本発明は、魚類の栄養要求性を決定する方法に関する。当該方法は、魚類の養殖等の分野で有用である。

魚は、良質のタンパク質や脂質を含有する栄養価の高い食品である。また、魚は、研究材料としても有用である。

近年、海洋生態系の保全や安定供給等の観点から、「捕る漁業」から「育てる漁業」への転換が試みられており、魚の養殖が盛んに行われている。

魚の養殖においては、成長性の高い飼料の開発が強く望まれている。現在広く使用されている配合飼料は、魚が天然に摂取している餌(小魚等)を基本組成として開発されてきたものであり、例えば、魚粉、油脂、穀類、糟糠類、ビタミン、ミネラル等の原料をペレットマシンやエクストルーダーにより造粒して製造される。

ここで、魚種によりその栄養要求性が異なると考えられることから、配合飼料は養殖対象の魚類に合わせて開発されるのが望ましい。ヒトについては、例えば、ゲノム情報に基づき栄養要求性を予測し得る可能性を論じた論文がある(非特許文献1、2)。しかしながら、魚の栄養要求性を予測する方法については知られていない。

Tamura T, et al., Genome Inform. 2010 Jan;22:176-90.

Romero P, et al., Genome Biol. 2005;6(1):R2. Epub 2004 Dec 22.

本発明は、魚類の栄養要求性を決定する手段を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、トラフグとヒトのゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列に基づいて各タンパク質の機能のアノテーションを行い、アノテーション結果に基づきトラフグとヒトが有する代謝経路を同定および比較することで、トラフグにとって特異的に要求性が高い栄養素の候補を決定できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通り例示できる。 [1] 魚類の栄養要求性を決定する方法であって、 (1)魚類のゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を、既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較することにより、該魚類の各タンパク質の機能を推定すること、 (2)前記推定された各タンパク質の機能に基づき前記魚類が有する代謝経路を同定すること、および (3)前記同定された前記魚類が有する代謝経路と、対照生物が有する代謝経路との違いに基づき、前記魚類の栄養要求性を決定すること、を含み、 前記対照生物が、哺乳類または鳥類である、方法。 [2] 前記対照生物のゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を、既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較することにより、該対照生物の各タンパク質の機能を推定すること、および、前記推定された各タンパク質の機能に基づき前記対照生物が有する代謝経路を同定すること、を含む、前記方法。 [3] 或る代謝経路が前記魚類に存在せず、且つ、前記対照生物に存在する場合に、該代謝経路により生成する代謝物の前記魚類における要求性が高いと決定することを特徴とする、前記方法。 [4] 前記アミノ酸配列がFASTAフォーマットで記述されている、前記方法。 [5] BLASTを利用した既知のタンパク質との相同性検索により各タンパク質の機能が推定される、前記方法。 [6] KEGG Orthology(KO)に基づくアノテーションにより各タンパク質の機能が推定される、前記方法。 [7] 前記推定された各タンパク質の機能が代謝経路上にマッピングされる、前記方法。 [8] 前記対照生物がヒトである、前記方法。 [9] 前記方法により前記魚類における要求性が高い代謝物を決定し、当該代謝物を飼料原料に添加することを特徴とする、魚類用飼料の製造方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

<1>本発明の方法 本発明の方法は、魚類の栄養要求性を決定する方法である。

本発明の方法は、(1)魚類のゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を、既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較することにより、該魚類の各タンパク質の機能を推定すること、(2)前記推定された各タンパク質の機能に基づき前記魚類が有する代謝経路を同定すること、および(3)前記同定された前記魚類が有する代謝経路と、対照生物が有する代謝経路との違いに基づき、前記魚類の栄養要求性を決定することを含む。

本発明において、「魚類」は、ゲノムが決定され、ゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を入手できる魚類であれば特に制限されない。なお、「ゲノムが決定され、ゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を入手できる」ことには、ゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列が公開されている場合に加えて、自ら、または外注等して、ゲノム解析を行ってタンパク質のアミノ酸配列を取得できる場合も含まれる。なお、2013年5月29日現在、ゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を入手できる魚類として、具体的には、トラフグ、ミドリフグ、ゼブラフィッシュ、イトヨ(トゲウオ)、メダカ、タイセイヨウマダラ、ヤツメウナギ、シーラカンス、プラティ、ティラピアが挙げられる。

