위장관 전달 시스템{GI TRACT DELIVERY SYSTEMS}

본 발명은 영양제 및 약제를 위장관 및 특히 결장으로 전달하기 위한 미소캡슐화된 제제에 관한 것이다. 상기 조성물은 가공 식품 중 영양분 또는 영양약리물질(neutraceutical)을 보호 및 전달하기 위해 사용할 수 있다.

미소캡슐화는 고체, 액체, 또는 기체의 작은 입자를 제2 물질 내부에 팩키징하여 미소캡슐을 형성하는 것을 포함한다. 이는 제약 산업에서 신체 내의 표적화된 약물 전달을 위하여 사용되어 왔다. 이는 점차 신규한 식품 가공 용액을 제공하는 기술로서 여겨지고 있다. 미소캡슐화에 의해, 식품 또는 이의 환경에 첨가된 영양약리물질과 기타 성분 사이에 발생할 수 있는 바람직하지 않은 상호작용을 막을 수 있고, 첨가된 성분의 방출 부위를 조절할 수 있다. 미소캡슐화 기술을 적절하게 사용하여 식품의 맛, 향 또는 질감에 영향을 미치지 않고 이의 영양을 강화시킬 수 있다. 이는 민감한 식품 성분을 보호하고 강화 식품의 저장 수명 및 안정성을 강화시킨다(Brazel, CS (1999) Microencapsulation: offering solutions for the food industry. Cereal Foods World 44(6) : 388-393; Augustin, MA, Sanguansri, L., Margetts, C. and Young. B. (2001) Microencapsulation of food ingredients. Food Australia 53 220-223).

미소캡슐화는 식품 산업 및 건강 산업의 모두에서 사용가능한데, 이는 이 기술이 식이성 생물활성제의 전달 및 시판가능한 기능성 식품의 성공적 개발에 대한 잠재성을 갖는 핵심 기술이기 때문이다. 이러한 과제를 해결하기 위하여 식품 가공 환경에서 식품 등급의 미소캡슐의 성능을 조절하여 필수적인 민감성 성분이 식품 제조시에 보호되며 미소캡슐이 위장관 내부의 부위 특이적 전달을 위한 필요 조건도 충족시킬 수 있도록 해야 한다.

결장 중 영양약리물질 및 치료제를 전달하는 것은 결장 질환의 치료를 위한 관심사이다 (Rubinstein, A., Tirosh, B., Baluom, M., Nassar, T., David, A., Radai, R., Gliko-Kabir, I. And Friedman, M. (1997). The rationale for peptide drug delivery to the colon and the potential for polymeric carriers as effective tools. J. Controlled Release 46 , 59-73). 결장으로 표적하는 것은, 결장 내에서 효소 분해되는 프로-드러그 및 pH 민감적 및 압력 의존적으로 방출되는멀티-코트를 형성함으로써 수행되어 왔다. 장 아크릴 중합체는 결장-전달 제제 중 코어를 보호하기 위해 종종 사용한다. 생물중합체, 특히 다당류를 사용하여 결장으로 코어를 표적하며, 상기 결장에서 코어의 방출은 결장 내의 미생물상에 의해 유발된다. 다양한 다당류, 예컨대 키토산, 펙틴, 아라비녹살란, 아라비노갈락탄, 크실란, 셀룰로오스 덱스트란, 구아검, 아밀로오스, 이눌린, 및 이들의 혼합물을 조사하였고 이들은 결장-전달 시스템으로서의 잠재성을 갖는 것으로 나타났다 (Rubinstein, A. (2000) Natural Polysaccharides as targeting tools of drugs to the human colon. Drug Development Research 50 , 435-439; Sinha, VR and Kumaria, R. (2001) Polysaccharides in colon-specific drug delivery Int J. Pharmceutics 224 , 19-38; Vandaamme, Th.F., Lenourry, A., Charrueau, C. and Chaumeil, J.-C. (2002) The use of polysaccharides to target drugs to the colon. Carbohydrate Polymers 48 , 219-231; Sinha, VR and Kunaria. R. (2003) Microbially triggered drug delivery to I the colon. Eur. J. Pharmaceutical Sciences 18 , 3-18).

결장 전달 및 결장 질환의 치료를 위하여 생물중합체를 사용하는 다수의 시도가 있어 왔다.

