本発明は、体重増加を予防するため、ならびに/または肥満症、脂質蓄積症および高脂血症などの肥満関連疾患を治療するためのトマトの使用に関する。本発明は、さらに、本発明の組成物を使用して、哺乳動物における脂肪生成が関与する疾患を治療または予防するための方法に関する。

肥満とは、エネルギー摂取とエネルギー消費の間の不均衡の結果として、特定の年齢、性別および身長に対して体重が過剰であることである。肥満の主要な原因は、過食、運動不足、または摂食障害、いくつかの遺伝的障害、基礎疾病(例えば、甲状腺機能低下症)、何らかの投薬、坐位の生活、高血糖食(すなわち、食後高血糖をもたらす食物からなる食事)、ウエイトサイクリング(ダイエットによって体重を減少させようとする試みを繰り返すことや、摂食障害によって引き起こされる)、ストレスおよび睡眠が不十分であることのいずれかによるものである。

肥満は、多くの根本的なメカニズムの最終点である。肥満は、体内の脂肪組織量が制御されていないと特徴付けられ、世界中で最も急速に増加している代謝障害であると認識されている。脂肪組織量の増加は、脂肪生成のプロセスによる新しい脂肪細胞(fat cell)の産生、および/または細胞ごとの細胞質内トリグリセリド量または脂肪滴沈着量の増加の結果であり得る。脂肪生成は、前脂肪細胞(preadipocytes)が脂肪細胞になる細胞分化のプロセスである。脂肪生成プロセスでは、前脂肪細胞または前駆脂肪細胞(precursor fat cells)の増殖の後に、これらの細胞が成熟脂肪細胞(mature adipocyte)の表現型に分化する必要がある。成熟脂肪細胞における脂質蓄積の増加は肥満障害の最も重要な特徴である。

脂肪は、脂肪組織内にトリグリセリドの形態で貯蔵される。この脂肪細胞内で脂肪がグリセロールおよび脂肪酸へと分解することは、脂肪分解として公知である。このプロセスの間に、遊離脂肪酸が血流に放出され、全身を循環する。エピネフリン、ノルエピネフリン、グルカゴンおよび副腎皮質刺激ホルモンなどのホルモンにより、脂肪分解が誘導される。これらのホルモンにより、7TM受容体が誘発され、これによりアデニル酸シクラーゼが活性化される。これにより、cAMPの生成が増加し、これによりプロテインキナーゼAが活性化される。その後、プロテインキナーゼAにより、脂肪組織内に見いだされるリパーゼが活性化される。

前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化を阻害することによって新しい脂肪組織の形成および貯蔵脂肪の形成を減少させることは、脂肪生成が介在する疾患、特に肥満症を制御するための良好な戦略であり得る。したがって、ヒトにおける脂肪生成および脂肪分解の調節により、肥満の負担が低下し得る。

運動を伴うまたは伴わない低カロリー食は一過性の体重減少に役立ち得るが、食事および運動だけでは、体重管理における長期間にわたる解決の成功は証明されていない。さらに、食欲を抑制する薬物、食物摂取を減少させる薬物、食事性脂肪の吸収を減少させる薬物、エネルギー消費量を増加させる薬物および栄養素配分または代謝に影響を及ぼす薬物を補給することには、潜在的な有効性があるが、残念ながらこれらには有害な副作用が伴う(C. A. HallerおよびN. L. Benowitz.、New England J. Medicine、2000、343、1833-1838)。フェンテルミン(Fastin、Adipex P)などの薬剤が体重を制御するために処方されているが、これらには、高血圧、頭痛、不眠症、被刺激性および神経質のような副作用がある。体重を制御するための他の重要な薬物は、Xenical(Roche Pharm. Co. Ltd.、Swiss)およびReductil(Abbot Co. Ltd.、USA)であり、これらにより、共通の副作用であるガス発生、痙直、下痢および血圧の上昇が引き起こされる。これらの治療は全て、合成起源の活性成分に基づく。

十分な有効性および許容される安全性を伴う効果的な抗肥満療法が長年の懸案になっている。より重要なことに、増加している脅威を制御するためには、安全性が証明された天然起源の抗肥満剤が大いに必要である。例えば、ギムネマ抽出物、ガルシニア抽出物、またはカルニチンを含有する多くの薬草および天然物により、脂肪の吸収が阻害されること、脂肪の分解が増強されること、および身体による脂肪の消費が増強されることによって脂肪の蓄積が予防されることが公知である。哺乳動物、特にヒトに普通に経口摂取される食品に抗肥満作用を付与することができれば、肥満の抑制、改善および予防に特に有利である。抗肥満食品は、さらに以下の基準の1つまたは複数を満たすことが好ましい:(i)低カロリー値のものであること、(ii)天然起源のものであること、(iii)非遺伝子組換えであること、(iv)入手が容易であること、(v)経済的に魅力的であること。

本発明者らは、驚いたことに、成熟障害を有するトマト(例えば、成熟障害変異rin、nor、およびNrを有する)に抗脂肪生成効果があることを観察した。例えば、ripening inhibitor(rin)変異を保有するトマトの果実を、脂肪細胞分化アッセイで評価した。脂肪細胞の分化は、比較的特殊化されていない細胞が、脂肪の合成および貯蔵に特化した動物の結合組織細胞である脂肪細胞の特殊な特徴を獲得するプロセスである。驚いたことに、トマトの成熟障害の程度、例えばrin含量は、脂質蓄積を阻害するその能力と正に相関することが見いだされた。

