여성 비뇨기 감염의 예방과 억제 기능을 가진 프로바이오틱 유산균 웨이셀라{Probiotic Weissella which prevent and cure urinary tract infections}

도 1. Weissella kimchii Strain PL9023의 16S rRNA의 염기서열

도 2. Weissella kimchii Strain PL9023 배양추출물의 각종 비뇨기 병원성 세균과 내성 세균의 성장 억제 능력

도 3. Weissella kimchii Strain PL9023의 TMB-PLUS 배지에서의 집락 모양

도 4. Weissella kimchii Strain PL9023의 자체응집 반응

도 5. Weissella kimchii Strain PL9023과 C. albicans의 응집반응

도 6. Weissella kimchii Strain PL9023의 질 세포 부착 능력

도 7. 비뇨기 병원성 세균의 질세포 부착

본 발명은 비뇨기 감염을 예방하거나 치료할 수 있는 유산균을 제공한다.

또한 본 발명은 생균을 포함한 질 감염 예방 효과와 치료 효과를 가지는 식품 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 생균과 배양물을 포함한 질 감염 예방 효과와 치료 효과를 가지는 식품 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 여성의 생식기 건강 효과를 가진 유산균을 종균으로 사용한 여성 건강 기능 증진 효과를 가진 식음료를 제공한다.

또한 본 발명은 여성 생식기 건강 효과를 가진 유산균을 함유한 복용제를 제공한다.

사춘기 이전의 여성의 질 내는 피부와 유사한 pH 6-8 정도의 중성을 유지하다가 사춘기에 성호르몬의 분비로 인해 글리코겐이 축적된 질 상피세포가 증식되어 세포나 균에서 나오는 효소에 의해서 글리코겐이 젖산으로 분해되어 질 내 산도가 4.5로 유지된다. 질 내에 상주하는 정상 균은 6가지 정도로 그 중 제일 많은 수를 차지하는 세균은 락토바실루스(lactobacillus)로써 이들 균의 생존은 질 내 산도와 당(Glucose)의 이용도에 영향을 받는다. 질 상피세포는 여성호르몬에 의해 글리코겐을 다량 함유하게 되고, 락토바실루스균은 이들을 분해하여 젖산을 생산하게 된다. 만일 질 내 산도가 유지되지 못하거나 대사 장애가 발생하게 되면 정상 균총의 감소로 인하여 질병이 발생하는 것이다.

건강한 폐경기 이전의 여성의 질 내에 상주하고 있는 lactobacilli는 10 ⁷ ∼ 10 ⁸ CFU/g 정도로 L. acidophilus group 과 L. fermentum 이 주종을 이루며, L. plantarum, L. brevis, L. jensenii, L. casei, L. delbrueckii 와 L. salivarius 등도 보고되고 있다. 질염을 일으키는 비뇨기 감염원인세균 (genitourinary pathogen)들에는 Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, GroupB Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrore, E coli 등이 있다. 이러한 대부분의 감염은 요로감염에서부터 시작된다 (Reid, G., Jass, J., Sebulsky, T., and MaCormick, JK 2003. Potential uses of probiotics in clinical practice. Clinical Microbiology Reviews 16: 658-672).

병원균에 대한 lactobacilli 의 억제 기전을 살펴보면, 1. 비뇨생식기표면에 병원균이 결합하는 것을 경쟁적으로 방해하거나, 2. 락토바실루스가 몇몇 비뇨기 감염 세균과 같이 응집해서 젖산, 과산화 수소, 박테리오신, 바이오설팩턴트 등 항세균 물질에 노출시키게 하는 등이 있다. 이 중 락토바실루스의 부착 기전은 비특이적인 요인(특히 hydrophobicity 와 표면 이온화 정도)와 세포 표면의 단백질과 탄수화물과 같은 특이 구성성분이 관여한다 (Lorca, G., Tonino, MI, de Valdez, GF, Ljungh, A. 2002. Lactobacilli express cell surface proteins which mediate binding of immobilized collagen and fibrogen. FEMS Microbiol. Letters 206: 31-37).

