技术领域
[0001] 本
发明涉及医药领域，特别涉及一种蓬蘽花色苷及其用途，尤其是天然来源的蓬蘽花色苷在制备降糖功能食品、保健品或降糖药物中的应用。
背景技术
[0002] 糖尿病是当前威胁人类健康最重要的非传染性
疾病之一。糖尿病的发展往往会伴随其他代谢综合症的迸发，如高血脂、肾衰竭和
炎症等，给人类带来巨大的肉体与精神上的痛苦。糖尿病分为两种：1型糖尿病(胰岛素依赖)和2型糖尿病(非胰岛素依赖)。根据国际糖尿病联盟IDF统计，2011年全球糖尿病患者人数高达3.7亿，且2型糖尿病患者人数占总糖尿病患者人数的90％，到2030年，预计全球将有近5.5亿糖尿病患者。因此，对于研究糖尿病及其并发症的
预防及控制策略刻不容缓。
[0003] 蓬蘽(蔷薇科悬钩子属中空心莓组)，具有抗寒性强、果实品质优良、植株直立性和丰产性强等优点，是直接开发和育种的优良种质材料。然而，迄今为止人们对蓬蘽中的
植物化学成分研究较少。本
发明人在前期的研究
基础上发现蓬蘽中富含花色苷，其中天竺葵素-3-O-
葡萄糖苷为主要花色苷。花色苷是广泛存在于果蔬中的一类
水溶性色素，不同种类的花色苷结构不同，其
颜色也各不相同，从而赋予了果蔬由红色、紫红到蓝色等鲜艳的色彩。
近年来，大量的研究证实天然果蔬来源的花色苷具有抗
氧化、抗
肿瘤、预防心
血管疾病及控制肥胖等
生物活性。
[0004] 目前蓬蘽中花色苷组分尚未揭示清楚，且未有蓬蘽花色苷在活体内的降糖研究与报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于，提供一种蓬蘽花色苷在制备降糖功能食品或降糖药物中的应用。
[0006] 本发明所述的蓬蘽花色苷是通过以下方法制备得到：
[0007] (1)将新鲜蓬蘽与50％-80％的
乙醇溶液按照料液比1g：4mL—1g：20mL的比例混合，水浴磁
力搅拌或超声提取60-240min，
真空抽率，在40-60℃下真空旋转
蒸发除去乙醇，得到蓬蘽花色苷粗提液；
[0008] (2)得到的蓬蘽花色苷粗提液用AB-8大孔
树脂纯化。将蓬蘽花色苷粗提液以0.5-5BV/h的流速注入大孔树脂中，先用去离子水以1-5BV/h的流速淋洗树脂，再用40-80％的甲醇或乙醇溶液以1-5BV/h的流速梯度洗脱，收集红色明显的洗脱液，在40-60℃下真空
旋转蒸发除去甲醇或乙醇，之后
冷冻干燥得到蓬蘽花色苷。
[0009] 本发明所述的蓬蘽花色苷冻干粉中花色苷含量为30％-80％(重量％)，蓬蘽花色苷为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-芸香糖苷，其中天竺葵素-3-葡萄糖苷为主要花色苷，占总花色苷含量的80％-95％。
[0010] 本发明证实蓬蘽花色苷能在体外抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其半数抑制浓度(IC50)为0.23μg/mL，活性要强于阳性对照药物阿卡波糖(33μg/mL)。
[0011] 本发明所述蓬蘽花色苷展现出显著的葡萄糖消耗活性，即促进细胞对葡萄糖的消耗，从而起到降糖作用。相对于阴性对照，蓬蘽花色苷具有显著的降糖作用，但其作用效果与阳性对照药物二甲双胍相当。
[0012] 本发明发现蓬蘽花色苷能够显著降低db/db糖尿病小鼠的空腹血糖，具有优良的降糖活性。
[0013] 本发明揭示了蓬蘽中花色苷的组分，即矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-芸香糖苷，其中天竺葵素-3-O-葡萄糖为主要花色苷，并提供了一种蓬蘽花色苷在制备降糖功能食品或降糖药物中的应用。蓬蘽花色苷能够通过抑制α-葡萄糖苷酶活性、促进细胞对葡萄糖的消耗，且能显著降低db/db糖尿病小鼠的空腹血糖，展现出优良的降糖活性。因此，蓬蘽花色苷可作为降糖功能食品或药物的原料，并用于糖代谢异常相关疾病的防治。
附图说明
[0014] 图1为
实施例1中蓬蘽花色苷组分的高效液相色谱图；
[0015] 图2为实施例3中阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用图；
[0016] 图3为实施例3中蓬蘽花色苷对α-葡萄糖苷酶的抑制作用图；
[0017] 图4为实施例4中蓬蘽花色苷的葡萄糖消耗作用图；
[0018] 图5为实施例5中蓬蘽花色苷动物体内降糖效果图。
具体实施方式
[0019] 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0020] 实施例1蓬蘽花色苷的制备
[0021] (1)将1000g新鲜蓬蘽洗净，按照料液比1：6(w/v)的比例加入70％的乙醇溶液充分混合，超声提取90min，超声结束后真空抽率，在60℃下真空旋转蒸发除去乙醇，得到蓬蘽花色苷粗提液；