図1は、樹立されたマウス3T3−L1線維芽細胞モデル系を使用した、rinトマト抽出物によるin vitroにおける脂肪生成の阻害を示すグラフである。TNFアルファを、インスリン誘導性の脂肪の蓄積を阻害する陽性対照として使用した。陰性対照:インスリン誘導性細胞。溶媒対照:0.1%DMSOを添加したインスリン誘導性細胞。Elegance:対照トマト品種「Elegance」0%rinの抽出物を用いたインスリン誘導性細胞。Gusto Delight:rinトマト品種「Gusto Delight」(75%rin)の抽出物を用いたインスリン誘導性細胞。Tomango:rinトマト品種「Tomango」(rinホモ接合体;100%rin)の抽出物を用いたインスリン誘導性細胞。

したがって、一実施形態では、本発明は、哺乳動物において体重増加を予防するため、および/または肥満関連疾患を治療するための方法において使用するためのトマト植物、果実、断片またはその抽出物であって、トマトが成熟障害変異体である、トマト植物、果実、断片またはその抽出物を提供する。成熟障害変異トマトは当技術分野で公知である。例えば、成熟障害変異トマトは、ripening inhibitor(rin)遺伝子、nonripening(nor)遺伝子、および/またはnever ripe(Nr)遺伝子を保有する。例えば、トマト植物をガンマ線照射に曝露し、成熟障害表現型を示す後代を選択することによって新規の成熟障害変異体を生成することも可能である。

トマト(Lycopersicon esculentum)は、米国原産であり、その食用果実を目的に世界中で栽培されているナス科(Solanaceae family)(ナス科(Solanaceae))の植物である。その果実は、色の濃い液果であり、一般には、リコピンおよびカロテン色素が存在することに起因して、色合いが帯黄色から赤色へ変化する。トマトには軽い酸味があり、野生種の直径は1〜2cmであり、栽培品種はそれよりもはるかに大きい。トマトは、生でも、例えば、ソース、ピューレ、ジュース、乾燥または缶詰といった様々な方法で加工された状態でも、世界中で生産され、消費されている。トマトは、カロリー量の少ない食物である。実際、トマト100グラムはたった18kcalである。その重量の大部分は水であり、2番目に重要な構成物は炭水化物である。トマトは、軽い甘味を付与する単糖および特徴的な酸味をもたらすいくつかの有機酸を含有する。トマトは、カリウムおよびマグネシウムのような特定の無機質の重要な供給源である。そのビタミン含量のうち、B1、B2、B5およびビタミンCが主要である。

一態様では、変異トマトは、rin、norおよび/またはNr遺伝子を保有する。例えば、トマトは、rin、norおよび/またはNrに関してヘテロ接合性である。例えば、トマトは、norに関してヘテロ接合性またはホモ接合性である。一実施形態では、トマトのnor含量は、少なくとも50%、好ましくは少なくとも65%、より好ましくは70〜100%である。別の実施形態では、トマトは、Nrに関してヘテロ接合性またはホモ接合性である。一実施形態では、トマトのNr含量は、少なくとも50%、好ましくは少なくとも65%、より好ましくは70〜100%である。別の実施形態では、トマトは、rin、norおよび/またはNrに関してホモ接合性である。Rinおよび/またはnorが好ましい。例えば、本発明は、ホモ接合性変異rin遺伝子、ホモ接合性変異nor遺伝子を有するトマトまたはrin遺伝子とnor遺伝子の両方がヘテロ接合性であるトマトを使用して実施される。

好ましい実施形態では、変異トマトはrinトマトであり、これは、rinトマトがヒトの飲食に受け入れられる果実に発育させることができるからである。

しかし、nonripening(nor)トマト植物、および/またはnever ripe(Nr)トマト植物も、特に、果実または根抽出物などの加工形態が適切に使用される。

ripening inhibitor遺伝子(rin)は、1968年にRobinsonおよびTomesにより「Ripening Inhibitor:A Gene with Multiple Effects on Ripening」、Rpt.Tomato Genetics Cooperative 18:36-37 に最初に記載された半優性トマト遺伝子である。rin遺伝子は、カリフォルニア大学デービス校のC.M.Rick Tomato Genetic Resource Center(TGRC)を含めたいくつかの供給源から入手可能である。rin遺伝子は、文献、例えば、上記のDaviesらの文献に記載されている。

rin変異を有するトマト植物は、成熟できない果実を生じる。正常なトマト果実において起こる組織軟化および色素合成がrinトマト変異体の果実では阻害されるが(Daviesら、1981、「The Constituents of Tomato Fruit-The Influence of Environment, Nutrition and Gene Type」、CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition、15:205-280)、ハイピグメント(high pigment)およびクリムソン(crimson)などの色を増強する遺伝子を組み入れることによって、ヘテロ接合性の状態にあるripening inhibitor遺伝子の有害作用を克服しうることが示される。