本発明において、「対照生物」は、哺乳類または鳥類である。「対照生物」は、代謝経路が同定されているか、代謝経路を同定できる哺乳類または鳥類であれば特に制限されない。代謝経路を同定できる哺乳類または鳥類としては、ゲノムが決定され、ゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を入手できる哺乳類または鳥類が挙げられる。対照生物が有する代謝経路は、適宜、ゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列に基づき同定することができる。すなわち、本発明の方法は、対照生物のゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を、既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較することにより、該対照生物の各タンパク質の機能を推定することを含んでいてよく、前記推定された各タンパク質の機能に基づき前記対照生物が有する代謝経路を同定することを含んでいてよい。対照生物は、栄養要求性についてよく知られているものが好ましい。ゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を入手でき、且つ栄養要求性についてよく知られている哺乳類または鳥類として、具体的には、例えば、ヒト、マウス、ニワトリが挙げられる。中でも、ヒトが好ましい。

タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、公知のデータベースから入手することができる。そのようなデータベースとしては、特に制限されないが、例えば、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)、DDBJ(DNA Data Bank of Japan;http://www.ddbj.nig.ac.jp/)、EMBL(European Molecular Biology Laboratory;http://www.embl.org/)が挙げられる。具体的には、例えば、Ensemblのftpサイト(http://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html)において、目的の生物種の「Protein sequence (FASTA)」を選択することで、当該生物種のゲノム情報から推定される全タンパク質のアミノ酸配列をFASTAフォーマットでダウンロードすることができる。なお、本発明の方法において用いられるアミノ酸配列を、「アミノ酸配列データ」という場合がある。本発明の方法は、このようなアミノ酸配列データをダウンロードして取得するステップを含んでいてもよい。

タンパク質のアミノ酸配列データは、ゲノム情報(塩基配列)から推定されるアミノ酸配列データからなるものであってもよく、それ以外のアミノ酸配列データを含むものであってもよい。例えば、タンパク質のアミノ酸配列データは、実験的に決定されたアミノ酸配列データを含んでいてもよい。

タンパク質のアミノ酸配列データは、各タンパク質の機能を推定するために利用できる形式で記述されていればよい。「各タンパク質の機能を推定するために利用できる形式」は、各タンパク質の機能を推定する際に用いるソフトウェアやそのアルゴリズムに応じて適宜設定すればよい。例えば、タンパク質のアミノ酸配列は、FASTAフォーマットで記述されているのが好ましい。FASTAフォーマットは、ヘッダ行で区切られた1またはそれ以上の配列データ(例えばタンパク質のアミノ酸配列データ)を保持する形式である。複数の配列データを保持するものを、multi-FASTAフォーマットともいう。特に、multi-FASTAフォーマットは複数のタンパク質について一括してアノテーションを行う際に有用である。具体的には、例えば、後述するKAASでアノテーションを行う場合、multi-FASTAフォーマットで記述されたアミノ酸配列を一括して処理することができる。

タンパク質の機能の推定は、タンパク質のアミノ酸配列を既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較することにより行うことができる。「既知のタンパク質」とは、アミノ酸配列と機能が知られているタンパク質または機能性モチーフであれば特に制限されない。既知のタンパク質のアミノ酸配列は、実験的に決定されたものであってもよく、ゲノム情報や遺伝子配列から推定されたものであってもよい。既知のタンパク質の機能は、実験的に決定されたものであってもよく、他の既知のタンパク質のアミノ酸配列との比較により推定されたものであってもよい。タンパク質の機能の推定は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列を、公知のデータベースに登録されたアノテーション済みのタンパク質のアミノ酸配列と比較することにより行うことができる。アミノ酸配列の比較は、例えば、相同性検索やモチーフ予測等により行うことができる。相同性検索は、例えば、BLASTを利用して行うことができる。

具体的には、例えば、FASTAフォーマットで記述されたタンパク質のアミノ酸配列データを、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes;http://www.genome.jp/kegg/)またはそのローカルサーバであるiKegのKAAS(KEGG automatic annotation server)により処理し、KO(KEGG Orthology)に基づくアノテーションを行い、タンパク質の機能を推定することができる。この場合、KEGGデータベース上のKOに基づくアノテーションが付加された既知のタンパク質のアミノ酸配列との比較により、対象のタンパク質のアノテーションが行われる。KEGGの詳細については、例えば、Kanehisa M, et al., Nucleic Acids Res. 34, D354-357 (2006) や Kanehisa M, et al., Nucleic Acids Res. 36, D480-D484 (2008) を参照できる。KAASの詳細については、例えば、Moriya Y, et al., Nucleic Acids Res. 2007 Jul;35(Web Server issue):W182-5 を参照できる。アミノ酸配列データの処理はタンパク質ごとに行ってもよく、複数のタンパク質について一括で行ってもよい。例えば、multi-FASTAフォーマットで記述された複数のタンパク質のアミノ酸配列を含むデータをKAASにより処理することで、当該複数のタンパク質について一括してKOに基づくアノテーションを行うことができる。本発明の方法において、魚類のタンパク質の機能の推定と、対照生物のタンパク質の機能の推定は、いずれが先に行われてもよく、同時に行われてもよい。