미국 특허 5,952,314는 결장 중 단쇄 지방산으로 대사되는 소화가능한 탄수화물의 공급원 및 지방산과의 오일 블렌드{EPA (C20:5) 및 DHA(C22:6)}를 포함하는 장 생성물을 개시한다. 이는 영양 상태를 개선하고 궤양성 대장염을 치료하기 위하여 사용한다.

US5108758은 결장에 약물을 전달하기 위한 유리 아밀로스 매트릭스를 개시한다. US 5840860은 변성 전분에 의하여 단쇄 지방산(SCFA)를 결장으로 전달하는 것에 관한 것이다.

일본 특허 10324642는 키토산의 내부층 및 위 저항성 물질, 예컨대 밀 글리아딘 또는 제인의 외부층을 포함하는 생물활성제(예를 들어, 펩티드)의 전달을 위한 결장 전달 시스템을 개시한다.

US 5866619는 약물, 예컨대 단백질 및 펩티드를 포함하는 당류 함유 중합체의 결장 전달 시스템을 개시한다.

US 6368629는 결장 전달을 위하여 유기산 가용성 중합체 및 당류로 코팅된 약물을 개시한다.

US 544054는 단쇄 지방산으로 대사되는 소화되지 않는 탄수화물(CHO)의 공급원 및 (DHA/EPA와의) 오일 블렌드를 함유하는 조성물로 대장염을 치료하는 방법을 개시한다.

US 5952314는 단쇄 지방산으로 대사되는 소화되지 않는 탄수화물의 공급원 및 EPA/DHA를 함유하는 오일을 포함하는, 대장염의 치료를 위한 장 영양 생성물에 관한 것이다.

US 6531152는 수용성 코어(Ca 펙티네이트 또는 기타 수불용성 중합체) 및 위장관을 따라 특정 위치에 장 투여된 약물을 전달하기 위하여 파열되는 외부 코트(예를 들어, 소수성 중합체 - Eudragrit)를 함유하는 약물 전달 시스템을 기재한다.

코팅 시스템의 형성을 위하여 단백질 및 다당류의 조합물을 사용하는 것이 제안된다.

US 6234464는 내부층이 젤라틴, 카세인 또는 알긴산으로 이루어지고 외부층은 젤라틴, 아라비아검, 키토산으로 이루어진 2층을 포함하는 캡슐을 오일/다중불포화 지방산(PUFA)/지방산에 제공하여 끓는 물에서 안정한 생성물을 제공하는 시스템을 개시한다.

US 6403130는 카세인 및 고 메톡시 함량의 펙틴(펙틴의 R'COOCH ₃ 의 에스테르 기와 단백질 R"NH ₂ 의 유리 아미드기의 반응에 의해 형성된 아미드)을 함유하는 중합체를 포함하는 코팅 조성물을 개시한다.

WO 01/74175는 처리된 단백질 탄수화물 막 중 산소 민감성 물질, 예컨대 다중불포화 오일을 캡슐화하여 마이야르(Maillard) 반응 생성물을 형성하는 방법을 개시한다.

본 발명의 목적은 저장시 불안정한 성분과 함께 사용될 수 있을 뿐 아니라 창자를 통해 전달되는 동안 보호 효과를 제공하는 위장관 전달 시스템을 제공하는 것이다.

발명의 간단한 설명

상기 목적을 위하여, 본 발명은 위장관 중 예정된 위치에서 치료제 및 영양제를 방출하는, 저장시 불안정한 치료제 및 영양제와 함께 사용하기 위한 미소캡슐재를 제공하고, 이때 미소캡슐재는 식품 등급의 처리된 탄수화물과 식품 등급의 수용성 단백질을 배합함으로써 형성된다.

치료제 및 영양제는 오일상을 형성하고, 이 오일상은 수분산성 또는 수용성 캡슐재와 함께 에멀션화되어 치료제 및 영양제를 캡슐화한다. 이들 제제는 오일 또는 유용성 또는 유분산성일 수 있고, 후자의 경우에 수용성 성분을 포함할 수 있다. 캡슐화될 수 있는 제제는 지질(산소 민감성 오일, 지방산, 트리글리세라이드를 포함하는 오일), 및 유용성 및 유분산성 성분(약제, 프로바이오틱스, 및 생물활성제를 포함함)을 포함한다. 오일상과 수성상 사이를 분할하는 성분을 포함하는 수분산성 성분도 캡슐화할 수 있다. 수분산성 치료제 및 영양제를 사용하는 경우, 이들은 오일상으로 캡슐화되지 않고 캡슐재 막 중 분산될 것이다. 식품 성분 또는 치료제로서 에멀션을 사용할 수 있으나, 에멀션을 건조하여 분말을 형성하는 것이 바람직하다.