さらに、rin植物は、萼片の拡大および花序決定性の欠如を示す。rin遺伝子座のポジショナルクローニングにより、2つのタンデムなMADS−ボックス遺伝子(LeMADS-RINおよびLeMADS-MC)が明らかになり、その発現パターンにより、果実の成熟および萼片の発達におけるそれぞれの役割が示唆された。rin変異は、これらの遺伝子の両方の発現を変える。遺伝子抑制および変異体相補性により、LeMADS−RINは成熟を調節し、一方LeMADS−MCは萼片の発達および花序決定性に影響を及ぼすことが実証されている。LeMADS−RINでは植物のMADS−ボックス遺伝子の農業上重要な機能が実証されており、また、成熟の非ホルモン性の(発達的な)調節に関する分子的洞察がもたらされる(Vrebalovら、Science 2002年4月12日:296巻、5566号、343〜346頁)。

US4,843,186は、Rin/Rin遺伝子を含有する雄親と雌親を交雑させることによって生じるヘテロ接合性トマト植物であって、雄親由来のrin遺伝子をヘテロ接合体として有し、果実が非常に堅く、優れたトマト様の味を伴い、貯蔵期限が少なくとも2週間あり、味または堅さが実質的に劣化せずに完全な赤色になるという特性を有するトマト植物に関する。

US2003/0134026には、ホモ接合性のrinおよび/もしくはnorトマト、またはrinとnorの両方がヘテロ接合性であるトマトを使用して、良好な粘度ならびに良好な色を有するトマトペースト、トマトジュースまたはトマトソースを調製することが開示されている。

US2003/0129292には、ホモ接合性のrinおよび/もしくはnorおよび/もしくはalcトマト、またはrinおよびnorおよび/もしくはalcのいずれもヘテロ接合性であるトマトの、良好な粘度ならびに良好な色を有するトマトペースト、トマトジュースまたはトマトソースを調製するための使用が開示されている。

WO2004/017760は、rinに関してホモ接合性であるトマト、norに関してホモ接合性であるトマト、Nrに関してホモ接合性であるトマト、a/cに関してホモ接合性であるトマト、rin、nor、Nrもしくはalc遺伝子のうちの2つの組合せに関してヘテロ接合性であるトマト、またはこれらの組合せを少なくとも10%含む、加工トマト製品に関する。

Horibaら(Mol Cell Endocrinol. 2010 Jul 29; 323(2):208-14)により、ナリンゲニンカルコンが、脂肪細胞の代謝機能を改善し、アディポネクチン関連経路を活性化することによってインスリン感受性を発揮させる、トマトの皮に見いだされる強力なトマトフラボノイドであることが報告された。rin遺伝子とナリンゲニンカルコン含量の間には関連性がないことが公知である。さらに、本発明者らは、rinトマトの抗脂肪生成能が皮に限局されないことを見いだした。

したがって、先行技術では、成熟障害変異トマト、その抽出物または精製された画分の抗脂肪生成活性または脂質蓄積阻害活性に関しては開示または示唆できていない。より詳細には、脂肪生成が介在する疾患の予防または抑制におけるその適用は文献には含まれていない。

本明細書で使用される場合、ripening inhibitor(rin)変異トマトとは、変異ripening inhibitor(rin)トマト遺伝子を発現しているトマト(Lycopersicon esculentum)を指し、したがって、ヘテロ接合性rinからホモ接合性rinトマトまでにわたる範囲内のいかなる品種も包含される。一実施形態では、トマトは、rinに関してヘテロ接合性である。別の実施形態では、トマトは、ホモ接合性rinトマトである。本発明者らは、組織培養法を使用して、rin含量が50〜100%のトマト品種を作出することに成功した。

本明細書で使用される場合、「rin含量」という用語は、rin/rinホモ接合性トマト中の100%rinの任意の量に対するトマトrin mRNAの量と定義される。rinヘテロ接合体のrin含量は50%である。RINホモ接合体のrin含量は0%である。

rin含量は、rin遺伝子の既知の配列に基づいて当技術分野で公知の方法によって決定することが適切である。例えば、標準のPCR法を、rin変異が特異的に検出されるように設計されたプライマーのセットに基づいて用いることができる。定量リアルタイムPCR(RT−PCR)が好ましい。RT−PCRは、中程度の数の選択された遺伝子の発現を正確にプロファイリングするための現在の標準法であり、その主要な利点は、感度および特異度が高いこと、ならびに定量化の範囲が広いことである。RT−PCRプロトコールは当技術分野で周知である。例えば、Derveauxら、Methods 50(2010)、227-230を参照されたい。使用する実験技法にかかわらず、遺伝子発現レベルの正確かつ信頼できる定量値を得るためには、適切な標準化が必須である。標準化の目的は、実験手順の種々の工程に関連する変動性、例えば、最初の試料の量の差異、RNAの回収率、RNAの完全性、cDNAの合成効率、および分析した組織または細胞の全体的な転写活性の差異などを補正することである。PCR分析には、1種または複数種のトマトのハウスキーピング遺伝子または生来的に発現される遺伝子、例えば、GAPDH、EFα1、TBP、RPL8、APT、DNAJ、TUA、TIP41、SAND、CACおよびSGN−U346908SGNなどを検出することも伴うことが好ましい(Exposito-Rodriquezら(BMC Plant Biology 2008、8: 131)。rin遺伝子を検出することに加えて、1種または複数種のrin標的遺伝子の相対的な発現レベルを決定することができる。例えば、rin/rin変異体は、LeACS2、LeACS4、TBG4、LeEXP1、LeMAN4およびPSY1の発現の欠損が見いだされ、また、LeACO1、ETR3、PGおよびINVの発現レベルの低下を示すが、これらの遺伝子は野生型果実では非常に亢進され、これにより、これらの遺伝子の全てがrinによって直接的または間接的に調節されることが示される(Fujisawaら、BMC Plant Biology 2011、11:26)。したがって、一実施形態では、本発明は、哺乳動物において脂肪生成に関連する疾患を抑制する、予防する、または改善するための方法において使用するためのトマト植物、果実、断片またはその抽出物であって、トマトが、LeACS2、LeACS4、TBG4、LeEXP1、LeMAN4および/もしくはPSY1の発現の欠損、ならびに/またはLeACO1、ETR3、PGおよび/もしくはINVの発現レベルの低下を示す、トマト植物、果実、断片またはその抽出物を提供する。LeACS2、LeACS4、TBG4、LeEXP1、LeMAN4、PSY1、LeACO1、ETR3、PGおよび/またはINVの発現レベルは、rinトマトにおいて見いだされるレベルに相当することが好ましい。

