本発明は、プロバイオティクス機能を維持する、生残性の良好なビフィズス菌菌体粉末に関する。

ビフィズス菌は、食品の製造に広く利用されており、醗酵乳、乳酸菌飲料等の乳製品を製造する際に用いられている。 さらに、近年、腸内有害菌抑制作用、免疫調節作用、コレステロール低下作用、感染防御作用等の生菌体を摂取することによって発揮される生体調節機能であるプロバイオティクス機能が次々と明らかにされており、ビフィズス菌の菌体自体やビフィズス菌培養物等を健康食品や医薬品等の素材として利用するための開発がなされている。 また、これらのビフィズス菌は家畜や家禽の飼料に配合して使用されている。 これまで家畜や家禽等の健康維持管理を目的に抗生物質が多量に投与され、いわゆる薬剤耐性菌が発生するという問題が発生しているが、プロバイオティクス機能を有するビフィズス菌を投与することによって、家畜や家禽の健康状態を維持したまま、薬剤耐性菌の発生を抑制することができるという報告もなされている。

ビフィズス菌菌体をヒトや動物に投与する場合、これを粉末化し、タブレット、カプセル、顆粒剤、散剤等として使用している。 ビフィズス菌菌体をタブレット、カプセル、顆粒剤、散剤等にする場合、ビフィズス菌菌体粉末と賦形剤や他の成分とを混合する必要があるが、粉末同士を均一に混合しようとするとき、混合する粉末の粒子径が均一でなかったり、粒子形状が異なっていると、いわゆる分級という現象が起こり粉末の均一な分散が出来なくなる。 また、カプセル、シームレスカプセル、あるいは粒子形状の小さいソフトカプセル内にビフィズス菌菌体粉末を封入しようとする場合、微小な空間内にビフィズス菌菌体粉末を封入しなければならないが、粉末の粒子形状が円形または楕円形であると、カプセル内にビフィズス菌菌体粉末が均一にかつ効率的に分散する。 しかし、ビフィズス菌菌体を凍結乾燥し、機械的に粉砕して調製した粉末の場合、平均粒子径としてはある程度粒子の大きさが揃っていても、その形状が不定形であるので、微小な空間に不定形の粉末を均一にかつ効率的に封入するのは難しいという欠点が見られる。 これは打錠機による打錠成型時も同様である。 さらに、ブロック状の固形物ができるので、機械的に粉砕する等の工程をさらに行わないと均一な粒子径の粉末ができないという欠点があり、しかも粉砕を行っても、粒子形状が線状となり、円形または楕円形にはならない。

一方、噴霧乾燥により得られるビフィズス菌菌体粉末は、デンプン等の賦形剤に取り込まれてその粒子形状が円形または楕円形となり、凍結乾燥等の方法によって乾燥し機械的に粉砕して調製した粒子形状が線状の粉末よりカプセル内にビフィズス菌菌体が均一にかつ効率的に分散するという利点がある。 また、噴霧乾燥は試料を凍結し減圧状態で凍結したまま乾燥させる凍結乾燥に比べ、エネルギーや設備に要するコストが格段に安い。
したがって、ビフィズス菌菌体粉末を調製するためには、利用しやすさや調製コストの面から凍結乾燥より噴霧乾燥の方が圧倒的にメリットが多く、噴霧乾燥によるビフィズス菌菌体粉末の調製は、これまでに多くなされてきた。

食品や健康食品、医薬品、飼料への利用が広がっているビフィズス菌菌体ではあるが、このような中、ビフィズス菌菌体の用途を広げる可能性の一つとして、ビフィズス菌菌体自体の生残性を上げようとする試みがなされている。 一般的に、プロバイオティクス機能とは、生菌をヒトまたは動物に与えることによって、摂取したヒトまたは動物に対して発揮される有用な生体調節機能を指している。 そのため、発酵食品としての発酵乳、発酵乳乳酸菌飲料、乳酸菌飲料においては、商品の規格として生菌数が規定されており、商品の成立条件としてビフィズス菌を含む乳酸菌菌数の維持が求められており、これらの製品中で生菌数を維持することは重要な課題である。
また、生菌数を維持すると同時に、上記のビフィズス菌菌体を摂取することによるプロバイオティクス機能が失活しないようにすることも重要な課題である。