[0022] (2)将所述蓬蘽花色苷粗提液注入大孔树脂中，先用去离子水以2BV/h的流速冲洗树脂，再用含40％-80％乙醇溶液以1BV/h的流速梯度洗脱，收集红色明显的洗脱液，在60℃下真空旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥得到蓬蘽花色苷，经计算，1000g的新鲜蓬蘽经上述步骤纯化后可得到2.81g的蓬蘽花色苷。
[0024] 将实施例1中的蓬蘽花色苷配成1mg/mL的溶液，并用高效液相检测，检测方法如下：流动相为A相(0.1％的乙腈)，B相(1.5％
甲酸水溶液)，梯度洗脱，5％-60％A相洗脱30min，进样量10μL，
温度30℃，流速0.8mL/min，检测
波长520nm。同时用矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-芸香糖苷标准品进行定性和定量分析。图1为蓬蘽花色苷组分的高效液相色谱图，峰1为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、峰2为天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、峰3为天竺葵素-3-O-芸香糖苷，其中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量占总花色苷含量的89.14％。蓬蘽花色苷组分的化学结构式如下：
[0025]
[0026] 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
[0027]
[0028] 天竺葵素-3-O-葡萄糖苷
[0029]
[0030] 天竺葵素-3-O-芸香糖苷
[0031] 实施例3蓬蘽花色苷的α-葡萄糖苷酶抑制实验
[0032] 配置一系列浓度的蓬蘽花色苷溶液，将5μLα-葡萄糖苷酶溶液(5U/ml，(溶于PBS，PH 6.8)与5μL蓬蘽花色苷混合后加入500μL的PBS溶液，37℃反应20min，加入10μL的10mM pNPG(对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷)溶液，37℃反应30min，再加入500μL的1mol/L Na2CO3，405nm下测吸光值，根据公式(1-Asample 405/Acontrol405)计算蓬蘽花色苷的α-葡萄糖苷酶半数抑制浓度IC50。图2和图3结果显示，蓬蘽花色苷能够有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其半数抑制浓度IC50为为0.23μg/mL，且活性显著强于阳性药物阿卡波糖(33μg/mL)。因此，蓬蘽花色苷能够有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而起到降糖作用。
[0033] 实施例4蓬蘽花色苷促进葡萄糖消耗实验
[0034] 将肝脏细胞HepG2接种于96孔板，每孔5000个细胞，细胞培养24h后，加药(阳性对照二甲双胍，终浓度为2mM；蓬蘽花色苷，终浓度为10μg/mL和25μg/mL)处理24h，去除培养基，再加入无血清培养基，培养12h，吸取部分培养基用葡萄糖
试剂盒(葡萄糖
氧化酶-过氧化酶法)测定葡萄糖含量，并用MTT法测定细胞数量进行校准。图4结果显示，在阴性对照组中，HepG2细胞的葡萄糖的消耗量为2.88±0.53mM，而经10μg/mL和25μg/mL的蓬蘽花色苷处理后，其葡萄糖的消耗量显著增加，分别为4.12±0.95mM和4.17±0.58mM，结果具有显著性差异。阳性对照二甲双胍药物处理后，其葡萄糖的消耗量也显著增加(4.63±0.24mM)。本实验结果说明，蓬蘽花色苷能够促进肝脏细胞HepG2对葡萄糖的消耗，从而起到降糖作用。
[0035] 实施例5蓬蘽花色苷的db/db小鼠降糖实验
[0036] 将48只db/db糖尿病模型小鼠(6周龄)随机均分为4组，每组12只。对照组
给药生理盐水；阳性对照为二甲双胍，给药剂量200mg/kg体重；蓬蘽花色苷低剂量组，给药剂量为50mg/kg体重，蓬蘽花色苷高剂量组，给药剂量为150mg/kg体重。所有小鼠适应饲养2周后，正式开始实验，实验周期为6周，每天灌胃并记录小鼠的体重、
摄食量和饮水量，分别于第一周、第三周和第六周测定血糖一次，六周后处死小鼠，结束实验。图5结果显示，连续灌胃六周后，阳性对照二甲双胍和蓬蘽花色苷高剂量组能够有效降低db/db小鼠的血糖，使其
血糖浓度分别降12.2±1.2mmol/L和13.2±1.8mmol/L，而阴性对照组的db/db小鼠空腹血糖浓度为18.1±6.7mmol/L。与阴性对照组相比，蓬蘽花色苷高剂量处理组结果具有显著性差异。因此，蓬蘽花色苷在体内展现出良好的降糖活性使其可作为降糖功能食品或降糖药物的原料应用于糖代谢异常相关疾病的防治。