発現レベルは、18Sシグナルの遺伝子特異的発現と比較した相対的な発現量として表すことが適切な場合がある。一実施形態では、果実の成熟プロセスに関連する標的遺伝子TDR−4の相対的な発現量の減少を使用する。

一実施形態では、トマトのrin含量は少なくとも53%であり、例えば、少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%である。rin含量が75〜100%であるトマトを用いると非常に良好な結果が得られる。特定の態様では、トマトは、品種「Slimmy」(rin含量53%)、「Mr.Slimmy」(rin含量53%)、「Gusto Delight」(rin含量75%)、「Snoepboompje」(rin含量75%)および「Tomango」(rin含量100%)からなる群から選択される。

本発明の前には、ホモ接合性rinトマト(rin/rin)は、均一に成熟する(u/u)品種におけるrin遺伝子を交雑させて貯蔵寿命が長い(成熟が遅い)ヘテロ接合性(u/rin)トマトを発生させるために主に使用されていた。通常の植物の品種改良では、一般に、2つのrin/rin親系統を交雑すると完全には成熟しない果実が生じるので、従来のトマト品種改良プログラムでは使用することができないため、得られるrin含量は最大で50%であった。本発明者らは、抗脂肪生成効果を実現するためにはrin含量が高いことが重要であることを理解しており、rinに関して強力にヘテロ接合性であるF2植物またはF3植物を選択すること、および分裂組織の培養により、rin含量が少なくとも53%、特に60〜100%のように50%を超える同一の植物を得ることによってこの問題を回避した。

本発明において使用するための成熟障害変異トマトは、植物に関する標準の技術、特に植物組織の培養を用いて得ることができる。一実施形態では、これには、ヘテロ接合性の種子産生植物の遺伝資源を供給するために特に適した分裂組織の培養が伴う。分裂組織は、分裂して全種類の組織を形成する可能性がある未分化の植物細胞の群(生長端において見いだされる)である。一般に、使用する外植体は、最も若い葉原基の1つまたは2つの対を伴う長さ0.1mm未満の光沢のあるドーム型の構造である。分裂組織(meristematic tissue)を単離し、適切な生長培地中、無菌条件下で栽培する。分裂組織はその切り口において、多数の苗条原基が発生するカルスを形成する。これらの原基は発育して多数の苗条になり、それが発根した後に、5枚または6枚の葉を有する小さな植物が生じる。苗条は生長して、培養される切除苗条端が直接形成される。苗条端の培養では、使用する外植体は、原始葉および発育中の葉および近接する幹組織を伴う分裂組織である。

本発明は、成熟障害変異トマト、例えばrinトマト、植物、果実、断片またはその抽出物を使用して実施することができる。本明細書で使用される場合、「断片」とは、葉、幹、根のような植物の小切片、または果実の小切片を指す。一実施形態では、根または果実を使用する。果実または果実抽出物を使用することが好ましい。抗脂肪生成効果は、果実の皮だけに限定されず、果皮(pericarp)にも存在することが見いだされた。したがって、トマト全体を使用することも果皮のみを使用することもできる。消費の容易さ、ならびに顧客の受け入れおよび評価のために、トマト果実全体を使用することが特に好ましい。例えば、抗肥満rinトマトは、通常のヒトの食事の一部として、例えば、新鮮な果実として、またはペーストまたはソースのようなその加工製品として消費され、したがって、脂肪の蓄積を減少させるという恩恵により従来のトマトに取って代わることが予想される。

変異トマトのサイズは、トムベリーの直径約5mmから、野生トマトとほぼ同じであるチェリートマトの1〜2センチメートル(0.4〜0.8インチ)サイズを経て、ビーフステーキトマトの直径10センチメートル(4インチ)以上に至るまで、変動し得る。最も広く育てられている商業用トマトの傾向は、直径の範囲が5〜6センチメートル(2.0〜2.4インチ)である。缶詰およびソース用に育てられるトマトは、多くの場合、細長く、長さが7〜9センチメートル(3〜4インチ)であり、直径が4〜5センチメートル(1.6〜2.0インチ)である;これらは、プラムトマトとして公知であり、水分含量が少ない。