우수한 여성 비뇨기 건강을 위한 프로바이오틱으로 사용할 수 있는 유산균은 이런 병원균의 감염을 막기 위해 세균 억제능력을 가지는 젖산, 과산화 수소 생산 능력이 뛰어나서 병원균 성장을 억제하는 능력이 뛰어나야 하며, 또한 병원균의 질 세포와 방광세포의 부착을 억제하는 능력이 뛰어나야 한다. 여기에 덧붙여 각종 유해산물의 생산이 없고 유해 효소 생산이 없는 지 확인하여 인체 안전성 검사를 통과하여야 한다.

따라서, 본 발명은 비뇨기 건강을 지킬 수 있는 유산균을 제공하는 데에 있다.

본 유산균은 웨이셀라 김치 PL9023 ( Weissella kimchii Strain PL9023)은 KACC 91139으로 기탁되었다.

또한 본 발명의 유산균은 세균 억제 효과가 있는 과산화수소를 과량으로 발생하는 기능의 유산균으로써 비뇨기 감염 세균의 성장을 억제하는 데 있다.

또한 본 발명의 유산균은 세균 억제 효과가 있는 박테리오신, 젖산, 기타 억제물질을 발생하는 유산균으로써 비뇨기 감염을 예방하고 치료하는 데에 있다.

또한 본 발명의 유산균은 비뇨기 감염 세균의 질 세포와 방광 세포 부착을 억제하여 감염을 억제하는 데에 있다.

또한 본 발명은 경구 투여나 질좌제 형태로 인체 사용시 안전한 유산균을 제공하는 데에 있다.

또한 본 발명은 각종 여성 건강을 증진할 수 있는 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

유산균은 각종 조성물로 제제화 할 수 있으며, 바람직하게는 이 조성물은 캡슐, 정제 및 분말, 좌제 등의 제약 조성물 형태와 각종 식품 첨가에 용이한 형태도 바람직하다. 이러한 제제는 공지된 방법에 의해 제약상 허용되는 담체, 부형제, 용매 또는 보조제를 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 방법 및 성분은 잘 알려져 있으며, 표준 텍스트 및 매뉴얼, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 (Remington. 1995. The Science and Practice of Pharmacy. Mack Publising Co, Easton, PA 18042, USA)에 상세히 기재되어 있다.

또한 당 업계에 일반적으로 잘 알려진 방법에 의해 정장성 박테리아를 식품으로 제조할 수도 있다.

또한 당 업계에 일반적으로 잘 알려진 방법에 의해 발효 유제품을 포함한 발효 식품의 종균으로 사용하여 여성 건강 증진에 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비뇨기 감염 예방과 치료 기능의 유산균을 제공한다.

또한 본 발명은 비뇨기 감염과 치료를 위한 웨이셀라 김치 PL9023 ( Weissella kimchii Strain PL9023)를 제공한다.

또한 본 발명은 비뇨기 감염과 치료를 위한 웨이셀라 김치 PL9023 ( Weissella kimchii Strain PL9023)를 1일 1-2회 1회에 1x10 ⁷ CFU ∼ 1×10 ¹¹ CFU 를 복용하거나 좌제로 사용하는 예방제 및 치료제를 제공한다.

또한 본 발명은 비뇨기 감염과 치료를 위한 웨이셀라 김치 PL9023 ( Weissella kimchii Strain PL9023)를 포함한 식음료 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 비뇨기 감염과 치료를 위한 웨이셀라 김치 PL9023 ( Weissella kimchii Strain PL9023)를 포함한 비뇨기 감염 예방과 치료 목적의 발 효제품을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

