技术领域
[0001] 本
发明涉及一种具有
治疗早中期慢性肾衰竭，改善肾功能，延缓肾
纤维化作用的中药复方制剂及其制备方法。该组方由黄芪、大黄、胡芦巴、怀
牛膝、王不留行、土茯苓和莪术七味中药组成。
背景技术
[0002] 糖尿病是一种严重影响人类健康的内分泌代谢性
疾病，近年该病的发病率和致死率在世界范围内持续上升，2011年世界糖尿病人数约3.66亿，估计到2030年糖尿病人数将增加到5.52亿，其中48％的增长发生在中国和印度。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症，亦是引起终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的最主要原因。我国糖尿病伴有慢性肾病的不同人群患病率约25-60％，即使在糖尿病早期也有20％的病人伴有肾损害。从初期出现蛋白尿发展到肾性
高血压、肾病综合征，最终引发肾衰竭甚至死亡的时间较短，其3年生存率仅50％左右，由此带来巨大的医疗资源耗费，也给个人、家庭和社会造成巨大的经济负担和挑战。在糖尿病肾病发展到终末期肾病的过程中，肾间质纤维化起着极为重要的作用，亦是其最主要的病理
基础。
[0003] 糖尿病肾病(DN)是糖尿病最主要的微血管并发症，其血管持续处于高糖状态下而产生各种微血管病变，主要病理特征为肾间质纤维化。肾间质纤维化是包括DN在内的几乎所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路，是导致终末期肾病(ESRD)的主要病理基础。细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)在肾间质的过度沉积是引起肾间质纤维化的主要原因，
成纤维细胞是肾间质中产生ECM的主要细胞，在肾间质纤维化过程中发挥着重要作用。
[0004] 包括糖尿病肾病在内的各种肾脏病变不论其始发因素是否持续存在，进展至慢性肾衰竭阶段都有共同的病理特征，即肾间质纤维化。中医学并没有“肾间质纤维化”的病名，但根据其辨证论治的理论特点，其病机不外乎“虚、瘀、湿、毒”四方面。虚，主要以脾肾两虚为主，但可有五脏俱虚的表现。瘀，主要是气滞血瘀为主，表现为面色晦暗，肌肤甲错，舌质暗淡，肢体麻木，血尿等症。湿，主要是湿浊或痰浊，具体表现可见大便溏薄，肢肿，身重困倦，胸闷，纳呆，口黏，头晕等症状。毒，是指肾纤维化程度加重，引起肾小球硬化和肾功能衰竭时表现的诸如恶心呕吐、神昏惊厥等尿毒症症状。尿毒症时体内的胍类、尿素、尿酸、胺类等代谢废物从微观
角度证实了毒的病理机制。以上虚、瘀、湿、毒四方面相互交织，相互促进，合并而成程度不同的肾病，最终导致肾纤维化。
[0005] 根据糖尿病肾病肾间质纤维化虚、瘀、湿、毒的病机特点，中医采用补益脾肾、活血消癥、利湿泄浊、清
热解毒等方法进行辩证治疗。临床报道有较好效果的中药复方治疗包括清透方、尿毒清、怡肾汤、排毒合剂、加味六味地黄汤、解毒通瘀复肾汤、尿毒灵颗粒、肾衰胶囊和肾复汤等。常用中药包括黄芪、大黄、仙灵脾、桃仁、丹参、红花、三七、牛膝、绞股蓝、地龙、
水蛭、土茯苓和白花蛇舌草等，其中尤以黄芪和大黄2味中药最常使用。黄芪具有多种作用，包括提高
机体免疫功能；抗脂质过
氧化，清除氧自由基；扩张血管，改善微循环，从而改善肾血流动
力学；增加胰岛素敏感性、改善血脂代谢紊乱；修复和激活损伤的红细胞，改善CRF患者的贫血状态；可促进肝脏合成
白蛋白能力从而改善患者营养状况。黄芪可保护肾小球电荷和机械屏障，减少蛋白尿；显著抑制TGF-β1致纤维化因子，促进细胞外基质(ECM)降解，减少ECM累积，抑制肾间质纤维化。大黄中的主要成分大黄素明显抑制肾间质成纤维
细胞增殖，诱导其凋亡，并能抑制多种细胞生长因子及ECM成分。大黄酸能逆转TGF-β1诱导的RTEC肥大，抑制其刺激的ECM合成；能通过下调核转录因子κB和caspase-3活性，减轻RTEC凋亡；阻止TGF-β1诱导RIFS增殖，抑制TGF-β1激活RIFS以及拮抗其导致的纤维连接蛋白的表达与合成，从而抑制肾间质纤维化。
[0006] 本发明旨在提供一种利用传统中医理论和传统中药制法，结合现代中药生产工艺，以多种药材为主要有效组分制成的中药复方制剂；其功能主要是治疗早中期慢性肾衰竭，改善肾功能，延缓肾纤维化的作用。
发明内容
[0007] 一、组方
[0008] 本发明提供了具有治疗早中期慢性肾衰竭，改善肾功能，延缓肾纤维化作用的中药组合物及其制备方法，具体地说，就是以黄芪、大黄、胡芦巴、怀牛膝、王不留行、土茯苓、莪术共七味中药材为主要有效成分制成的复方药物制剂。
[0009] 本发明除主要有效组分为黄芪、大黄、胡芦巴、怀牛膝、王不留行、土茯苓、莪术共七味中药材外，还包括药物制剂所需的矫味剂、
防腐剂、稳定剂、稀释剂、
粘合剂、湿润剂、崩解剂、
润滑剂等常用辅料。
[0010] 本发明除主要有效组分为黄芪、大黄、胡芦巴、怀牛膝、王不留行、土茯苓、莪术共七味中药材制成复方药物制剂外，还包括使用常用药物制剂辅料制备药物制剂的生产工艺。
[0011] 本发明的目的是由下述技术方案完成的。
[0012] 一种具有治疗早中期慢性肾衰竭，改善肾功能，延缓肾纤维化作用的中药复方制剂，其特征在于：主要由下列中药材按重量份组成：
