCCATGGTGA
SEQ ID NO：25
MNFPAGSGRR QQHPGPEHLS PMTPLPLARQ GSVYSLTFDE FQSSLGGATK DFGSMNMDEL
LRNIWSAEET HSVTAADHAA RAPYVQCQGS LTLPCTLSQK TVDEVWRDLV CNGGGPSDEA
VAAAPPAQRQ PTLGEIMLEE FLVRAGVVRE DMMAAAPVPP APGCPPPHLQ PPMLFPHGNV
FAPLVPPLQF GNGFVSGALS QQQGGVLEAP AVSPRPVTAS GFGKMEGDDL SHLSPSPVSY
VFLCWFEGKE ATSCGQGGER RQRRMIKNRE SAARSRQRKQ AYMMELEAEV AKLKELNDEL
QKKQDEMLEQ QKNEVLERMS RQVGPTAKRI CLRRTLTGPW
SEQ ID NO：26
ATGATGTTCTCCTCCTCCCTCTCTGTGGTGGAGTTTTACTTCCTGCACAGATTCCCCCTG
CCTTTTGCTGGCTACCTCATCTTCATTTCCATATTGGCTGGATTCTGGGGCCAGTGTTTG
GTTAGGAAGATCGTGCATGTGCTCAAGAGAGCATCGCTTATTGTCTTCATCCTCTCCTCT
GTTATCTTCGTCAGTGCTCTTACGATGGGTGTCGTTGGAACCCAGAAGAGCATTTCGATG
ATCAACAATCACGAATATATGGGGTTCCTCAACTTCTGCGAGTAA
SEQ ID NO：27
MMFSSSLSVV EFYFLHRFPL PFAGYLIFIS ILAGFWGQCL VRKIVHVLKR ASLIVFILSS
VIFVSALTMG VVGTQKSISM INNHEYMGFL NFCE
SEQ ID NO：28
ATGGCGTCTGCAGTGACCAGCAGCGACAAGGAGCAGGCCGTCCCTACCATCGACGCTGAC
GAAGCGCACGCGCTGCTGAGCTCCGGCCATGGCTACGTGGATGTCAGGATGCGGGGGGAC
TTCCACAAGGCGCATGCGCCCGGTGCTCGGAACGTTCCCTACTACCTGTCCGTCACGCCG
CAAGGGAAGGAGAAGAACCCACACTTTGTAGAGGAAGTGGCTGCCTTCTGTGGGAAGGAT
GATGTCTTCATTGTGGGTTGCAACACGGGGAACAGATCCAGGTTCGCGACGGCAGACCTT
CTGAACGCGGGGTTCAAGAACGTGAGGAACCTGCAAGGTGGTTACCGCTCCTTTCAGCAG
CGAGCTCAACAGCAGTA
SEQ ID NO：29
MASAVTSSDK EQAVPTIDAD EAHALLSSGH GYVDVRMRGD FHKAHAPGAR NVPYYLSVTP
QGKEKNPHFV EEVAAFCGKD DVFIVGCNTG NRSRFATADL LNAGFKNVRN LQGGYRSFQQ
RAQQQ
SEQ ID NO：30
ATGGAGGCGAAGAAGAAGCCGTCGGCCCCCGCCGCCGTCGGAGCCGCGCCGCCGCCGCCG
GGTAACGGGTACTTCAGCACCGTCTTCTCCGCGCCGACTGCGGGAAGCGCAAGTGACGCA
AAGCATGCGGACTTGTACACGATGCTGAACAAGCAGAGCTCCAGAGGGCAGAATGGCAGA
GATGGCAAATCCCACAGCCGCCCTACTTACAAGGATGGCAAACATGCTCATCCAAATGAG
CCATCAGAATCTCCTTACTTTGGCTCATCCGTGCATTACGGTGGTCGGGAGTTCTACAGC
AGCGTTTTACGGAAGCAACCAGCCAATGAACCCCATACGGATTACAAGGGGGACAACCCG
GATGGCTCTGCTACCAGAGGTGATTGGTGGCAAGGTTCACTTTATTACTGA
SEQ ID NO：31
MEAKKKPSAP AAVGAAPPPP GNGYFSTVFS APTAGSASDA KHADLYTMLN KQSSRGQNGR
DGKSHSRPTY KDGKHAHPNE PSESPYFGSS VHYGGREFYS SVLRKQPANE PHTDYKGDNP
DGSATRGDWW QGSLYY
SEQ ID NO：32
ATGGACCGGAACCTGAGCGGGTTTCTGATCGGGTGCCTGGGCGCCGCCGTGACGCTGCTG
GCGTACCAGCAGACGGTGGTGACCAGCACGCAGAGCGTCGCGGCGGGCTTCGTCGTCATC
CTCTTCGCCCTCTTCGTCAAGGAAGGATTCATTTCCCTCTGA
SEQ ID NO：33
MDRNLSGFLI GCLGAAVTLL AYQQTVVTST QSVAAGFVVI LFALFVKEGF ISL
SEQ ID NO：34
ATGGCATGCGTCAGCACCTTCCAGAGCTGCCCCATTGCCAGAAGAGCAAAGATCAACACCAGG
TCCAGGGGCAGCAGCAGTAGCGTGGCGAAGGGGTCACCACCACCAGCCTTCCAGTTCCAGTG
CAGGGCGTCGACTTTCGCGGCGGACACCAGCCTCCGGCTCGAGCTGGACGAGAACCCCGAGG
CGATCATCTCGGGGGCGTGGCCCGGGAACTGCTCCCTCCTCAGCTACGACGACCTCCGCGCCTA
CCTCGAGTCGCAGGAGACGGCGGCCCAGGCAGACGATCAGCGCGGCGTGGCGCTCCTGAGCG