[실험예 1] Weissella kimchii Strain PL9023의 분리 및 동정

＜재료 및 실험방법＞

건강한 폐경기 이전의 여자의 질로부터 샘플을 취하여 0.001％ bromophenol blue가 함유된 MRS (Man-Rogosa-Sharpe liquid reference medium) 배지에 접종하고 여기서 잘 형성된 집락을 동정에 사용하였다. 생화학적 특성은 API CH50.CHL 키트를 사용하여 동정하였고, 16S rRNA 염기서열 분석을 이용하여 확인하였다. 16S rRNA 염기서열을 분석하기 위하여 Genomic DNA를 분리하여 16S rDNA 부분을 증폭하고 증폭된 DNA단편을 전기영동으로 확인하였다. 겔로부터 DNA 단편을 Qiagen PCR purification kit (Giagen,Hilden,Germany)으로 정제하여 d-Rhodamine dye-labeling dd-NTP를 포함하는 반응액과 혼합하여 sequencing PCR을 한 후 얻어진 DNA를 Ethanol/Sodium acetate 침전법을 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA를 TSR(Template Suppression Reagent)에 녹여 ABI prism 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, USA)로 분석하고 분석된 염기서열은 Genebank( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )를 이용하여 동정하였다. Weissella confusa 와 W. kimchii 를 구분하기 위해 ARDRA를 사용하였다.

＜결과 및 고찰＞

API 50CH kit를 사용한 동정으로 L. coprophilus 로 동정되었다. API의 동정결과로는 Weissella confusa 와 Weissella kimchii 는 모두 L. coprophilus 로 동정이 된다. 단, Weissella confusa 와 Weissella kimchii 는 당 발효능의 차이를 보여 Galactose, β-Gentiobiose, Gluconate의 발효능이 다르다. 16S rRNA 염기서열 (도 1)은 Genbank DB의 Weissella kimchii (Accession No. AY190629)와 100％ 일치하여 Weissella kimchii Strain PL9023으로 명명하였다 (도 2).

[실험예 2] 안전성 검사

Lactic Acid Bacteria (LAB) 의 사용은 오랜 역사를 가지고 있으며 대부분의 유산균은 병원성 잠재인자를 가지고 있지 않은 것으로 알려져 왔다. 그래서 대부분의 lactobacillus속은 "Generally Recognized as Safe (GRAS) status" 로 인정받고 있다. 그러나 최근 유산균의 안전성이 제기되면서 유산균을 사용함에 있어 안전성 검사는 필수가 되었다. 따라서 PL9023를 대상으로 용혈현상 검사, 젤라틴 액화반응검사, 암모니아 생성확인검사, 인돌 생성 확인검사, 페닐알라닌 탈아민 조사, 유해 효소 생산 확인 검사 (β-glucosidase, β-glucuronidase, nitroreductase activity)를 실시하였다.

＜재료 및 실험 방법＞

용혈 현상 검사 (Hemolysis)

Sheep blood Agar 배지에 Weissella kimchii Strain PL9023을 접종하여 37℃에서 24시간 배양하du 용혈현상을 관찰하였다 (Isenberg, HD 1992. Hemolysis on sheep blood agar. Clinical Microbiology Procedures Handbook Vol. 1, pp. 1.20.16-1.20.17. American Society of Microbiology, Washingtong DC, USA).

젤라틴 액화 반응 검사

MRS gelatin 배지(0.3 g beef extract, 0.5 g peptone, 12 g gelatin, 100 ml MRS broth)로 사면배지를 만들어 Weissella kimchii Strain PL9023을 접종하여 35℃에서 6주간 배양한다. 접종하지 아니한 대조구와 함께 4℃에서 4시간 정도 냉각시켜 젤라틴 액화 여부를 확인하였다(Isenberg, HD 1992. Gelatin liquefaction test. Clinical Microbiology Procedures Handbook Vol. 1, pp. 1.19.42-1.19.43. American Society of Microbiology, Washingtong DC, USA).