선행 기술의 캡슐화 시스템은 민감성 코어를 결장으로 표적 전달하기 위한 캡슐을 형성하기 위하여 단백질과 기타 생물중합체의 조합물을 사용하는 것을 고려하지 않았다.

본 발명의 전달 시스템은 제약업체 및 식품 제조업자가 편리한 방법으로 다양한 영약학적 및 생리학적 기능성 식품 성분 및 생물활성 화합물을 제공하는 것을 가능하게 하고, 이들 생성물이 결장으로 전달되는 것 또한 가능하게 하는 모든 천연 성분을 사용하는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 결장 전달에 사용되는 캡슐재 중 일부는 산소 민감성 성분을 캡슐화하는 데 효과적인 매트릭스라는 추가의 이점을 갖는다. 사용된 캡슐재 중 일부의 막 형성 특성 및 항산화 특성은 공동으로 작용하여 민감성 성분, 예컨대 다중불포화지방산이 저장시 산화되는 것을 방지하고 또한 식품이 처리되는 동안 고온, 고압 및 수분에의 노출시에 이들을 보호한다. 또한, 본 발명은 용이하게 이용가능한 단백질 및 탄수화물을 사용한다. 캡슐화된 제제의 제조시에 용매를 전혀 사용하지 않는데, 이는 공정이 모두 수성계 시스템을 사용하기 때문이다. 상기 공정은 건조 조건에서 작동하는 대부분의 식품 및 약학 제조 설비에 적합하게 도입하거나 이를 변형할 수 있다.

사용되는 단백질은 막을 형성하는 임의의 수용성 단백질 또는 가수분해된 단백질을 포함할 수 있고, 이는 유즙 단백질, 예컨대 카세인 및 이의 유도체 또는 유장 단백질을 포함한다. 탄수화물 성분은 환원당기를 포함하는 것, 올리고당 및 전분(미정제, 변성, 난소화성, 아세틸화, 프로프리오닐화 및 부틸화 전분)일 수 있다.

단백질 및 탄수화물은 수용액에서 반응하여 배합체를 수득할 수 있다. 이 반응은 단백질 중 아미노산의 유리 아미노기와 탄수화물 중 환원당기 사이에서 일어날 수 있다. 이러한 유형의 반응은 일반적으로 식품의 비효소적 갈변시 통상적으로 발생하는 마이야르 반응으로서 일컫는다. 이러한 반응은 식품의 열처리시 발생하고 산소 민감성 성분의 보호를 위하여 바람직한 캡슐화 특성을 가공하는 데 이로운 것으로 앞서 밝혀졌다. 예를 들어, 산소 민감성 오일을 함유하는 미소캡슐화된 제제는 캡슐 매트릭스 중 마이야르 반응 산물[MRP]로서 산화에 대항하여 보호되고, 우수한 막 형성제이며 또한 WO 01/74175에서 개시된 바와 같이 항산화 활성을 보여준다.

제제에서 사용된 전분도 전달 시스템의 제조시 개선된 처리 특성을 제공하기 위하여 전분의 특성을 개질하는 통상의 처리 기술 및 최근의 처리 기술을 사용하여 전처리할 수 있다. 상기 전처리는 긴 전분 분자를 분해하여 이들이 더 안정한 에멀션을 더 안정하게 하고 또한 캡슐재의 단백질 성분과의 마이야르 반응을 위한 더 많은 수의 말단 당 환원기를 제공하도록 선택한다.

결장 전달 시스템은 상부 위장관에서 불안정한 다양한 생물활성제(예를 들어, 오일), 약제 및 치료제를 위하여 사용할 수 있다. 캡슐재에 의하여 캡슐화된 성분에 제공되는 보호 효과는 결장 중 표적 방출을 가능하게 하는데, 이때 방출은 캡슐재가 분해된 이후에 일어난다(예를 들어, 결장 중 미생물 효소의 활성에 의하여). 생물활성제, 약제 및 치료제 성분의 결장으로의 전달은 결장 질환, 예컨대 결장암, 궤양 대장염 및 염증성 창자병의 치료 및 예방에 바람직하다.

일부 경우에서, 제제 중 사용된 캡슐재, 예컨대 선별된 다당류는 또한 장관벽 유착제 또는 유익한 박테리아의 증식을 촉진하는 프리바이오틱스(prebiotics)로서 작용할 수 있고, 추가의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 난소화성 전분을 함유하는 전달 시스템은 결장 건강에 대한 잠재적 이점을 갖는다.