[0013]序号 组分 重量比例
1 黄芪 3-12份
2 大黄 1-6份
3 葫芦巴 1-4份
4 怀牛膝 1-6份
5 王不留行 1-4份
6 土茯苓 3-12份
7 莪术 1-4份
[0014] 加入药物所需的药用辅料矫味剂、防腐剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂，制成口服液剂、片剂、胶囊或颗粒剂。
[0015] 本发明优选的配方主要由下列中药材按重量份组成：
[0016]
[0017]
[0018] 加入药物所需的药用辅料矫味剂、防腐剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂，制成口服液剂、片剂、胶囊或颗粒剂。
[0019] 二、制备工艺
[0020] 本发明的汤剂生产工艺：
[0021] 1)经鉴定后将
风干药草弄成粉末状，用10倍水回流提取1h，水提液过滤收集。
[0022] 2)用上述方法重复提取两次，然后在减压条件下
蒸发至干燥。最后，制备的复方提取物1g相当于5g原药材。
[0023] 3)将粉状的该复方提取物分散并在水中溶解。
[0024] 本发明的颗粒剂生产工艺：
[0025] 1)将方中黄芪、胡芦巴、制大黄、怀牛膝、王不留行、土茯苓、莪术七味药
粉碎成最粗粉备用。
[0026] 2)加10倍水，回流提取3次，每次1h，滤过，合并虑液，减压浓缩为稠膏，
真空干燥。
[0027] 3)与适量辅料(矫味剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂等)混匀，制成片剂、胶囊或颗粒剂。
[0028] 本发明所需的药用辅料矫味剂、防腐剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂。
[0029] 矫味剂是指蜂蜜、
蔗糖、阿司帕坦、糖精钠、三氯蔗糖中的一种或几种。
[0030] 防腐剂是指苯
甲酸、
苯甲酸钠、山梨酸、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯中的一种或几种。
[0031] 稳定剂是指聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚山梨酯80中的一种或几种。
[0032] 稀释剂是指
淀粉、预胶化淀粉、乳糖、糊精、微晶
纤维素、甘露醇、山梨糖醇、
硫酸钙、硫酸氢钙中的一种或几种。
[0033] 粘合剂是指淀粉浆、羟甲基纤维素、聚维
酮、明胶、聚乙二醇中的一种或几种。
[0035] 崩解剂是指羟甲基淀粉钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙甲纤维素、交联
羧甲基纤维素钠、交联聚维酮中的一种或几种。
[0036] 润滑剂是指
硬脂酸镁、滑石粉、微粉
硅胶、氢化
植物油中的一种或几种。
[0038] 本发明产品的主要质量指标以含黄芪甲苷、葫芦巴
碱含量为考察指标。
[0039] 测定方法：照高效液相色谱法(中国药典2015版一部附录I J)
[0040] 1)黄芪甲苷含量测定：ZORBAX Elipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-水(36∶64)进行等度洗脱，流速1.2mL/min，柱温为30℃，ELSD检测器漂移管
温度为75℃；空气流量1.7Ml/min，增益为2；进样量为20μL。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算不低于4000。精密称取黄芪甲苷对照品6.3mg，用甲醇溶解并稀释，制成1mL含黄芪甲苷0.63mg的对照品贮备液。精密称取复方干浸膏4g，置具塞锥形瓶中并加甲醇40mL，超声提取1h，过滤，再加40mL甲醇继续超声0.5h，过滤，合并两次滤液，提取液浓缩至干，残渣加10mL水溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用
氨试液充分洗涤2次，每次40mL，弃去氨液，残渣加5mL水溶解，过D-101大孔
吸附树脂，以水50mL洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30mL洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80mL洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇超声溶解，转移至5mL的量瓶中定容，用微孔滤
膜过滤，即得，取20μL注入高效液相色谱仪测定含量，结果见下表。
[0041]
[0042] 2)葫芦巴碱含量测定：ZORBAX Elipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为为甲醇-0.05％十二
烷基磺酸钠溶液-
冰醋酸(20∶80∶0.1)等度洗脱，流速1.0mL/min，柱温为30℃，检测