암모니아 생성 확인

Urea agar 배지(20 g urea, 5 g NaCl, 2 g KH2PO4, 1 g peptone, 1 g glucose, 12 mg phenol red, 100 ml 증류수)를 여과멸균 한 후 한천 15 g을 증류수 900 ㎖에 녹여 습윤멸균을 한 후 섞어 총 부피를 1 ℓ로 맞춘다 (pH 6.9 ). 여기에 Weissella kimchii Strain PL9023을 접종하고 37℃에서 12시간 정도 배양하여 배지 색의 변화를 확인하였다 (Isenberg, HD 1992. Urease. Clinical microbiology procedures handbook. Vol. 1, pp. 2.6.8. American Soceity of Microbiology, Washington D,C., USA).

인돌 생성 확인

0.1％ Tryptone을 함유된 MRS agar에 Weissella kimchii Strain PL9023을 접종하고 18시간 정도 배양한다. 여기에 Kovac's reagent (10 g p-dimethylaminobenzaldehyde, 150 ml buthanol, 50 ml hydrocholic acid)를 5방울 정도 가해 색의 변화를 관찰하였을 때 색의 변화를 관찰하였다 (Isenberg, HD 1992. Indole test. Clinical Microbiology Procedures Handbook Vol. 1, pp.1.19.13-1.19.15. American Society of Microbiology, Washingtong DC, USA).

페닐알라닌 탈아민 조사

MRS 배지에 D,L-phenylalanine 0.2％ 첨가하여 Weissella kimchii Strain PL9023을 접종하고 24시간 정도 배양하였다. 여기에 5-10방울의 10％ ferric chloride를 떨어뜨려 사면 배지 위로 흘러내리게 하여 1-5분 안에 색의 변화를 관찰한다. 양성인 경우 생성된 phenylpyruvic acid에 10％ ferric chloride와 반응이 되어 녹색으로 변한다. v 은 음성으로 나타났다 (Ishibashi N. and S. Yamazaki. 2001. Probiotics and safety. Am. J. Clin. Nutr. 73: 465S-470S).

β-glucuronidase 생산 확인 검사

ρ-nitrophenyl-β-D-glucuronide을 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 에 0.2％ 되도록 용해시켰다. Weissella kimchii Strain PL9023를 Ab ₆₀₀ =4으로 phosphate buffer에 잘 부유시켜 현탁액을 만들어 200 ㎕ 현탁액에 기질이 있는 buffer 200 ㎕를 첨가하여 37℃에서 16시간 처리한다. 배양액의 색이 노랑으로 변하면 양성으로 판독한다 (Mastromarino, A., BS Reddy, and EL Wynder. 1976. Metabolic epidermiology of colon cancer: enzymic activity of fecal flora. Am. J. Clin. Nutr. 29:1455-1460).

Nitroreductase activity 확인 검사

MRS 액체배지에서 하룻밤 배양된 Weissella kimchii Strain PL9023을 3,000X g에서 10분간 원심분리하여 균체를 모아 5분간 초음파로 파쇄하였다. 상등액에 4-nitrobenzoic acid (final conc. 30 ㎍/㎖)와 trichloroacetic acid (final conc. 0.21％)을 첨가하여 37℃에서 한 시간 처리하고, sodium nitrite (final conc. 0.007％)을 첨가하고 실온에서 20분간 처리하였다. Ammonium sulfamate (final conc. 0.04％) 첨가하고 실온에서 3분간 처리한다. NEDD (N-(1-naphtyl)ethylenediamine dihydrochiolide) (final conc. 0.35％) 를 첨가하고 4℃에서 발색시켜 540 nm spectrophotometer로 측정하였다. 이때 양성반응은 1 ㎍/㎖ 4-aminobenzoic acid을 첨가하여 비교하였다 (Rafii, F., W. Franklin, RH Heflish, and CE Cerniglia. 1991. Reduction of nitroaromatic compounds by anaerobic bacterial isolated from the human gastrointestinal tract. Appl. Environ. Microbiol. 57:962-968).

항생제 내성

프로바이오틱은 항생제에 내성이 강할수록 장내 생존성이 높아지므로 항생제내성이 강할수록 좋다. 하지만 이들 내성이 전달 될 경우 내성 문제를 야기할 수 있어 (Gevers, D., G. Huys, and J. Swings. 2003. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from Lactoacillus isolates to other Gram-positive bacteria. FEMS Microb. Letters 225: 125-130) 다른 균으로의 내성 전이를 확인하였다.