발명의 상세한 설명

다수의 제제가 기술될 것이고, 이들 중 일부는 본 발명에 따른 것이고 일부는 비교의 목적이며, 이는 일부 제제는 결장에의 전달에 적합한 반면 나머지 제제는 소장에서의 방출에 더 적합한 것임을 보여주기 위한 것이다. 이들 제제는 코어가 위 내부 및 소정 내부의 환경에서 소화로부터 보호된다는 것을 증명한다.

도면의 도 1 내지 19는 하기의 실시예 1 내지 19에서 예시된 바와 같이 본 발명의 제제의 용매 추출가능한 지방 함량 및 기타 특성을 도시한다.

활성 성분의 미소캡슐화 공정은 하기의 제조 단계를 포함한다:

(a) 생물학적 활성 코어(예를 들어, 오일, 유용성 또는 유분산성 물질, 생물활성제, 치료제, 약제)를 선별하는 단계,

(b) 단백질 및 탄수화물(또는 통상의 방법, 예컨대 가열 또는 압출에 의해 또는 최근의 처리 기술, 예컨대 고압 처리, 미소유체화 또는 초음파의 사용에 의해 전처리된 전분)을 수성상 내에 분산시키고 그 혼합물울 처리하는 단계(필요에 따라, 단백질-탄수화물의 배합물을 추가로 열처리하여 배합체(예를 들어, 마이야르 반응 산물)의 형성을 유도할 수 있음),

(c) 코어와 캡슐재를 혼합(즉, 단백질-탄수화물 혼합물)하고 이 혼합물을 균질화하여 에멀션을 수득하는 단계로서, 이때 상기 코어는 캡슐재로 둘러싸이는 것인 단계,

(d) 임의로, 에멀션을 분무 건조하여 분말화된 제제를 수득하는 단계로서, 이때 코어는 캡슐 매트릭스에 의해 둘러싸이는 것인 단계.

에멀션 제제

참치유를 하기 실시예의 대부분에서 사용하는 오일로서 선택하였고, 이는 상기 오일이 장쇄 다중불포화 지방산을 다량으로 함유하기 때문이며 이는 사용되기 이전에 산화로부터 보호될 필요가 있다. 또한, 상기 오일은 결장암을 예방하고 장의 건강을 증진시키는 잠재성을 가지므로 이들을 결장으로 전달하는 것이 관심사가 되고 있다. (Karmeli, R A. (1996) Historical Perspective and Potential Use of n-3 Fatty Acids in Therapy of Cancer Cachia. Nutrition , Vol 12 (1) S2-S4; Dommels YEM, Alink, GM, Van Bladeren, P J. van Ommen, B (2002) Dietary n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids and colorectal carcinogenesis: results from cultured colon cells, animal models and human studies, Environmental Toxicology and Pharmacology, Vol 12 (4), 233-244.). 트리부티린 및 루테인도 예로서 포함시켰다. 상기 기술을 사용하는 프로바이오틱스(probiotics)(즉, 수분산성 성분의 예)의 캡슐화는 앞서 WO 01/74175에서 개시되었다.

단백질 및/또는 탄수화물(미정제이거나 전처리함) 및 오일 혼합물을 상이한 비율로 사용하는 다양한 제제를 제조하였다. 상기 제제는 최종 분말 중 25 내지 50%의 지방을 함유하도록 제조하였다.

하기 실시예에서 사용한 단백질은 카세인산나트륨, 유장단백질 단리액 및 가수분해된 유즙 단백질이었다. 단독으로 또는 조합하여 사용한 탄수화물은 글루코스, 올리고당, 건조된 글루코스 시럽, 변성 전분, 난소화성 전분 및 천연 전분이었다. 고 메톡시 함량의 펙틴, 알긴산, 카라기난, 구아검을 비롯한 다당류를 일부 제제 중 단백질-탄수화물 혼합물에 첨가하였다.

미소캡슐의 제조

재료

본 실시예에서 사용한 코어 물질은 대두유 중 참치유, 트리부티린 및 15 %(w/w)의 루테인(대부분 디팔미테이트 및 디미리스테이트 루테인 에스테르로서)을 포함한다.

본 실시예에서 캡슐재로서 사용한 단백질은 카세인산나트륨(NaCas), 유장 단백질 단리액(WPI), 가수분해된 카세인 단백질(HCP) 및 가수분해된 유장 단백질(HWP)을 포함한다.