波长为265nm；进样量为25μL，理论塔板数按葫芦巴碱计算不低于4000。精密称取黄芪甲苷对照品6.2mg，用50％甲醇溶解，制成每1mL含黄芪甲苷0.062mg的对照品贮备液。：精密称取复方干燥浸膏0.5g，加入50％的甲醇50mL，密塞，称定重量，放置1h，超声处理45min，放冷，密塞，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，取25μL注入高效液相仪测定含量。
[0043]
[0044] 结果RSD分别为1.12％和1.46％，说明本发明工艺稳定、可靠，方法重复性良好。6次取样测得含量基本一致，说明本发明的制备工艺重复性好。
[0045] 四、临床试验研究
[0046] 本发明的主要功能主治为早中期慢性肾衰竭患者，具有改善肾功能，延缓肾纤维化的作用。我们使用
实施例的产品中汤剂在医院内选择30例慢性肾衰竭患者进行治疗(6个月)，观察临床效果。
[0047]
[0048] 经过对30例慢性肾衰竭患者使用该中药复方汤剂治疗统计，其临床显效3例，有效7例，稳定14例，无效6例，总有效率80％。说明本发明在治疗慢性肾衰竭方面具有较高的疗效。
[0049] 临床治疗观察期间，30例患者服药后均未发现明显的不良反应，表明本发明毒
副作用低，安全有效。
[0050] 五、动物实验及作用机制研究
[0051] 1)建立动物模型
[0052] 参照文献，采用高糖高脂饮食联合
腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法构建糖尿病肾病肾间质纤维化大鼠动物模型。选择体重160-200g的健康雄性SD大鼠，采用高糖高脂
饲料喂养8周以后，以35mg/kg剂量侧腹腔注射STZ。72h后测血糖和尿糖，空腹血糖超过13.8mmol/L，随机血糖高于16.7mmol/L，尿糖++++时，确定糖尿病模型建立。糖尿病造模成功4周后，测定尿微量蛋白，超过30mg/24h时，确定糖尿病肾病大鼠动物模型建立成功。实验同时设空白对照组。
[0054] 将建立成功的模型大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、该复方颗粒高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组12只。按组分别灌胃蒸馏水、二甲双胍300mg/kg、该复方颗粒4g/kg、2g/kg和1g/kg剂量，灌胃容积均为10ml/kg。每日1次，连续8周。另取正常大鼠10只作为空白对照，灌胃相同容积的蒸馏水。
[0055] 3)指标检测
[0056] a.生化指标
[0057] 大鼠经心脏
采血5mL，全自动生化分析仪检测血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、白蛋白(Alb)。ELISA方法检测外周血IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1、Collagen I、Collagen III、MMP2、MMP9、TIMP1指标。
[0058] b.纤维化相关蛋白基因
[0059] 取大鼠2/3肾组织，提取mRNA和蛋白后，采用Q-RT-PCR和Western blot方法检测组织中CXCL6、CXCL1、CXCL6、MMP2/MMP9、Collagen I/III、a-SMA、TGF-β1-Smad2/3、Vimentin、JAK-STAT、MAPKs、TLRs等相关蛋白和基因的表达。
[0060] 4)检测结果
[0061] 组化分析显示该复方颗粒显著改善肾组织纤维化；外周血生生化指标检测发现，该复方颗粒可显著改善模型大鼠血液中血糖、血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)、尿酸(UA)和白蛋白(Alb)及尿液中尿蛋白的含量；Elisa检测发现，该复方颗粒显著抑制了纤维化相关因子的表达，如：IL-6、TNF-α、TGF-β1、Collagen I、Collagen III、MMP2和MMP9。qRT-PCR和Western blot检测大鼠肾组织，发现该复方颗粒显著抑制CXCL6，CXCR1，MMP2，MMP9，Collagen I，Collagen III，PCNA和p-STAT的表达，并呈剂量依赖性。
[0062] 以上结果表明，该复方颗粒通过抑制CXCL6/JAK/STST3
信号通路来改善糖尿病肾病纤维化。
[0063] 六、本发明的特点是：
[0064] 1.创新的复方制剂
[0065] 将黄芪、大黄、胡芦巴、怀牛膝、王不留行、土茯苓、莪术共七味中药材采用传统中药制备工艺，制成创新的复方药物制剂颗粒剂。
[0066] 2.创新的生产工艺
[0067] 本发明的生产工艺结合了传统中药研究方法和先进的现代中药提取制备工艺。
[0068] 3.显著的治疗效果
[0069] 经过对30例慢性肾衰竭患者使用肾衰方临床治疗统计，其临床显效3例，有效7例，稳定14例，无效6例，总有效率80％。
[0070] 4.稳定的生产工艺
[0071] 本发明的颗粒产品经
加速稳定性考察6个月后，其黄芪甲苷、葫芦巴碱总量与0天比较，没有发生显著变化，说明本发明工艺成熟、可靠，所得产品质量稳定、可控。