AGACCATGTCCACACCCGTGCTGGTGGCCACAGCAGACCAGACCCTGGAGGACGTCGAGTGC
CACTTCGAGGCCGTGTCGGGGCTTCCGGTCGTCGACAGCGGCCTCAGATGCGTCGGGGTGATC
GTCAAGAACGACCGGGCAAGAGCCTCTCATGGGTCCAAGACGAAGATATCGGAAGTGATGACA
TCTCCAGCTATCACACTATCGTCTGACAAAACCGTGATGGATGCTGCTGTTCTCATGCTCAAGA
AGAAGATCCACAGATTACCAGTTGTAAACCAGGACGAAAAAGTAATAGGTATAGTTACCCGCGC
TGATGTTCTTCGCGTGTTGGAAGGCATGTTGAAGATTTAG
SEQ ID NO：35
MACVSTFQSC PIARRAKINT RSRGSSSSVA KGSPPPAFQF QCRASTFAAD TSLRLELDEN
PEAIISGAWP GNCSLLSYDD LRAYLESQET AAQADDQRGV ALLSETMSTP VLVATADQTL
EDVECHFEAV SGLPVVDSGL RCVGVIVKND RARASHGSKT KISEVMTSPA ITLSSDKTVM
DAAVLMLKKK IHRLPVVNQD EKVIGIVTRA DVLRVLEGML KI
SEQ ID NO：36
ATGGGCGACCTCTCTGTCGGCCACAGCCGCCGCTGGTGCGGCCGTTTCGCGGCCGTCCTTTGCCTGTGCGC
GGCCTTCTGCAAGCCAGATGAACTCCCGATGGATCCACTGCCGAACTTGCCGCCGACGAGGTCGCTGCAGT
GCTTCGAGGACGAACAGGTGTACAGCTGCTGCGAGGGCGCGTACAGGCTAAACCCATCGGGAATCATCGCC
GTTCCCGTCGGCGCGGTGGACTACTACTGCGGCGGCGCGTGCGTGGTGGAGACGGAGGACGTGCTCAACTG
CGTGGCCAGCGCCCTGGACGGCTTCGCCTTCTACAACGGGGCCTCCGTGGAGGACGTGCGCTACGCACTCA
GGCGGGGCTGCAGCCACACCGCCAGAAGAGGCGACTTCAACGATTTGGAGCCGCATCTGGGCGACTACCCT
GACATCTATGGCGACGATGATGAGCACAGCTTTGGCAGCAAGGTTGTTGCAGCTCCTCTGAGGTTGCTCGC
GTTTCTTGGCGGTGCGGGGCTGTTCTTCCTGGGCCCTTGA
SEQ ID NO：37
MGDLSVGHSR RWCGRFAAVL CLCAAFCKPD ELPMDPLPNL PPTRSLQCFE DEQVYSCCEG
AYRLNPSGII AVPVGAVDYY CGGACVVETE DVLNCVASAL DGFAFYNGAS VEDVRYALRR
GCSHTARRGD FNDLEPHLGD YPDIYGDDDE HSFGSKVVAA PLRLLAFLGG AGLFFLGP
SEQ ID NO：38
ATGGATTCGGAGGCGGTGCAGCACGGCCTTCTCCCTCTGTCTGCCTGTCCTCCTACCGCCAACAGCTGCGC
GCATTACAGCCGTGGGTGCAGCGTCGTGGCGCCCTGCTGCGGCCAGGCCTTCGGCTGCCGCCATTGCCACA
ACGACGCCAAGAACTCGCTGGAGGTCGACCCGCGCGACCGGCACGAGATCCCCCGCCACGAAATAAAGAAG
GTGATCTGTTCTCTCTGCTCCAAGGAACAGGACGTGCAACAGAACTGCTCCAGCTGTGGGGCCTGCATGGG
CAAGTACTTCTGTAAAGTATGCAAGTTCTTCGATGATGATGCCTCAAAGGGCCAGTACCACTGTGACGGAT
GTGGAATATGTAGAACCGGCGGCGTGGAGAACTTTTTCCACTGTGATAAATGTGGGTGTTGCTACAGCAAT
GTCTTGAAGGATTCCCACCACTGCGTCGAAAGAGCAATGCATCACAACTGCCCCGTCTGCTTTGAGTATCT
GTTCGACTCCACGAAGGACATCAGCGTGCTGCAATGTGGGCATACCATCCATTTGGAGTGCATGAACGAGA
TGAGAGCACACCATCACTTCTCATGCCCAGTGTGCTCGAGGTCCGCCTGCGACATGTCGGCCACATGGCGG
AAGCTCGACGAGGAGGTCGCGGCCACGCCGATGCCTGACATCTACCAGAAGCACATGGTGTGGATCCTGTG
CAACGACTGCAGCGCGACCTCGAGCGTGCGGTTCCACGTGCTGGGGCACAAGTGCCCCGCGTGCAGCTCGT
ACAACACCCGGGAGACGAGGGCTGCGTGCCCCAGGATCTGA
SEQ ID NO：39
MDSEAVQHGL LPLSACPPTA NSCAHYSRGC SVVAPCCGQA FGCRHCHNDA KNSLEVDPRD
RHEIPRHEIK KVICSLCSKE QDVQQNCSSC GACMGKYFCK VCKFFDDDAS KGQYHCDGCG
ICRTGGVENF FHCDKCGCCY SNVLKDSHHC VERAMHHNCP VCFEYLFDST KDISVLQCGH
TIHLECMNEM RAHHHFSCPV CSRSACDMSA TWRKLDEEVA ATPMPDIYQK HMVWILCNDC
SATSSVRFHV LGHKCPACSS YNTRETRAAC PRI