표 2. 디스크 확산법을 이용한 Weissella kimchii Strain PL9023의 항생제 내성

항생제 내성의 전이 확인

항생제내성의 전이를 확인하기 위해 filter binding assay를 수행하였다 (givers, D., G. Huys, and J. Swings. 2003. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from lactobacillus islates to other Gram-positive bacteria. FEMS Microb. Letters 225:125-130). Weissella kimchii Strain PL9023을 mid-exponential phase (대략 4-5시간)까지 배양시켜 이의 1 ml와 1 ml의 E. faecalis CCARM 5110를 혼합하여 멸균된 cellulose acetate filter에 여과시키고 PPS(peptone physiological saline solution) 로 세척하였다. 여과지를 non-selective agar medium 위에 올려 37℃에서 16시간 배양시킨다. 여과지에 성장한 균체를 2 ㎖의 PPS로 세척해서 떨어뜨리고 이를 다시 희석하여 각각의 항생제가 함유된 Enterococcosal 선택배지에 접종하여 37℃에서 24-48시간 배양시켜 내성 E. faecalis 를 확인하였다.

＜결과 및 고찰＞

Weissella kimchii Strain PL9023은 각종 유해 산물이나 효소를 생성하지 않는 것이 확인되었으며 항생제 내성 전이 실험 결과도 내성이 전이된 E. faecalis 가 발견되지 않는 것이 확인되어 인체에 사용하는 데에 위해성이 없는 것으로 판명되었다.

[실험 예 3] 유해세균 성장 억제 검사

＜재료 및 실험 방법＞

W. kimchii PL9023을 MRS 액체 배지에서 Stationary phase에 도달하도록 37도에서 24시간 배양하였다. 질에서 분리한 병원균을 사용하여 병원성 세균의 성장 억제 효과를 확인하였다. Candida albicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli 를 각각 potato dextrose agar(PDA), mannitol salt agar, MacCONKEY agar에 서 배양하였다. Streptococcus agalactiae 의 경우는 Blood agar 에 접종하여 10％ CO ₂ 배양기에서 배양하였다. 병원성 세균을 각각 Muller Hinton solid medium 배지에 접종하고 W. kimchii PL9023의 배양액을 에틸아세테이트로 추출한 용액 10 ㎕씩 올려놓고 성장 억제환이 형성되는 지 확인하였다. 배양액의 에틸아세테이트 추출물은 배양액을 동량의 에틸아세테이트로 추출한 것을 100분의 1의 증류수에 녹여서 준비한다.

＜결과 및 고찰＞

도 2에서 보듯이 W. kimchii PL9023의 에틸아세테이트 추출물은 질에서 분리된 C. albicans, E. coli, S. aureus, Strep. agalactiae 는 물론 항생제 내성인 MRSA의 성장을 억제하였다.

[실험 예 4] 과산화 수소의 생산 : 정량적인 측정법과 정성적인 측정법

＜재료 및 실험 방법＞

과산화수소 생산 능력을 확인하기 위하여 TMB-Plus medium (Brucella agar base plate supplemented with horseradish peroxidase aud 3,3',5,5'-tetramethylbendine dihydrochloride(TMB))을 사용하였다. 이 방법은 horseradish peroxidase-H ₂ O ₂ complex에 의해 수소 공여체로 작용하는 chromogen이 산화가 되면 색이 변하게 되는 것을 이용한 방법이다. 즉 유산균을 혐기조건에서 배양하고 30분 정도 짧은 시간동안 공기에 노출시키면 과산화수소가 생산되면 이것에 의해 TMB가 산화되어 집락이 파란 색을 형성하게 된다. 정성적인 실험은 Amplex Red Hydrogen Peroxide/ Peroxidase Assay Kit (Molicular Probes,Eugene, Oregon, USA. A-22188)을 사용하여 측정하였다. 유산균을 MRS 액체배지에 1％ 접종하여 하룻밤 배양시켰다. 다음 균 배양액을 Brucella 액체배지로 2번 세척하고 균체의 탁도는 Ab.600에서 OD=4로 맞춘 후 37℃에서 4시간 배양시킨 후 원심분리하여 상등액 50㎕를 취하여 96 well plate에 옮긴다. Color reagent (100 uM amplex red reagent, 0.2 U/㎖ horseradish peroxidase) 50 ㎕를 첨가한 후 30분간 실온에서 발색시킨 후 560 nm에서 측정하였다.