しかしながら、ビフィズス菌は、酸、温度、pH、塩濃度、水分活性、胆汁酸等の各種の環境ストレスに弱いものが多く、実際に上記製品に使用する場合には用途が限定される場合が多い。 前述のように、ビフィズス菌菌体粉末の粒子形状やコストの面では凍結乾燥より噴霧乾燥の方がメリットが多いが、ビフィズス菌は熱に弱く、噴霧乾燥の際に、液体を微粒子化し熱風にさらされることによって生残率が低下し、ビフィズス菌菌体が有するプロバイオティクス機能が損なわれる場合が多かった。

乳酸菌等の菌体粉末を得る一般的な方法として、デンプン糊化菌製剤法を挙げることが出来る（例えば、非特許文献１参照。）。 これは菌体懸濁液に糊化したデンプンを賦形剤として加え、さらにL-システイン、L-リジン、グルタミン酸Na等の保護剤を加えて減圧乾燥させる方法である。 この方法によると、生菌数は減圧乾燥法で7.2log/g（対照実験として、凍結乾燥で9.6log/g、噴霧乾燥で8.4log/g）であったとしている。 この発明では賦形剤としてデンプンを使用することが示されているものの、全て「糊化したデンプン」が用いられている。

また、噴霧乾燥機の噴霧ノズルを改良することによって、乳酸菌及びビフィズス菌懸濁液の粒子径が10μm以下になるようにサブミクロン化し、噴霧乾燥することによって、生残率が向上した乳酸菌及びビフィズス菌菌体粉末を調製することが可能となったという報告がある（例えば、特許文献１参照。）。 この発明の骨子は、乳酸菌及びビフィズス菌懸濁液の粒子径を、噴霧ノズルを工夫することによってサブミクロン化することである。 この発明の明細書中でも菌体液に配合することができる結合剤の一つとしてα化デンプンが示されているものの、これは「糊化したデンプン」である。

さらに、ビフィズス菌菌体の噴霧乾燥条件について、糊化したデンプンとビフィズス菌菌体とを混合し噴霧乾燥したところ、デンプンのネットワークの中にビフィズス菌菌体が取り込まれる形になった場合に生残性が良好であったという報告がある（例えば、非特許文献２参照。）。 この報告によると、ビフィズス菌の生残率が、糊化したデンプンを使用しない場合には10％程度であったのに対し、糊化したデンプンを添加して噴霧乾燥した場合は30％程度に上昇したと記載されている。

このようにビフィズス菌の生残率の低下を防ぐ種々の方法が開示されているものの、生残率が著しく向上したという結果を示しているものはなく、また噴霧ノズルの改良等による噴霧乾燥機自体の変更や工程の変更を伴ったりするので煩雑である。

特許第3363438号公報

光岡知足編、ビフィズス菌の研究、日本ビフィズス菌センター刊、（1994） K． O'Riordan、D． Andrews、P． Conway、J． Appl． Microbiol． 91: 1059-66 (2001)

本発明は、整腸作用や腸内有害菌抑制作用、免疫調節作用、コレステロール低下作用、感染防御作用等の、ビフィズス菌菌体を摂取することによって発揮されるプロバイオティクス機能を維持する、生残性が良好なビフィズス菌菌体を含有する乾燥粉末を得ることを課題とする。
また、ビフィズス菌菌体粉末の粒子径が不均一であったり粒子形状が異なると、他の成分と混合する場合に分級が起こり均一な分散が出来なくなったり、また、カプセル内に封入しようとする場合及び打錠成型時に、微小な空間に不定形の粉末を均一にかつ効率的に封入するのは難しいという欠点を解決することを課題とする。

発明者らは鋭意研究を行った結果、ビフィズス菌培養液と、糊化していないデンプン粉末またはデンプンの水懸濁液とを糊化しないように懸濁状態で混合することにより、不定形のデンプン破砕物を含有しない、粒子径が均一であり一定の粒子形をもった、生残性が良好なビフィズス菌菌体粉末を効率よく得ることに成功し、本発明を完成させるに至った。
また、本発明はプロバイオティクス機能を保持するビフィズス菌菌体を含有する乾燥粉末を調製する際に、ビフィズス菌の培養液と、糊化していないデンプンの粉末または懸濁液とを、デンプンが糊化しないように混合して懸濁液とし、この懸濁液を噴霧乾燥することを特徴とする生残性が良好なビフィズス菌菌体粉末の製造方法である。
従来技術として、糊化したデンプンの粉末または懸濁液と乳酸菌培養液とを混合して噴霧乾燥することは開示されているが、糊化していないデンプンの粉末または懸濁液とビフィズス菌培養液とを糊化しないように懸濁して噴霧乾燥する本発明の方法により、粒子径が均一であり一定の粒子形をもつ粉末が得られるという噴霧乾燥のメリットを維持しながら、生残性が減少するという噴霧乾燥のデメリットを防止するという格別の効果を生ずる。