본 실시예에서 사용한 탄수화물은 덱스트로스 모노하이드레이트(Glu), 찰옥수수, 옥수수 전분, 건조 글루코스 시럽(DGS), 밀 전분, 올리고프럭토스(oligo), 타피토카 덱스트린(K4484), 변성 전분(Capsul), 변성 전분(Hi-Cap 100), Hi-Maize, Hylon VII, Novelose 260 및 Novelose 330, 감자 전분, 알긴산나트륨, 카파 카라기난, 고 메톡시 함량의 펙틴(HMP) 및 구아검을 포함한다.

단백질-탄수화물 캡슐재 의 제조

일부 경우, 단백질 및 탄수화물의 미반응 블렌드(이들은 마이야르 반응 생성물의 형성을 유도하기 위하여 가열하지 않으므로 비 MRP 제제로서 언급함)을 캡슐화 매트릭스로서 사용하였다. 반응된 단백질-탄수화물의 캡슐재(이들은 마이야르 반응 생성물의 형성을 유도하기 위하여 가열하므로 MRP 제제로서 언급함)의 제조를 위하여, 단백질을 고전단 혼합기를 사용하여 60℃의 물에 용해시키고, 그 후 당, 전분 또는 선택한 탄수화물을 첨가한다. 다당류도 첨가하는 경우, 이 다당류가 90℃의 온도에서 먼저 수화되도록 한 후 단백질-당 혼합물에 첨가한다. 단백질-당/전분/검 혼합물의 pH를 7.5로 조절한다. 그 후, 이 혼합물을 3 리터의 캔에 채우고 봉인하여 레토르트에서 98℃로 가열하고 30분 동안 정치시킨 후 실온으로 냉각한다. 미소캡슐 제제를 미소캡슐의 제조에서 사용되는 방법에 의해 하기 실시예에서 제공한다.

단백질 -전분 캡슐재 의 제조

단백질을 고전단 혼합기를 사용하여 60℃의 물에 용해하여 15%의 총 고체(TS) 용액을 제조하였다. 전분(미정제이거나 또는 가열, 미소유체화, 압출, 고압 처리, 및 초음파분쇄함)을 제조하였고 개별적으로 가공하여 70℃의 물 중 10% TS의 용액 또는 분산액을 제조하였다(하기의 미소캡슐화를 위한 전분의 제조에 대한 상세한 설명을 참고). 15% TS의 단백질 용액을 10% TS의 전분과 함께 혼합하여 1:1의 단백질:전분 비율을 갖는 12% TS의 혼합물을 제공한다. MRP가 요구되는 경우, 상기 혼합물을 3 리터의 캔에 채우고 봉인하여 레토르트에서 98℃까지 가열하고 30분 동안 정치한 후 60℃로 냉각시킨다.

미소캡슐화를 위한 전분의 제조

미정제 또는 비처리

10% TS의 전분 분산액(전처리하지 않음)을 60℃에서 15% TS의 단백질 용액과 혼합하였다.

열처리

20% TS의 각 전분 분산액(단, 감자 전분의 경우 20% TS의 높은 점도로 인하여 10% TS의 분산액을 사용함)을 73x82 mm 캔 내에서 121℃에서 60분 동안 가열하였다. 일단 열처리한 후, 70℃의 탈이온수를 첨가하여 샘플을 고전단 혼합기 내에서 10%의 TS로 희석하였다. 상기 열처리된 전분을 60℃에서 15% TS의 단백질 용액과 혼합하였다. 그 후, 상기 혼합물을 생물활성제의 미소캡슐화를 위하여 사용하였다.

열처리 및 미소유체화 처리

20% TS의 전분 분산액을 73x82 mm 캔 중 121℃에서 60분 동안 가열하였다. 일단 열처리한 후, 70℃의 탈이온수를 첨가하여 고전단 혼합기 내에서 샘플을 10% 로 희석하였고, 20 KHz 유닛을 사용하여 380 와트에서 50 ㎖/분으로 초음파 처리하였다. 일단 열처리한 후, 70℃의 탈이온수를 첨가하여 샘플을 고전단 혼합기 내에서 10% TS로 희석하였고, 60℃에서 실험용 규모의 M-21OB EH 미소유체화기(미국 매사추세주 뉴톤 소재의 MFIC)를 통해 처리하였다. 상기 설비는 425 ㎛의 Q50Z 보조 처리 모듈 및 200 ㎛의 E230Z 상호작용 챔버(분산 및 세포 파괴를 위한 것임)를 조합하여 800 bar에서 3 회 작동하였다. 미소캡슐화를 위하여 미소유체화된 (MF) 전분을 60℃에서 15% TS의 단백질 용액과 혼합하였다.