一実施形態では、本発明は、哺乳動物において新しい脂肪組織の形成および貯蔵脂肪の形成を減少させるため、特に体重管理を補助し、体重減少を促進し、および/または肥満症を治療するための、成熟障害変異トマトの抽出物、ペースト、ソースまたはジュース、ならびにその使用を提供する。トマト抽出物は、例えば、原料トマトを適切な溶媒で抽出することによって得ることができる。別の実施形態では、トマト果実を、ペーストとしてまたは乾燥した形態で使用する。

抽出を行う原料トマトは、トマト植物全体、ならびに果実、果皮、果汁またはあらゆる他の任意の部分であってよい。果皮は、抗脂肪生成活性を有する構成成分(以下「抗脂肪生成活性構成成分」と称される)を多量に含有するので、特に好ましい部分である。さらに、原料トマトは、トマト果実を圧搾した後に得られる残留物であってもよい。圧搾残留物は、多量の果皮を含有するので特に好ましい。根は、味に比較的特徴がなく、また、粉末の状態で含有する吸湿性構成成分が粉末化した果実と比較して少ないので、別の特に好ましい部分である。一実施形態では、本発明は、哺乳動物において脂肪生成に関連する疾患を抑制する、予防する、または改善するための方法において使用するためのトマト植物の根またはその抽出物であって、トマトが、成熟障害変異体、好ましくはripening inhibitor(rin)変異トマトである、トマト植物の根またはその抽出物を提供する。

原料トマトが多量の水分を含有する場合には、効率を上げるために、乾燥させてから使用することが好ましい。より詳細には、例えば、自然に、または50〜150℃で1〜24時間にわたって熱風を用いて乾燥させることによって、含水量を減少させることが好ましい。抽出前に原料を凍結乾燥すると良好な結果が得られる。さらに、抽出効率を上昇させるために、原料トマトを細かく粉砕してから使用することが好ましい。粉砕手段に関する制限は特になく、そのような例としては、乳鉢を使用する方法、および回転ミキサーまたはホモジナイザーなどの破砕機械を使用した方法が挙げられる。原料トマトは16メッシュ以下のサイズまで粉砕することが好ましい。

抗脂肪生成活性構成成分を高濃度で抽出するために適した原料トマトは、トマト果実全体、果皮またはトマトの圧搾残留物を乾燥し、その後にそれらを破砕することによって得られるものである。

抽出のために使用する溶媒に関しては、抗脂肪生成活性構成成分を抽出することができるものであれば特に制限はなく、通常の極性溶媒または両性溶媒などを使用することができる。使用することができる溶媒の例としては、有機溶媒、有機溶媒を含有する溶媒または水と有機溶媒の混合溶媒が挙げられる。有機溶媒の特定の例としては、低級アルコール(特に、エタノール、メタノール、プロパノールおよびブタノール)、エーテル(特に、ジエチルエーテル)、ハロゲン化炭素(特に、クロロホルム)、ニトリル(特に、アセトニトリル)、エステル(特に、酢酸エチル)およびケトン(特に、アセトン)ならびにヘキサン、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミドが挙げられる。作業効率の観点から、エタノール、メタノールおよび酢酸エチルを有機溶媒として使用することが好ましい。2種類以上の有機溶媒を組み合わせて使用することができる。抗脂肪生成活性構成成分の抽出効率を考慮して、低級アルコール、特にエタノール、メタノール、プロパノールおよびブタノール、好ましくはメタノールまたはエタノールが溶媒として特に好ましい。水と有機溶媒の混合比に関する制限は特にないが、有機溶媒は20%以上の割合で含有されることが好ましく、50〜99%の割合で含有されることが特に好ましい。溶媒がアルコール溶媒、好ましくはメタノール溶媒、より好ましくは80:20v.vのような70:30〜95:5(v/v)の範囲のMeOH/水である場合に良好な結果が得られた。

したがって、本発明は、抗脂肪生成剤を製造するための方法であって、トマト植物、果実またはその断片の原料を溶媒で抽出することを含み、トマトが、例えば、少なくとも50%のrin含量を有する成熟障害変異トマトである方法にも関する。トマト抽出物を最終的に食物または化粧品などに添加することを考えると、エタノールが特に好ましい。この場合、100%メタノールに加えて、アルコール水溶液、好ましくは40〜90%メタノール溶液、および特に好ましくは60〜90%エタノール溶液を使用することができる。

抽出中の原料トマトと溶媒の混合比に関する制限は特にないが、溶媒は、原料トマトの重量に基づいて、重量で2〜20倍の量、好ましくは重量で5〜15倍の量で使用することが好ましい。例えば、トマト果実の凍結乾燥抽出物1グラム当たり溶媒2〜20mlを使用する。メタノールを溶媒として使用する場合、抽出温度は、室温付近(18〜23℃)であることが好ましく、抽出時間は、30分〜24時間の範囲内であることが好ましい。抽出プロセスは、超音波処理および/または激しい振とう下で(部分的に)実施することが好ましい場合がある。

さらに、有機溶媒を含有する溶媒を用いて抽出する前に、原料トマトを冷水または熱水で抽出することによって水溶性の不純物を除去することができる。この場合、水抽出後に残留物を回収し、溶媒抽出に供すことができる。