なお、タンパク質の機能の推定は、KOに基づくアノテーションに限られず、アミノ酸配列に基づくタンパク質の機能分類を可能とする任意の手法により行うことができる。例えば、UniProtKB(UniProt Knowledgebase;http://www.uniprot.org/help/uniprotkb)の Swiss-Prot や TrEMBL のアノテーション済タンパク質のアミノ酸配列との比較(例えば、相同性検索)により機能の推定を行ってもよい。

なお、「タンパク質のアミノ酸配列を既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較することによりタンパク質の機能を推定する」ことには、タンパク質のアミノ酸配列データを直接処理する場合に加えて、タンパク質のアミノ酸配列に変換できる任意のデータを処理する場合が含まれる。すなわち、本発明においては、タンパク質のアミノ酸配列に変換できる任意のデータに基づき各タンパク質の機能を推定してもよい。そのようなデータとしては、例えば、遺伝子の塩基配列が挙げられる。そのようなデータは、あらかじめ、あるいは、機能の推定(アノテーション)の際に、タンパク質のアミノ酸配列に変換されて用いられればよい。

本発明において、「(或る)機能を有すると推定されたタンパク質」を、「(或る)機能がアノテーションされたタンパク質」という場合がある。なお、上記で機能が推定されなかったタンパク質は、以降のステップ(代謝経路の同定等)には関与しなくてよい。

本発明の方法においては、上記で推定された各タンパク質の機能に基づき、魚類が有する代謝経路を同定する。すなわち、対象の魚類が、或る代謝経路に対応する機能がアノテーションされたタンパク質を有する場合、当該魚類は当該代謝経路を有すると判断できる。また、対象の魚類が、或る代謝経路に対応する機能がアノテーションされたタンパク質を有さない場合、当該魚類は当該代謝経路を有さないと判断できる。また、対照生物が有する代謝経路も同様に同定できる。本発明において、「代謝経路」とは、単一の反応ステップからなるものであってもよく、複数のシーケンシャルな反応ステップからなるものであってもよく、それらの組み合わせであってもよい。「代謝経路に対応する機能」とは、当該代謝経路を構成する1またはそれ以上の反応ステップを触媒する1またはそれ以上の機能をいう。また、「代謝経路に対応する機能がアノテーションされたタンパク質」とは、当該1またはそれ以上の機能がアノテーションされた1またはそれ以上のタンパク質をいう。

本発明の方法は、上記で推定された各タンパク質の機能を代謝経路上にマッピングするステップを含んでいてもよい。具体的には、例えば、まず、上記機能アノテーションの結果に基づき、魚類と対照生物に共通なタンパク質の機能とそれぞれに特異的なタンパク質の機能を選別する。選別は、手動で行ってもよく、自動で行ってもよい。例えば、統計解析ソフトウェアを用いることにより自動で選別を行うことができる。統計解析ソフトウェアとして、具体的には、例えば、オープンソースの統計解析ソフトウェア「R」(http://www.r-project.org/)が挙げられる。選別したタンパク質の機能を代謝経路上にマッピングすることで、魚類と対照生物に共通な代謝経路とそれぞれに特異的な代謝経路を視覚化できる。視覚化することで、魚類と対照生物の代謝経路の比較が行いやすくなる。マッピングは、例えば、KEGG mapper(http://www.genome.jp/kegg/mapper.html)を利用して行うことができる。