＜결과 및 고찰＞

Weissella kimchii PL9023는 TMB-Plus 배지에서 파란색 집락을 형성하여 과산화수소 생성하는 것을 보여주었다 (도 3). 생산하는 양을 측정하였을 때 아래의 표 4에 있듯이 다른 스트레인에 비해 월등하게 많은 과산화수소를 생산하였다.

표 4. 과산화수소 생산량

[실험 예 5] 응집 검사

유산균이 체내에서 생존하기 위해서는 자체 응집력이 있어야 한다. 또한 병원균과의 응집력이 있는 경우는 유산균이 생산하는 과산화수소, 젖산, 박테리오신 등 각종 세균 억제물질이 직접 작용하여 병원균 억제능력이 증가하게 된다.

＜재료 및 실험 방법＞

W. kimchii PL9023 자체의 응집 능력을 측정하기 위해 우선 W. kimchii PL9023을 MRS 배지에서 37에서 하룻밤 배양한다. 이를 10분간 원심분리로 모으고 식염수로 두 번 세척하여 MEM 배지에 흡광도가 0.6이 되도록 현탁액을 만든다. 이를 37도, 100 rpm에서 4시간 배양한 후 그람 염색법으로 염색하여 현미경으로 관찰한다. 병원균과의 응집 반응 시에는 병원균과 유산균을 동시에 첨가하여 실험한다.

＜결과 및 추론＞

도 4에 나타났듯이 W. kimchii PL9023은 pH 4.4에서만 self-aggregation 이 일어났다. 이것은 Weissella kimchii PL9023이 인체내에서 정상 균총으로 존재할 수 있는 것을 보여주는 것이다. 비뇨기 감염 병원성 세균과 같이 배양한 경우 W. kimchii PL9023은 C. albicans 와 모든 pH에서 coaggregation을 보였으며 다른 병원성 세균과는 뚜렷한 응집 반응을 보이지 않았다 (도 5). 이는 W. kimchii PL9023에 의해 다른 세균이 질 세포에 부착이 용이하게 되지 않는 것을 보여준다.

[실험 예 6] 유산균의 질 세포 부착 능력 검사

유산균이 병원균의 세포 부착을 억제하는 것은 유산균이 병원균과 경쟁적으로 세포에 부착하는 기전과 유산균이 병원균과 응집하여 병원균의 부착을 억제하는 두 가지 기전이 있다. 먼저 유산균 자체의 세포 부착능력을 측정하였다.

＜재료 및 실험방법＞

질 세포의 분리

갱년기 이전의 건강한 여성의 질 내벽을 pop brush로 3번 연속 긁어서 세포를 얻어 10 ml minimal essential medium에 현탁액을 만든다. 질 세포에 존재하는 세균은 10 ml의 MEM에서 30초간 흔든 후 5분간 원심분리(750 X g)로 씻어내는 것을 세 번 반복하여 제거한다. 다음, 여과지(8 ㎛)로 여과하여 여과지의 세포를 다시 배지에 2 X 10 ⁴ cells/ml 되도록 농도를 맞추어 실험하였다.

W. kimchii PL9023 의 질 세포 부착 정도 측정

동량의 MEM 배지에 각각 준비된 W. kimchii PL9023 (10 ⁸ cells/ml)과 질 세포 (2 x 10 ⁴ cells/ml)를 혼합하여 orbital shaker (100 rpm/min)에서 37에서 30분간 흔들어 준다. 이를 여과지(8 ㎛)로 여과하여 세균을 제거하고 동량의 MEM으로 세척한다. 여과지에 붙은 세포를 알루미늄이 도포된 유리 슬라이드에 놓고 메탄올로 고정하고 그람 염색을 하여 현미경 하에서 관찰한다.