열처리 및 초고압 처리

20% TS의 전분 분산액을 73x82 mm의 캔 중 60분 동안 121℃에서 가열하였다. 일단 열처리한 후, 70℃의 탈이온수를 첨가하여 고전단 혼합기 내에서 샘플을 10% TS로 희석하였고, HPP-QFP 35L 유닛을 사용하여 15분 동안 6,000 bar에서 초고압처리하였다. 미소캡슐화를 위하여 초고압 처리된(HPP) 전분을 60℃에서 15% TS의 단백질 용액과 혼합하였다.

열처리 및 초음파 처리

20% TS의 전분 분산액을 73x82 mm의 캔 중 60분 동안 121℃에서 가열하였다. 일단 열처리한 후, 70℃의 탈이온수를 첨가하여 고전단 혼합기 내에서 샘플을 10%로 희석하였고, 20 KHz 유닛을 사용하여 380 와트에서 50 ㎖/분으로 초음파 처리하였다. 미소캡슐화를 위하여 상기 초음파 처리된 (US) 전분을 60℃에서 15% TS의 단백질 용액과 혼합하였다.

압출

스크류 직경이 40 mm이고, 길이 대 직경 비율이 25:1이며, 저전단 스크류 배치를 갖는 트윈 스크류 압출기(모델 MPF 40, APV Baker, Peterborough PE3-6TA, 영국)를 사용하여 난소화성 전분을 처리하였다. 전 사용을 통하여 4 mm의 다이를 사용하였다. 난소화성 전분의 처리를 위하여 중량형 공급기(Ktron Soder AG CH-5702, Niederlenz)를 사용하여 미정제 물질을 15 ㎏/시간으로 공급 포트로 공급하였으며 용량형 펌프(영국 후더스필드 소재의 브룩 크롬프톤)에 의해 물을 포트 (2)로 주입하였다. 배럴 수분을 20 ∼ 40%로 주입하였고 다이 용융 온도를 140 ∼ 178℃로 변화시켰으며, 스크류 속도를 150 ∼ 250 rpm으로 증가시켰다. 압출된 난소화성 전분을 입자 크기가 0.2 mm인 분말로 제분하였다. 미소캡슐화를 위하여 압출된 10% TS의 난소화성 분산액을 15% TS의 단백질 용액과 혼합하였다.

수중유 에멀션의 제조

단백질-탄수화물 혼합물 및 참치유를 별개로 60℃로 예비 가열하였다. Silverson의 고전단 혼합기를 사용하여 생물활성 코어를 상기 단백질-탄수화물 혼합물에 첨가하였다. 그 후, Rannie의 균질화기를 사용하여 상기 혼합물을 350 bar 및 100 bar의 압력에서 2단계로 균질화하였다.

에멀션의 분무 건조

Niro production의 소 분무 건조기를 사용하여, 상기 균질화된 에멀션을 50 ∼ 60℃의 공급 온도, 180℃의 유입 온도 및 80℃의 배출 온도에서 분무 건조하였다. 주 챔버로부터 분말을 수집하였고 팩킹하였다.

참치유 분말 중 용매 추출가능한 지방의 측정

용매 추출가능한 지방의 측정은 Pisecky에 의한 방법(Handbook of Milky Powder Manufacture, 1997)을 기초로 하였으나, 단 사염화탄소 대신 석유 에테르를 사용하였다. 50 ㎖의 석유 에테르(비등점: 40 ∼ 60℃)를 10 ｇ의 분말에 첨가하였다. 상기 혼합물을 마개로 막힌 플라스크 내에서 15분 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하였고 회전식 증발기를 사용하여 60℃에서 용매를 증발시켰다. 그 후, 잔류하는 지방 잔류물을 105℃의 오븐에서 1시간 동안 건조시켰다.