抽出プロセスでは、抗脂肪生成活性構成成分が溶媒中に溶出する。抗脂肪生成活性構成成分は有機溶媒によって、特にアルコールを含有する溶媒によって効率的に抽出されるので、これらの構成成分は、多量に、特にトマトのアルコールに可溶性の構成成分に存在することが予測される。

抽出効率を向上させるために、抽出工程を数回繰り返すことが好ましい。抽出後、吸引濾過などを実施することによってトマト抽出物を含有する溶媒を回収する。上記の手順の結果として、液体のトマト抽出物を得ることができる。あるいは、溶媒を部分的に、または完全に除去して(例えば、真空下で)、濃縮された液体のトマト抽出物または乾燥したトマト抽出物を得る。さらに、必要に応じて、生じた画分を合成吸着剤またはイオン交換樹脂などによってさらに精製することができる。

乾燥した抽出物の抗脂肪生成活性を決定するために、乾燥した抽出物を小用量DMSOのような適切な溶媒に溶解させることが適切である。生じたトマト抽出物は、溶媒を含有する状態にあろうが、濃縮されていようが、または抽出物から溶媒が除去された乾燥製品であろうが、その状態にかかわらず抗脂肪生成剤として使用することができる。しかし、有機溶媒の貯蔵性および安全性を考慮して、トマト抽出物は乾燥した状態で得ることが好ましい。本発明の抗脂肪生成剤は、成熟障害変異トマト果実、根、部分またはその抽出物を活性成分として含むことを特徴とし得る。

したがって、本明細書では、トマト植物、果実またはその断片の抽出物を活性成分として含む抗脂肪生成剤であって、トマトが成熟障害変異トマトである抗脂肪生成剤も提供される。トマト植物、果実、断片またはその抽出物は、rin、norおよび/またはNr遺伝子を保有する変異トマトから得ることが適切である。例えば、トマトは、rin、norおよび/またはNrに関してヘテロ接合性またはホモ接合性である。一実施形態では、トマトのrin、norおよび/またはNrの含量は少なくとも53%、好ましくは少なくとも65%、より好ましくは70〜100%である。特定の一実施形態では、トマトのrin含量は、少なくとも53%、好ましくは少なくとも65%、より好ましくは70〜100%である。トマトは、rinホモ接合体であることが好ましい。

果実および/または根を抽出に使用することが特に好ましい。抽出物は液体の抽出物であっても乾燥した抽出物であってもよい。抽出物は、1種または複数種の添加剤または補助的な構成成分を含有してよく、これらを使用して、色、匂い、外観、風味、テクスチャーおよび/または貯蔵安定性を改善することができる。例示的な構成成分としては、充填剤、防腐剤、抗酸化剤、香味料、甘味剤および酸味調節剤が挙げられる。

一実施形態では、抽出物は、アルコール抽出物、好ましくはメタノール抽出物、より好ましくは70:30〜95:5(v/v)の範囲、より好ましくは80:20(v/v)のMeOH/水によって調製された抽出物である。抗脂肪生成剤は、培養マウス3T3線維芽細胞において、インスリン誘導性脂肪生成を阻害することができる。インスリン10μg/mlを10日間投与することによって誘導されるin vitroにおける脂肪生成が、当該作用剤または再構成剤またはその希釈物(例えばDMSO中1:1000〜1:20.0000)によって少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%阻害されることが好ましい。脂肪生成は、例えばオイルレッドOを使用して脂肪滴を染色することによって測定することが好ましい。

本発明は、哺乳動物において体重増加を予防するため、および/または肥満関連疾患を治療するための方法における、成熟障害変異トマト、好ましくはrinトマト、植物、果実、断片またはその抽出物の使用も提供する。一実施形態では、当該使用は、脂肪生成に関連する疾患を抑制する、予防するまたは改善させることを含み、哺乳動物はヒトまたは動物である。ヒトまたは動物は過体重または肥満であることが好ましい。愛玩動物の肥満症は、多くの国において一般的である。米国におけるイヌの過体重および肥満の比率は、23%から41%までに及び、約5.1%が肥満である。ネコの肥満症の比率は、わずかに高く、6.4%である。オーストラリアでは、獣医学的環境におけるイヌの肥満症の比率は7.6%であることが分かっている。したがって、変異トマトの獣医学への適用も予想される。トマト抽出物は、食事中に容易に組み入れることができるので、獣医学に適用するために特に好ましい。一態様では、哺乳動物は、ネコまたはイヌのような家で飼うペットである。

しかし、哺乳動物は、ヒト個体、特に、体重が増加するリスクおよび/または肥満に関連する、特に脂肪生成に関連する疾患になるリスクが高いヒト個体であることが好ましい。例えば、ヒト個体は、肥満症、脂質蓄積症、高脂血症、2型糖尿病、心疾患、脳卒中、高血圧症、がん、メタボリックシンドローム、胆嚢疾患、痛風、睡眠時無呼吸、喘息または小児肥満症に罹患しているまたはそれが発生する素因がある。一実施形態では、ヒトは少なくとも16歳であり、成人であることが好ましい。