デンプンを水中に懸濁し加熱すると、デンプン粒は吸水して次第に膨張し、加熱を続けると最終的にはデンプン粒は崩壊し溶解する。 この現象を糊化と呼んでいる。 デンプンはその骨格をなす水に難溶性のアミロペクチンと、これに包蔵される水溶性のアミロースから構成されており、デンプンの糊化は結晶構造をとっているアミロペクチンの隙間に水分子が入り込むことでその構造が緩み、各枝が水中に広がることによって起こるものと考えられている。 糊化温度はデンプンの原料により異なるが、通常60〜80℃である。 本発明は、デンプンと水とが糊化しないよう糊化温度以下の室温（25℃前後）で混合してデンプンが糊化していない懸濁液とし、これにビフィズス菌の菌体培養液を混合して噴霧乾燥することを特徴とする。 糊化していないデンプン粉末とビフィズス菌の菌体培養液を混合して噴霧乾燥しても良い。 このようにして得られた本発明のビフィズス菌菌体粉末を光学顕微鏡で観察すると、ビフィズス菌体は観察されず、デンプン粉末及びデンプンに囲まれたビフィズス菌菌体粉末の二粉体が混合した状態となっている。 この状態で水を加えるとビフィズス菌体が観察された。 したがって、ビフィズス菌体の表面はデンプンに覆われているものと考えられる。

また、本発明は、糊化していないデンプンの粉末または懸濁液とビフィズス菌の培養液とを糊化しないように混合して懸濁液とし、この懸濁液をノズルや圧力で微細な円形または楕円形の液滴にして噴霧乾燥を行うため、ビフィズス菌菌体粉末の粒子径が正規分布である上、光学顕微鏡で観察した場合、デンプン粉末及びデンプンに覆われたビフィズス菌菌体粉末は、不定形のデンプン破砕物を含有せず、いずれもほぼ球形の粒子からなっている。 本発明のビフィズス菌菌体粉末の形状は、糊化したデンプンと混合して噴霧乾燥する従来方法のものとほぼ同様であるが、本発明のビフィズス菌菌体粉末を偏光顕微鏡で観察すると、ビフィズス菌菌体粉末のうちデンプン粉末は、デンプンが糊化していないことを示す特徴的な十字（干渉輪）を見ることができる。

ビフィズス菌懸濁液を糊化したデンプンと混合して噴霧乾燥した従来の方法により得られたビフィズス菌粉末を光学顕微鏡で観察したところ、本発明の糊化していないデンプンと混合したビフィズス菌粉末と同様に、ビフィズス菌体は観察されず、この状態で水を加えると菌体が観察された。 形状も本発明のビフィズス菌菌体粉末とほぼ同様であるが、偏光顕微鏡で観察すると糊化したデンプンと混合して噴霧乾燥したものは、十字（干渉輪）を見ることができない。

本発明によって製造したビフィズス菌の粉末は、凍結乾燥によってビフィズス菌を粉末化し、機械的な粉砕工程を経て、糊化していないデンプンと混合、または、凍結乾燥によってビフィズス菌を粉末化した後、糊化していないデンプンと混合し機械的な粉砕を行った粉末とは、前述のように光学顕微鏡で観察することによって線状粉末か、球形又は楕円形であるかの相違を確認することができる。
また、ビフィズス菌懸濁液を糊化したデンプンと混合して噴霧乾燥した従来方法により得られたものとは、前述のように偏光顕微鏡によって十字（干渉輪）の有無を観察することによって異なることを確認することができる。