시험관내 미소캡슐의 시험

위장 및 소장 중 미소캡슐의 안정성은 (a) 자극된 위액(stimulated gastric fluid, SGF)(pH 1.2) 내에서 (셰이커 수조 인큐베이터 중 37℃ 및 100 rpm에서 2시간 동안) 항온배양하고 (b) SGF 내에서 (셰이커 수조 항온배양기 중 37℃ 및 100 rpm에서 2시간 동안) 항온배양한 후 자극된 장액(stimulated intestinal fluid, SIF)(pH 6.8)(37℃ 및 100 rpm에서 2시간 동안)에 노출시킨 미소캡슐의 오일 방출 특성의 평가에 의해 측정하였다. US Pharmacopeia(매사추세주 록빌의 US Pharmacopeia 2000 및 National Formulatory(USP 24 NF 19))에서 제시된 방법에 따라 SGF 및 SIF를 제조하였다.

미소캡슐로부터 방출된 오일의 시험관내 측정을 위하여:

항온배양된 샘플로부터 용매 추출가능한 지방을 측정하였다. 상기 샘플을 250 ㎖의 마개가 달린 분별 깔때기로 이동시켰고 석유 에테르(75 ㎖ 플러스 2x25 ㎖)로 추출하였다. 각각의 추출 이후 상기 샘플을 상 분리 여과지를 통해 여과시켜 용매상을 수득하였다. 상기 용매를 제거하여 방출된 오일을 회수하였다.

방출된 루테인의 시험관내 측정을 위하여:

루테인 (1.0 ｇ)을 함유하는 미소캡슐을 상기 기재한 바와 같이 SGF (pH 1.2) 및 SIF (pH 6.8)와 함께 잇따라 항온배양하였다. 방출된 루테인을 측정하기 위하여, 항온배양된 샘플로부터 용매 추출가능한 루테인을 측정하였다. 원심분리기 튜브 내에서 추출을 수행하였다. 석유 에테르(15 ㎖ 플러스 2x10 ㎖)에 의해 샘플을 추출하였다. 각각의 추출 이후에 샘플을 원심분리하였고 (2000 rpm에서 10분 동안) 상부의 용액 층을 제거하였다. 배합된 유기 추출물을 상 분리 여과지를 통해 여과한 후 석유 에테르로 희석하였다. 희석된 추출물의 흡수율을 444 nm에서 측정하였고, 추출된 루테인의 농도를 측정하였다.

방출된 트리부티린의 시험관내 측정을 위하여:

트리부티린 (1.0 ｇ)을 함유하는 미소캡슐을 상기 기재한 바와 같이 SGF (pH 1.2) 및 SIF (pH 6.8)와 함께 잇따라 항온배양하였다. 방출된 트리부티린의 측정을 위하여, SGF에만 노출된 샘플은 직접 사용하였고, SGF 및 SIF에 잇따라 노출된 샘플은 pH를 2로 조절하였다. 상기 혼합물에 2.5 ｇ의 NaCl 및 15 ㎖의 디클로로메탄을 첨가하였으며, 이 혼합물을 5℃에서 2500 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 수성층을 제거하고 정치하였으며, 디클로로메탄 층의 상부에 부유하는 젤라틴성 침전물을 휘젓지 않으면서 원뿔형 플라스크로 경사분리하였다. 젤라틴성 침전물을 갖는 수성층을 또다른 15 ㎖의 디클로로메탄으로 추출하였다. 디클로로메탄 추출물을 무수 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시킨 후 여과(0.45 ㎛의 PTFE 시린지 필터)하였다. 온수조 내에서 질소 하에 디클로로메탄을 제거하였다. 추출된 물질을 10 ㎖의 헥산/이소-프로필 알콜(99:1, v/v)에 용해하였고, 그 용액을 냉동기에 저장하였다. 정상(normal-phase) HPLC에 의하여 추출물 중 트리부티린 및 부티린산의 양을 분석하였다[칼럼: PVA-Sil 보호 및 분석(250 mm x 4.6 mm) 칼럼; UV 검출기(210 nm)].

미소캡슐의 생체내 시험

대략 10주된 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 생체내 연구를 위해 사용하였다. 투여 전까지 24시간 동안 쥐에게 고형 식품을 주지 않았으나, 2.5%의 글루코스, 0.5%의 NaCl 및 0.05%의 KCl(모두 w/v)을 함유하는 음료수는 자유롭게 섭취하게 하였다.