本発明の方法においては、上記で同定された魚類が有する代謝経路と、対照生物が有する対照生物の代謝経路との違いに基づき、魚類の栄養要求性を決定する。例えば、同定された代謝経路を魚類と対照生物に共通な代謝経路とそれぞれに特異的な代謝経路に選別し、それぞれに特異的な代謝経路に基づいて魚類の栄養要求性を決定することができる。すなわち、或る代謝経路の有無が魚類と対照生物とで異なる場合、当該代謝経路により生成する代謝物の要求性が魚類と対照生物とで異なると判断できる。具体的には、例えば、或る代謝経路が魚類に存在せず、且つ、対照生物に存在する場合(当該代謝経路が対照生物に特異的である場合)に、当該代謝経路により生成する代謝物の魚類における要求性が高いと決定してよい。「代謝物の魚類における要求性が高い」とは、魚類が当該代謝物を対照生物と比較して強く要求することをいい、例えば、対照生物は当該代謝物の外部からの供給を必要としないのに対し、魚類は当該代謝物の外部からの供給を必要とすることであってもよい。また、例えば、或る代謝経路が対照生物に存在せず、且つ、魚類に存在する場合(当該代謝経路が魚類に特異的である場合)に、当該代謝経路により生成する代謝物の魚類における要求性が低いと決定してよい。「代謝物の魚類における要求性が低い」とは、魚類が当該代謝物を対照生物と比較して弱く要求することをいい、例えば、例えば、対照生物は当該代謝物の外部からの供給を必要とするのに対し、魚類は当該代謝物の外部からの供給を必要としないことであってもよい。

なお、「代謝経路により生成する代謝物」には、当該代謝経路の直接の産物に加えて、当該産物からさらに代謝されて生成する代謝物が含まれる。「当該産物からさらに代謝されて生成する代謝物」の範囲は、代謝経路の種類やバイパス経路の存在によっても変動するが、当該代謝経路の直接の産物を1番目として、その下流の、例えば、20番目まで、10番目まで、5番目まで、または3番目までの範囲であってもよい。

特に、例えば、対照生物の成長や生命活動において重要な代謝物を生成する代謝経路が魚類で欠損している場合、または、魚類に特異的な代謝経路の基質となる代謝物の供給が不十分である場合に、当該代謝物および/または当該代謝物からさらに代謝されて生成する代謝物を外部から獲得する必要があると判断し、魚類において要求性が高い栄養素の候補として選抜することができる。

本発明の方法においては、機能がアノテーションされた全てのタンパク質について代謝経路の同定及び比較が行われてもよく、機能がアノテーションされたタンパク質の一部について代謝経路の同定及び比較が行われてもよい。また、本発明の方法においては、同定された代謝経路の全てについて魚類と対照生物間で比較が行われてもよく、同定された代謝経路の一部について魚類と対照生物間で比較が行われてもよい。例えば、特定の代謝物の魚類における要求性を決定する場合には、当該特定の代謝物に関連する機能がアノテーションされたタンパク質について代謝経路の同定及び比較が行われればよい。「特定の代謝物に関連する機能」とは、当該特定の代謝物を生成する代謝経路に対応する機能、または、当該特定の代謝物を生成する代謝経路の基質となる代謝物を生成する代謝経路に対応する機能をいう。特定の代謝物として、具体的には、例えば、糖、アミノ酸、脂質、ビタミンが挙げられる。

本発明の方法により魚類の栄養要求性が正しく決定されたことは、当該栄養要求性に応じて製造された飼料(例えば、魚類における要求性が高いと決定された代謝物が配合された飼料)と対照飼料(例えば、当該代謝物が配合されていない飼料)をそれぞれ用いて魚類を飼育し、その生育の程度を比較することで確認できる。

<2>本発明のプログラム 本発明のプログラムは、本発明の方法における各ステップをコンピュータに実行させるプログラムである。

すなわち、本発明のプログラムの一態様は、下記ステップ(1)〜(3)をコンピュータに実行させるプログラムである: (1)魚類のゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を、既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較することにより、該魚類の各タンパク質の機能を推定するステップ、 (2)前記推定された各タンパク質の機能に基づき前記魚類が有する代謝経路を同定するステップ、および (3)前記同定された前記魚類が有する代謝経路と、対照生物が有する代謝経路との違いに基づき、前記魚類の栄養要求性を決定するステップ。

また、本発明のプログラムは、対照生物のゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を、既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較することにより、対照生物の各タンパク質の機能を推定するステップをコンピュータに実行させてもよく、前記推定された各タンパク質の機能に基づき前記対照生物が有する代謝経路を同定するステップをコンピュータに実行させてもよい。

また、本発明のプログラムは、例えば、さらに、アミノ酸配列データをダウンロードして取得するステップをコンピュータに実行させてもよい。また、本発明のプログラムは、例えば、さらに、機能アノテーションの結果を代謝経路上にマッピングするステップをコンピュータに実行させてもよい。