対象における体重減少を誘導するため、および/または体重増加を予防するための方法であって、対象に、成熟障害トマト植物、果実、断片またはその抽出物、および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を治療有効量で投与することを含む方法も提供される。対象は、ヒト対象であることが好ましい。製剤は対象に毎日1〜4回投与されることが好ましい。製剤は、一般には、少なくとも2週間、好ましくは少なくとも1ヶ月にわたって投与される。

本発明によると、トマト果実またはその抽出物は、哺乳動物において肥満関連疾患を予防および/または治療するための経口投与用の組成物を調製するために、栄養補助食品成分、機能性食品成分として、または医薬成分として提供することができる。したがって、本発明のさらに別の態様は、トマト植物、果実、断片またはその抽出物を含む医薬品または栄養補給食品組成物であって、トマトが成熟障害変異トマトである、医薬品または栄養補給食品組成物に関する。組成物は、成熟障害変異トマト果実または根抽出物を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、トマトは、rin変異トマトである。例えば、組成物は、ヘテロ接合性またはホモ接合性rinトマト果実、根またはその(アルコール)抽出物を含む。rin含量は少なくとも65%、好ましくは70〜100%であることが好ましい。例えば、トマトは、品種「Slimmy」、「Mr Tasty」、「Gusto Delight」および「Tomango」からなる群から選択される。

トマト植物、果実、断片またはその抽出物の量は、特定の必要性または所望の効果に応じて変動し得る。およそ70kgのヒトで脂肪生成効果を生じさせるためには、rinホモ接合体の中玉トマト(すなわち約20〜100グラム)を毎日約1〜4個摂取することで十分であることが見いだされた。したがって、一実施形態では、組成物が毎日投薬または消費するための形態である場合、組成物は、体重1kg当たりトマト果実少なくとも0.25グラム、好ましくは少なくとも0.5グラム、より好ましくは少なくとも1グラム相当を含む。当然、頻度がより少ないまたは多い投薬が意図されている場合には、それに応じて相当量を適合させることができる。同様に、相当量は、当然に抽出物、好ましくはアルコール抽出物の形態で存在できる。

一実施形態では、組成物は、例えば、抗脂肪生成性の食事の一部として、またはそれを補助するものとして、ヒトに使用することが意図されている。組成物は、1つまたは複数の別の有益な成分を含むことが好ましい。組成物は、プロバイオティクスおよび/またはプレバイオティクス、好ましくは食物繊維を含むことが好ましい。

腸内微生物叢が体重の調節において複雑な役割を果たすことが示されている(P. J. Turnbaugh、F. Backhed、L. Fulton、J. I. Gordon、Cell Host Microbe 3、213(2008))。肥満マウスおよび痩せマウス由来の微生物叢を、微生物を有さないマウスに移植する実験によっても、消化(GI)管内の微生物叢の組成の変化により、食物からのカロリー抽出の効率の差異が生じ、これが最終的に体重差の一因となることが証明された。これらの結果により、生体異物により操作された腸内細菌によるGI管におけるカロリー抽出の小さな変化により、有意義な体重の減少がもたらされ得ることが示唆される。したがって、一実施形態では、本発明は、トマト植物、果実、断片またはその抽出物であって、トマトが成熟障害変異であるトマト植物、果実、断片またはその抽出物と、哺乳動物において体重減少を促進することができる少なくとも1つのプロバイオティクスとを含む組成物を提供する。一実施形態では、プロバイオティクスは、例えば、Lactobacillus acidophilus FARM1 KCTC 11513BP、Lactobacillus acidophilus FARM2 KCTC 11514BPおよびLactobacillus acidophilus FARM3 KCTC 11515BP、Lactobacillus helveticus CNCM I−4095 Lactobacillus rhamnosus CNCM I−4096およびLactobacillus gasseri SBT2055(LG2055)からなる群から選択される乳酸桿菌である。

その代わりにまたはそれに加えて、組成物は、食物繊維のようなプレバイオティクスを含有してよい。食物繊維は、健康的かつバランスのとれた栄養の重要な部分であり、結腸および小腸の細胞、すなわち結腸細胞および腸細胞の健康におけるその役割が重要である。食物繊維により、それらの損傷を予防することができる。食物繊維は、一般に、植物性または野菜性食物の消化されにくい部分であるとみなされる。食物繊維は炭水化物であり、より詳細には、主に植物細胞壁に由来し、ヒト消化酵素によって加水分解されない、非デンプン多糖およびオリゴ糖、ならびにリグニンである。しかし、多くの場合、食物繊維は腸内細菌によって発酵されて水素、メタン、二酸化炭素、水および短鎖脂肪酸(SCFA)が生じ得る。食物繊維の機能は小腸と大腸で異なる。食物繊維の小腸における主要な機能は粘性を増強させることであるが、大腸では、短鎖脂肪酸を生成するために腸内フローラの基質としての機能を果たす。