本発明により得られるビフィズス菌菌体粉末は次のような効果を奏する。
（１）糊化していないデンプンを用いて噴霧乾燥したビフィズス菌菌体粉末は、糊化したデンプンを用いて噴霧乾燥したビフィズス菌菌体粉末と比較して生残性に優れている。
（２）凍結乾燥に比べ、ビフィズス菌菌体粉末の粒子径が均一で粒子形も同一であるので、他の成分と混合する場合に生ずる分級が起こらず、均一な分散が出来る。 また、カプセル及び錠剤内にビフィズス菌菌体粉末を封入しようとする場合、カプセル及び錠剤内の微小な空間にビフィズス菌の菌体を均一かつ効率的に分散させることができる。
（３）凍結乾燥に比べ、エネルギーや設備に要するコストが格段に安い噴霧乾燥により、ビフィズス菌菌体粉末を得ることができる。
（４）凍結乾燥で調製した場合には、ブロック状の固形物ができるので、機械的に粉砕等の工程をさらに行わないと均一な粒子径の粉末ができないが、本発明は噴霧乾燥だけで不定形のデンプン破砕物を含有しない、均一な粒子径の粉末を得ることができる。
（５）噴霧ノズルの改良や減圧乾燥等の方法によらずとも、通常の噴霧乾燥装置を用いて、粒子径が均一で粒子形状も同一であるビフィズス菌菌体粉末を得ることができる。

本発明に使用するビフィズス菌としては、発酵乳に使用されているビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B. pseudolongum）等を挙げることができる。 しかし、使用するビフィズス菌は、これらの菌種に限定されるものではない。

本発明に使用するビフィズス菌は、乳培地、乳成分を含む培地、半合成培地等種々の培地を用いて培養することができる。 このような培地としては、脱脂粉乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地、BL培地、MRS培地等を例示することができる。 また、乳や、大豆等の植物原料や、これらに酵母エキス、ペプトン、ビタミン、ミネラル等の適当な栄養源を加えたり、タンパク質分解酵素を作用させたりして調製した液体培地で、これらのビフィズス菌を培養する。

培養方法として、通常の液体培地、液体培地の上層を不活性ガスや二酸化炭素で置換したもの、pHを一定にした中和培養や回分培養及び連続培養等、さらには、適当な分画サイズを有する分離膜を使用して、ビフィズス菌の培養生成物である乳酸と酢酸を除去した培養を挙げることが出来るが、菌体が良好に生育する条件であれば、培養方法はこれらの方法に特に限定されるものではない。

培養終了後、菌体培養液を、糊化していないデンプンの粉末または懸濁液とデンプンが糊化しないよう十分混合してデンプンが沈殿しないうちに噴霧乾燥に供する。 糊化していないデンプン懸濁液とはデンプン粉末を水または糊化する温度以下の温水に混合したものである。 また、遠心分離や膜分離によって適当な濃度まで濃縮した菌体培養液、または菌体培養液を生理食塩水や滅菌水等適当な洗浄液で適当な回数、好ましくは１〜３回、洗浄した菌体培養液を、糊化していないデンプンの粉末または懸濁液とデンプンが糊化しないよう十分混合してデンプンが沈殿しないうちに噴霧乾燥することもできる。 さらに、菌体を洗浄して適当な噴霧乾燥保護剤と混合した後に、糊化していないデンプンの粉末または懸濁液とデンプンが糊化しないよう十分混合してデンプンが沈殿しないうちに噴霧乾燥することもできる。

本発明に使用するデンプンは、特に限定されるものではなく、馬鈴薯、甘藷、玉蜀黍、小麦、米、タピオカ等、広く使用されているデンプンであれば、どのような由来のものでも使用することができる。 また、これらのデンプンを単独で、または混合して使用することもできる。

噴霧乾燥の条件としては、噴霧圧力50〜200kPa、熱風温度60〜150℃、排風温度30〜120℃が好ましい。 噴霧時のノズルとしては、遠心型ノズル、二流体ノズル等を例示することができるが、通常の噴霧乾燥に使用されるものであれば、特に限定されるものではない。

本発明により得られる粉末に含まれるビフィズス菌の生菌数は通常1×10 ⁸個/gから5×10 ¹³個/gであり、望ましくは1×10 ¹⁰個/gから5×10 ¹²個/g である。