本発明のプログラムは、コンピュータが読み取り可能な記録媒体に記録され、提供されてもよい。ここで、コンピュータが読み取り可能な記録媒体とは、データやプログラム等の情報が電気的、磁気的、光学的、機械的、又は化学的作用等により蓄積され、さらに蓄積された情報をコンピュータから読み取ることのできる記録媒体を言う。このような記録媒体としては、例えばフロッピー(登録商標)ディスク、光磁気ディスク、CD−ROM、CD−R/W、DVD−ROM、DVD−R/W、DVD−RAM、DAT、8mmテープ、メモリカード、ハードディスク、ROM(リードオンリーメモリ)、及びSSD等が挙げられる。本発明のプログラムは、コンピュータにより実行される各ステップが単一のプログラムとして記録されていてもよく、それぞれ別個の、あるいは、任意の組み合わせで別個のプログラムとして記録されていてもよい。

<3>本発明の方法の利用 本発明の方法により決定された魚類の栄養要求性を参考に、魚類の飼料を製造できる。例えば、本発明の方法により魚類における要求性が高いと決定された代謝物を原料に配合して飼料を製造することができる。また、例えば、本発明の方法により魚類における要求性が低いと決定された代謝物の配合量を低下させて飼料を製造することができる。飼料は、これら特定の代謝物を原料に配合すること、および/または、これら特定の代謝物の配合量を低下させること以外は、通常の魚類の飼料と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このようにして、これら特定の代謝物を含む、および/または、これら特定の代謝物の配合量が低下した飼料が得られる。このようにして製造された飼料は、魚類の養殖(飼育)に好適に利用できる。

例えば、液体飼料、粉末飼料、固形飼料、モイストペレット、ドライペレット、エクストルーデッドペレット、生餌等の、魚類の飼料として通常用いられる飼料原料を対象の魚類に応じて適宜選択、配合し、さらに、本発明の方法により対象の魚類における要求性が高いと決定された代謝物を配合すればよい。上記のような飼料原料を配合するための原料としては、一般的には魚粉、骨粉、スキムミルク、綿実粕、小麦粉、小麦胚芽、米ぬか、ビール酵母、ビタミン、大豆粕、植物残渣物等が用いられる。

本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。

実施例:トラフグの栄養要求性の予測 本実施例では、トラフグとヒトのゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列に基づいて各タンパク質の機能のアノテーションを行い、アノテーション結果に基づきトラフグとヒトが有する代謝経路を同定および比較することで、トラフグにとって特異的に要求性が高い栄養素の候補を決定した。手順および結果を以下に示す。

Ensemblのftpサイト(http://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html)から、FASTAフォーマットで記述された、ヒト(Homo sapiens)およびトラフグ(Takifugu rubripes)の全タンパク質のアミノ酸配列データを取得した。得られたアミノ酸配列データをiKeg(KEGGのローカルサーバ)のKEGG Automatic Annotation Server(KAAS)により処理し、各タンパク質について一括してKEGG Orthology(KO)に基づくアノテーションを行った。

フリーの統計解析ソフトウェア「R」(http://www.r-project.org/)を用いて、ヒトとトラフグに共通なKOおよびそれぞれに特異的なKOを選別した。

選別したKOを、KEGG mapper(http://www.genome.jp/kegg/mapper.html)用いて、トラフグとヒトに共通な代謝経路およびそれぞれに特異的な代謝経路が分かるように代謝経路上にマッピングした。

それぞれに特異的な代謝経路を元に、代謝経路の詳細を考慮しつつ、トラフグにおいて要求性が高い栄養素の候補を決定した。具体的には、ヒトの成長や生命活動において重要な代謝物を生成する代謝経路がトラフグで欠損している場合、または、トラフグに特異的な代謝経路の基質となる代謝物の供給が不十分である場合に、当該代謝物および/または当該代謝物からさらに代謝されて生成する代謝物を外部から獲得する必要があると判断し、トラフグにおいて要求性が高い栄養素の候補として選抜した。トラフグにおいて要求性が高い栄養素の候補を表1に示す。

以上の通り、ゲノム情報から推定されるタンパク質のアミノ酸配列に基づき、魚類の栄養要求性を決定することができた。

本発明により、魚類の栄養要求性を決定することができる。よって、本発明により、魚類の栄養要求性に合わせた配合飼料を提供することができる。