本発明では、可溶性食物繊維を、多糖といった長鎖の形態、オリゴ糖といった短鎖の形態でも使用することが好ましい。可溶性繊維が消費されると、消化されなかった部分が腸内フローラの基質としての機能を果たす。可溶性繊維の種類に応じて、異なる細菌群が刺激される。したがって、本発明は、最適な結果を得るために、優先的な少なくとも2種類の繊維を使用することを提案するものである。いくつかの臨床試験により、フルクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOSまたはGaOS)、グルコオリゴ糖(GOSまたはGluOS)またはキシロオリゴ糖(XOS)などのオリゴ糖を投与することにより、善玉菌または有益な細菌の数を増加させる一方で有害な細菌の集団を減少させることができることが示された。検討されているオリゴ糖などのいくつかの食物繊維もプレバイオティクスと定義されている。食物成分がプレバイオティクスとして分類されるためには、以下の基準を満たさなければならない:(i)上部消化管において加水分解もされず、吸収もされないこと、(ii)結腸に対して潜在的に有益な1つまたは限られた数の細菌によって選択的に発酵されること、および(iii)善玉菌を増加させ、有害な菌または腐敗菌を減少させることによって結腸内ミクロフローラをより健康な組成に変更することができること。食物繊維により、そのような広範囲の栄養上および健康上の利益がもたらされるので、多くの食品に食物繊維が添加され、また、独立した栄養補助食品またはプレバイオティクス組成物として提供される。

例えば、組成物は、加工された成熟障害変異トマト果実および少なくとも1つのプレバイオティクスおよび/または少なくとも1つのプロバイオティクスを含む食用のトマトベースの食品である。例示的な食品としては、トマトジュース、トマトケチャップ、乾燥トマト、トマト漬け、トマトペースト、トマトピューレ、トマトベースのソース、スープ、飲料およびトマトベースのスプレッドが挙げられる。加工トマト製品、例えば、トマトジュース、トマトピューレ、トマトペーストおよびトマトケチャップなどは、一般に、トマト果実を洗浄し、洗浄したトマト果実を予備加熱し(主に酵素を不活化するために)、予備加熱し洗浄した材料から果汁を抽出し、加熱する(主に滅菌するために)かまたはさらに凝縮させ、そのような抽出された果汁を混合した後に同様に加熱することによって生産される。

別の実施形態では、本発明は、トマト植物、果実、断片またはその抽出物を含む動物用食品組成物であって、トマトが成熟障害変異トマト、好ましくはripening inhibitor(rin)変異トマトである、動物用食品組成物を提供する。例えば、動物用食品組成物は、ペットの体重を制御するために使用されることが適切である「軽い」家で飼うペット用処方である。

実験セクション rin含量の決定 以前に説明された通りに(Kitagawaら、Characterization of tomato fruit ripening and analysis of gen expression in F1-Hybrids of the ripening inhibitor(rin)Mutant. Physiol Plantarium 2005、 123(3):331-338)、RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を使用して、正常植物(遺伝子型RIN/RIN)(緑熟、桃熟および完熟)を含めた、rin含量が異なる品種、およびこれらの段階に対応する時期のrin変異体植物(rin/rin)のトマト果実から全RNAを抽出し、精製した。PrimeScript II first cDNA strand synthesis kit(Takara Biotech)を使用して全RNAから相補DNAを合成し、次いでリアルタイムPCRに鋳型として適用した。rin遺伝子の発現レベルを、rinに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(GenBank受託番号AF448522)を使用した定量リアルタイム逆転写PCR(qRT-PCR)によって解析した。

トマト抽出物の調製 新鮮なトマト果実を切って約1×1×1cmの小片にした。果実全体を使用した。小片を凍結乾燥した後、凍結乾燥した材料を、乳棒と乳鉢を使用して粉砕して均一の粉末にした。粉末を抽出溶媒(メタノールまたはメタノール/水 80:20 v/v/ 混合物)で抽出した。一般には、溶媒13mLを使用して粉末1グラムを抽出した。抽出は室温で実施した(超音波を30分、その後、激しい振とうを30分)。抽出混合物を遠心分離し、上清を真空下で乾燥させた。乾燥した抽出物をDMSO(Q:体積?)に再溶解させた後に、脂肪生成アッセイで使用した。抽出物の濃度は、375mg/mlの元の粉末に対応する。

in vitroにおける脂肪生成アッセイ Niwanoら(Niwanoら、Extensive screening for plant foodstuffs in Okinawa、Japan with anti-obese activity on adipocytes in vitro. Plant Foods Hum Nutr. 2009 Mar;64(1):6-10)によって以前に説明されたプロトコールに従ってアッセイを実施した。

アッセイでのトマト抽出物の最終濃度は、DMSO抽出物と比較して1:10.000であった(すなわち、1ml当たり元の粉末37.5μgに対応する)。最終的なDMSO濃度は0.1%であった。TNFα(10ng/ml)を、脂肪生成を阻害する陽性対照として使用した。

マウス3T3−L1線維芽細胞(Dainippon Pharma Co., Ltd.、Osaka, Japan)を、10%CSを添加したDMEM中、1ml当たり細胞30,000個になるように調整し、細胞浮遊液200μlを96ウェル培養プレートに播種し、加湿した5%CO₂インキュベーター中、37℃で2日間インキュベートした。培地を、10%FCS、0.5mMのIBMXおよび1μMのDEXを添加したDMEMに変え、さらに2日間インキュベートした(分化の開始)。培地を、10%FCSおよび10μg/mlのインスリンを添加したDMEMに変え、さらに2日間インキュベートした。その後、培地を、通常の培養培地(10%FCSを添加したDMEM)に変え、24時間ごとに新鮮なものと交換した。各試料溶液(トマト抽出物または対照)を分化の開始(0日目)から10日目まで添加した。