本発明の糊化していないデンプンを用いて噴霧乾燥したビフィズス菌菌体粉末は、糊化したデンプンを用いて噴霧乾燥したビフィズス菌菌体粉末と比較して生残性に優れている。 本発明では、ビフィズス菌の培養液と、糊化していないデンプンの粉末または懸濁液とを、デンプンが糊化しないように十分混合するが、噴霧乾燥時に一部のデンプンは糊化し、ビフィズス菌を取り囲んでビフィズス菌表面を覆う。 糊化していないデンプンを用いて噴霧乾燥した方が生残性に優れているのは、糊化していないデンプンを用いて噴霧乾燥する際に、一部のデンプン粒が糊化して菌体を取り囲む際に菌体に加えられる熱がデンプンの糊化に使用され、菌体の熱によるダメージが少ないためと考えられる。 一方、従来方法である糊化したデンプンを用いて噴霧乾燥した場合、デンプンは既に糊化しているので、噴霧乾燥による熱が直接菌体に加わり、菌体が熱によるダメージを受けて生残性が低くなるものと考えられる。

本発明により得られたビフィズス菌菌体粉末は、そのままの状態でプロバイオティクス機能を持つ健康食品として利用することができるし、また、糖衣錠やタブレット等の錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤等の形態に加工して利用することも可能である。
また、本発明のビフィズス菌菌体粉末は、単独であるいは乳酸菌と混合してスターターとして乳に添加して乳酸発酵させて調製した発酵乳や、発酵ミックスにこれらの粉末を添加して乳酸発酵させたものに用いることができる。 さらに、他の乳製品、食肉製品、水産練製品、デザート類、ドレッシング類、健康食品類、麺類、飲料等の様々な飲食品に利用可能である。
さらにまた、本発明は、牛、豚、鶏等の家畜の飼料や、犬、猫等のペットフードに添加して利用することができる。 また、サイレージ発酵を促進させるためのスターターとして利用することも可能である。

以下に本発明のビフィズス菌菌体粉末に関し、実施例及び試験例により詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM P-10657株をBL培地（光岡知足編、ビフィズス菌の研究、日本ビフィズス菌センター刊、1994）で37℃、16時間静置培養し、連続式遠心分離機により10倍に濃縮した。 この培養濃縮液と等量の糊化していない10％タピオカデンプン懸濁液を25℃で糊化しないように混合し、噴霧乾燥機にて入口温度100℃、出口温度50℃で噴霧乾燥し、本発明のビフィズス菌菌体粉末を得た。 粉末中の生菌数は1.4×10 ¹¹個/gであった。

［試験例1］
イソプロパノール中に実施例１で得られたビフィズス菌菌体粉末を懸濁し、レーザー粒度分布測定装置（島津SALD-2000J）で粉末の粒子径分布を測定した。 コントロールとして、培養濃縮液に70℃で混合して糊化させた同量の10％タピオカデンプン懸濁液と混合し、噴霧乾燥機にて実施例１と同一条件で噴霧乾燥して得られたビフィズス菌菌体粉末の粒子径分布を測定した。
結果を図１に示す。 本発明のビフィズス菌菌体粉末は正規分布を示している。 コントロールとして糊化したデンプン懸濁液を用いたビフィズス菌菌体粉末の粒子径分布も正規分布を示した。
光学顕微鏡で観察した場合、本発明のビフィズス菌菌体粉末は、ほぼ球形の粒子のみからなっており、凍結乾燥等の液滴を調製しない方法で乾燥した粉末を機械的に微粒子化した時に見られる線状の不定形な破砕物は含まれていなかった。 さらに、菌体粉末を偏光顕微鏡で観察するとデンプンが糊化していないことを示す特徴的な十字（干渉輪）を見ることができた。 コントロールとして糊化したデンプン懸濁液を用いたビフィズス菌菌体粉末は、形状は本発明のものとほぼ同じであるが、十字（干渉輪）を見ることができなかった。

ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM P-10657株を、乳糖を最終濃度で1％となるように添加したBL培地（光岡知足編、ビフィズス菌の研究、日本ビフィズス菌センター刊、1994）に接種し、NaOH水でpH6.0に保持しながら、37℃、16時間培養した。 培養物を遠心分離機にて20倍濃縮した。 この培養濃縮液に同量の糊化していない10％馬鈴薯デンプン懸濁液を25℃で糊化しないように懸濁・混合し、噴霧乾燥機にて入口温度125℃、出口温度60℃で噴霧乾燥し本発明のビフィズス菌菌体粉末を得た。 コントロールとして、培養濃縮液に70℃で混合して糊化させた同量の10％馬鈴薯デンプン懸濁液と混合し、噴霧乾燥機にて同一条件で噴霧乾燥してビフィズス菌菌体粉末を得た。 本発明のビフィズス菌菌体粉末中の生菌数は8.5×10 ¹¹個/g、コントロールは1.6×10 ¹¹個/gであり、糊化していないデンプン懸濁液と混合した本発明の菌体の生残率が、糊化したデンプン懸濁液を用いたビフィズス菌粉末より5倍以上高かった。
本発明のビフィズス菌菌体粉末を、光学顕微鏡で観察した場合、ほぼ球形の粒子のみからなっており、線状の不定形な破砕物は含まれていなかった。 さらに、菌体粉末を偏光顕微鏡で観察すると、デンプンが糊化していないことを示す特徴的な十字（干渉輪）を見ることができた。
コントロールとして、糊化したデンプン懸濁液を用いたビフィズス菌菌体粉末は、形状は本発明のものとほぼ同じであるが、十字（干渉輪）を見ることができなかった。

ビフィドバクテリウム・ロンガムFERM P-8743株を、乳糖を最終濃度で1％となるように添加したBL培地（光岡知足編、ビフィズス菌の研究、日本ビフィズス菌センター刊、1994）に接種し、NaOH水でpH6.0に保持しながら、37℃、16時間培養した。 培養物を遠心分離機にて20倍濃縮した。 この培養濃縮液に同量の糊化していない10％馬鈴薯デンプン懸濁液を25℃で糊化しないように懸濁・混合し、噴霧乾燥機にて入口温度125℃、出口温度60℃で噴霧乾燥し本発明のビフィズス菌菌体粉末を得た。 コントロールとして、培養濃縮液に70℃で混合して糊化させた同量の10％馬鈴薯デンプン懸濁液を混合して噴霧乾燥機にて同一条件で噴霧乾燥してビフィズス菌菌体粉末を得た。 本発明のビフィズス菌菌体粉末中の生菌数は8.7×10 ¹¹個/g、コントロールは5.9×10 ¹¹個/gであり、糊化していないデンプンと混合した本発明の菌体粉末の生残率が、糊化したデンプンを用いたビフィズス菌菌体粉末より1.4倍以上高かった。
本発明のビフィズス菌菌体粉末を、光学顕微鏡で観察した場合、ほぼ球形の粒子のみからなっており、線状の不定形な破砕物は含まれていなかった。 さらに、本発明のビフィズス菌菌体粉末を偏光顕微鏡で観察するとデンプンが糊化していないことを示す特徴的な十字（干渉輪）を見ることができた。 コントロールとして糊化したデンプンを用いたビフィズス菌菌体粉末は、形状は本発明のものとほぼ同じであるが、十字（干渉輪）を見ることができなかった。

実施例１で得られたビフィズス菌菌体粉末50g、ラクトース140g、シュガーエステル8g、カルボキシメチルセルロース2gを混合し、圧縮錠剤製造機（y-5010-Q、富士薬品機械社製）により圧縮(条件2〜3ton)して、錠剤を製造した。

ビタミンＣとクエン酸の等量混合物40g、グラニュー糖45g、コーンスターチと乳糖の等量混合物60gに、実施例２で得られたビフィズス菌菌体粉末40gを加えて混合した。 混合物をスティック状の袋に詰め、1袋1.5gの栄養健康食品を製造した。

実施例１で得られたビフィズス菌菌体粉末0.1％とラクトバチルス・アシドフィルスの脱脂乳培養物1％をヨーグルトミックス（生乳に脱脂粉乳を2％添加し、100℃、10分間加熱した）に接種し、紙カップに充填後、37℃で6時間培養し、発酵乳を調製した。

収穫したアルファルファ材料草を軽く乾燥し、マウントカッターで15〜25mmに切断し、実施例２で得られたビフィズス菌菌体粉末１部とラクトバチルス・アシドフィルスの培養物粉末５部とを混合し、この菌体混合物を材料草1gあたり10 ⁵ cfuとなるように接種した。 ポリサイロを30℃で10日間貯蔵して、サイレージを調製した。

実施例１で得られたビフィズス菌菌体粉末（本発明品）及び糊化したデンプンを用いたビフィズス菌菌体粉末（コントロール品）の粒子径分布を示す。