방사선 표지된 참치유의 제조:

0.5 ㎖ 또는 25 μCi의 방사선 표지된 표지 물질[ ⁴ C] 18:3([ ¹⁴ C] 트릴리노레닌, 50 ∼ 50 mCi/mmol; 50 μCi/㎖)을 4.56 ｇ의 참치유에 첨가하였다. 방사선 표지된 트릴리놀레닌을 갖는 두 무리의 참치유 샘플을 제조하였고, 이중 하나는 미소캡슐화된 오일의 처리를 위한 것이고(제제 및 제조에 대하여 실시예 19 참조) 나머지 하나는 자유(미소캡슐화되지 않은) 오일의 처리를 위한 것이다.

쥐 처리:

처리 당일 스테인레스 강 영양 공급 바늘을 사용하여 쥐에게 대조군 처리의 경우 방사선 표지된 표지 물질[ ¹⁴ C]과 혼합된 0.3 ㎖의 어유(0.27 ｇ의 참치유 + 0.03 ㎖의 표지 물질[ ¹⁴ C] 18:3), 또는 미소캡슐화된 오일 처리의 경우 2 ㎖의 에멀 션(0.09 ｇ의 참치유 + 0.01 ㎖의 표지 물질[ ¹⁴ C] 18:3)을 위장관 내로 공급하였다.

조직 샘플링:

처리 이후 4, 9 및 14시간의 시점에 쥐를 마취하였고 혈액 샘플을 심장 천자에 의하여 취하였다. 위, 소장, 맹장 및 결장을 제거하였다. 소장을 2개의 분획으로 분할하였고, 각각의 위장관 분획을 0/9%의 NaCl로 씻어내렸으며, 세정물을 수집 및 냉동하였다. 그 후, 위장관 분획을 이후의 분석을 위하여 냉동하였다. 상기 시점에서의 분석을 위하여 침전물도 수집하였다. 조직 및 침전물을 측량하였고 샘플 분석을 위하여 이를 취해 측량하였다.

조직 샘플 분석:

모든 미흡수 오일(방출된 오일 및 캡슐화된 오일 모두)을 함유하는 위장관 세정물의 방사능을 산출하여 방사능의 총량을 측정하였다. 조직 샘플을 BTS-450 ^R 조직 가용화제 내에 밤새 용해하였다. 침전물을 BTS-450 ^R 에 용해하였으며 이중 일부는 전처리하였다. 액체 섬광 칵테일 Ready Organic ^R 을 각 샘플에 첨가하였고 Packard 1500 Tri-Carb Scintillaion Counter 내에서 샘플에 액체 섬광 집계를 실시하였다.

실시예 1 : 단백질- 글루코스 /건조된 글루코스 시럽 또는 단백질-올리고당의 가열되지 않거나 가열된 블렌드를 캡슐재로서 사용하는, 25%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 2 : 단백질- 글루코스 /건조된 글루코스 시럽 또는 단백질-올리고당의 가열되지 않거나 가열된 블렌드를 캡슐재로서 사용하는, 50%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 3 : 단백질-전분의 가열된 블렌드를 캡슐재로서 사용하는, 25%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 4 : 단백질-전분의 가열된 블렌드를 캡슐재로서 사용하는, 50%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 5 : 검과 배합된 단백질- 글루코스 /건조된 글루코스 시럽 또는 단백질-올리고당의 가열되지 않거나 가열된 블렌드를 캡슐재로서 사용하는, 25%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 6 : 검과 배합된 단백질- 글루코스 /건조된 글루코스 시럽 또는 단백질- 올리고당 의 가열된 블렌드를 캡슐재로서 사용하는, 50%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 7 : 검과 배합된 단백질 가수분해물 -올리고당의 가열된 블렌드를 캡슐재로 서 사용하는, 25%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 8 : 검과 배합된 단백질 가수분해물 -올리고당의 가열된 블렌드를 캡슐 재로서 사용하는, 50%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 9 : 미정제 또는 처리된 난소화성 전분(감자 전분)과 카세인산나트륨 의 블렌드를 사용하는, 25%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 10 : Hylon VII 또는 전처리된 난소화성 전분( Hylon VII )과 카세인산나트륨의 블렌드를 사용하는, 25%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 11 : Hi - Maize 1043 또는 전처리된 난소화성 전분( Hi - Maize 1043)과 카세인산나트륨의 블렌드를 사용하는, 25%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 12 : Novelose 260 또는 전처리된 난소화성 전분( Novelose 260)과 카세인산나트륨의 블렌드를 사용하는, 25%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조

실시예 13 : Novelose 330 또는 전처리된 난소화성 전분( Novelose 330)과 카세인산나트륨의 블렌드를 사용하는, 25%의 오일 함유량을 갖는 분말 제제 및 이의 제조