＜결과 및 고찰＞

도 6에서 보이듯이 W. kimchii PL9023는 질 세포에 부착능력이 뛰어나 pH 7.2에서도 vaginal cell 1개당 평균 100개 이상이 부착되었으며, pH 4.4에서 가장 많은 수가 부착되었다.

[실험 예 7] W. kimchii Strain L9023에 의한 유해세균의 사람 질 세포 부착 억제 검사

W. kimchii PL9023이 먼저 결합한 경우 병원균의 부착이 얼마나 저하되는 지 알기 위해서는(exclusion test) 다음과 같이 실험하였다. 동량의 MEM 배지에 들은 W. kimchii PL9023 (10 ⁸ cells/ml)과 질 세포 (2 x 10 ⁴ cells/ml)를 혼합하여 orbital shaker (100 rpm/min) 에서 37에서 30분간 흔들어 준다. 여기에 각 병원균(1-2 x 10 ⁶ cells/ml)을 첨가하여 다시 30분간 흔들어준다. 다음 여과지(8 ㎛)로 여과하여 세균을 제거하고 동량의 MEM으로 세척한다. 여과지에 붙은 세포를 알루미늄이 도포된 유리 슬라이드에 놓고 메탄올로 고정하고 그람염색을 하여 현미경 하에서 관찰한다.

이미 부착된 세균을 떨어뜨리는 효과를 측정 (Displacement test)하기 위해서는 먼저 병원균과 질 세포를 배양한 뒤 30분 후 W. kimchii PL9023을 첨가하여 배양하고 위와 동일한 방법으로 세균을 제거한 뒤 부착된 세균의 수를 계수한다. 이때 통계처리를 위해 각 배양 접시에서 20개의 필드를 무작위로 선택해서 각 필드에 존재한는 세균의 수를 계수하였다. 표준편차는 Sigma Plot (SPSS Inc., Chicago, USA)를 이용하여 계산하였다.

＜결과 및 고찰＞

표 3. W. kimchii PL9023이 각종 비뇨기 감염 세균의 질 세포 부착 억제 정도

1. C. albicans vaginal cell 1개에 부착된 세균의 개수

2. E. coli

3. S. aureus

4. Strep. agalactiae

병원성 세균들은 vaginal cell 1개당 평균 7개의 E. coli 와 8개의 Strep. agalactiae , 13개의 C. albicans 와 16개의 S. aureus 가 부착되었으며 낮은 pH에서 덜 부착되었다 (도 7). C. albicans 의 경우 유산균에 의해 세가지 테스트 그리고 각 pH 조건에서 부착되어 남아있는 수가 대조군에 비해 50％로 W. kimchii Strain PL9023에 의해 부착이 많이 억제되었다. 특히 pH 4.4에서는 각 테스트 조건에서 W. kimchii Strain PL9023이 현저한 부착 억제능을 나타냈다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 프로바이오틱 균주 웨이셀라 김치 PL 9023( Weissella kimchii Strain PL9023, KACC 91139)는 인체 안정성이 확인되었으며, 여성 질감염 세균들에 대한 성작억제력과 부착억제력이 뛰어남이 확인되었다. 본 발명의 프로바이오틱 균주 웨이셀라 김치 PL 9023 ( Weissella kimchii Strain PL9023, KACC 91139)는 각종 비뇨기 감염 질환의 예방제 및 치료제 등으로 사용할 수 있으며, 경구 투여제, 질좌제, 뇨도간 삽입제, 인공 뇨도관 코팅제등 비뇨기 질 환 예방제 및 치료제 제조에 직접 사용되거나, 이를 목적으로 하는 기능성 식음료의 첨가제나 발효제로 사용될 수 있다.