技术领域
[0001] 本
发明属于
食品加工领域，涉及一种豌豆低聚肽粉，其纯度高、活性好。本发明还涉及到一种豌豆低聚肽粉的制备工艺，工艺操作简便、绿色环保，适合大规模生产。
背景技术
[0002]
蛋白质是生命活动的
基础，是构成
机体的重要成分，生命进行新陈代谢活动本质上是由以蛋白质为中心的物质参与进行的。随着人们生活
水平的提高，迫切需要具有良好营养和功能特性的蛋白质用作
食品添加剂或原料。而多肽就是一种介于大分子蛋白和
氨基酸之间的一段极具活性、极易吸收、生理功能效价高的蛋白类物质，是由两个或两个以上的氨基酸组成的。科学家们发现，多肽对人体具有非常重要的不可替代的调节作用，这种作用几乎涉及到人体的所有生理活动。如：神经、消化、吸收、代谢、循环、生长、生殖、内分泌等。目前，市场上最为普遍的
植物肽类产品是大豆低聚肽，是利用大豆榨油后的副产品进行提取、酶解、纯化、干燥后获得的。功效实验表明大豆低聚肽具有易吸收、活性强等特点，尤其是具有降血压、降低胆固醇、清除自由基、抗疲劳等独特的生理活性。大豆低聚肽作为一种比
大豆分离蛋白更佳的新型大豆深加工产品，已经在食品饮料行业、医药行业等领域显示出独特的开发前景。豌豆是仅次于大豆的第二大食用豆类作物，大多数生产厂家对于豌豆的加工侧重于豌豆
淀粉成分的提取利用，而忽略豌豆蛋白的开发，把它作为生产废料或牲畜
饲料，造成豌豆资源浪费，为了改善豌豆蛋白的营养性能和可利用性，可以将豌豆蛋白酶解生成具有
生物活性的豌豆低聚肽加以利用。
[0003] 豌豆(Pisum Sativum L.)属豆类草本植物，又可称为荷兰豆、毕豆、国豆、寒豆等，起源于环地中海沿岸，包括西亚和北非等地区。豌豆性味甘平，具有解疮毒、利小便的功效，同时还具有生津消肿胀、止渴作用。长期以来，豌豆一直作为重要的食物之一为人类提供营养，它含有丰富的淀粉、蛋白质和其它营养物质。其中，蛋白质含量为21.1％～32.9％，高于绿豆和豇豆，而赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、
色氨酸、缬氨酸等必需氨基酸含量都符合联合国粮农组织和世界卫生组织推荐的标准模式，高于蚕豆和大豆。据报道，豌豆蛋白的生物价(BV)为48％～64％，功效比(PER)为0.6～1.2，高于大豆。豌豆蛋白质营养价值不能充分发挥的原因是其可消化性较差。因此通过加工豌豆蛋白来开发原蛋白未有功能特性是综合利用豌豆蛋白的一种有效手段。利用酶解技术以豌豆蛋白粉为原料生产豌豆肽，可广泛应用在食品、饮料、食品添加剂、保健品及
化妆品等行业中。
专利CN 107080263 A公布了豌豆肽的制备方法，利用蛋白含量在90wt％以上的豌豆蛋白粉通过多步酶解、过膜、
电渗析、浓缩后获得豌豆肽粉，其中60％以上分子量分布在1000Da以上，近30％分子量分布在2000Da以上，可见分子量较大，严格的说此产品不是低聚肽。同时原料的蛋白含量在90％以上，才可达到产品标准，而蛋白酶解液需要经过高速管式离心机离心，由于管式离心机单次处理能
力很有限，不易量产，离心上清液不经微滤膜进行初步过滤，直接进行3000Da的
超滤膜超滤，容易造成超滤膜阻塞，处理时间延长。专利CN 103436580 A将含量为85％以上的豌豆蛋白粉复溶后，依次经过酶解、过滤、离子交换、浓缩干燥得到豌豆蛋白肽。工艺中使用到离子交换工艺，离子交换工艺需要酸
碱再生，其再生
频率大，酸碱用量大，对周围的水和大气环境均有较大程度的影响。专利CN 101974593 A
发明人在蛋白酶解之前，将豌豆蛋白粉使用
乙醇和亚
硫酸钠进行预处理，亚硫酸钠会对眼睛、
皮肤、粘膜有刺激作用，污染水源，受高
热分解产生有毒的硫化物烟气，容易造成环境污染和人体健康。由此可见开发一种操作简便、低成本、高收率、绿色环保的豌豆低聚肽粉制备工艺成为学术界和产业界的研究热点。本发明针对
现有技术中存在的不足，提供了一种豌豆低聚肽粉的制备工艺，工艺简便、绿色环保，产品纯度高、成本低，较适合大规模生产。
发明内容
[0004] 本发明提供了一种高纯度、低分子量的豌豆低聚肽粉，同时提供一种操作简便、绿色环保、成本低、高收率的豌豆低聚肽粉的制备工艺。所制备的豌豆低聚肽粉具有较好的清除自由基的功效。
[0005] 一种豌豆低聚肽粉，其特征在于：肽含量在90wt％以上，其中80％以上豌豆肽的分子量小于1000Dalton。
[0006] 所述豌豆低聚肽粉的肽含量检测方法是参照中华人民共和国国家标准GB/T 22492-2008附录B和GB/T 22729-2008所述的肽含量的测定方法进行。
[0007] 所述豌豆低聚肽粉的肽相对分子量分布测定方法是参照中华人民共和国国家标准GB/T 22492-2008附录A和GB/T 22729-2008附录A所述的高效凝胶过滤色谱法(GPC)进行。
[0008] 所述豌豆低聚肽粉的制备方法，包括下述步骤：将豌豆蛋白粉加水复溶，依次经过酶解、纯化、浓缩和干燥后，得到豌豆低聚肽粉。
[0009] 所述制备方法中的豌豆蛋白粉为市售豌豆蛋白粉。
[0010] 所述的制备方法中用于蛋白酶解的生物酶可以为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、
罗汉果蛋白酶、无花果蛋白酶中的一种或者它们的混合物。
[0011] 所述的制备方法中的纯化方法可以为滤
膜过滤法和
树脂分离法，优选地使用滤膜过滤法。
[0012] 所述的制备方法中的浓缩方法可以为
真空浓缩、常压浓缩、膜浓缩法，优选地使用真空浓缩法。
[0013] 所述的制备方法中的干燥方法可以为真空干燥、加热干燥、晾干、
风干、
冷冻干燥和
喷雾干燥法。
[0014] 所述的豌豆低聚肽粉是通过下述方法制备得到的：
[0015] 豌豆蛋白粉预处理：将豌豆蛋白粉与水按重量比为1:20～1:30混合，记录此时体积为V，调整pH为8～12，搅拌20～30min后，加酸调整pH为3～5，去除上清液，沉淀物再加水至体积V，搅拌均匀，得到豌豆蛋白液；
[0016] 酶解：将豌豆蛋白液加热至35～60℃，将pH值调节至中性，加入至少豌豆蛋白粉重量的0.1wt％以上的中性蛋白酶，搅拌酶解至少3h，煮沸灭活至少2min，得到蛋白酶解液。
[0017] 分离纯化：将蛋白酶解液经微滤膜，在40～80℃下浓缩至固含为3～5wt％时，干燥后，得到豌豆低聚肽粉。
[0018] 一种组合物，其含有本发明所述的豌豆低聚肽粉和，药物或食品上可接受的助剂。
[0019] 根据现有技术，本发明可将所述的组合物制备成任意所述剂型，如素片、
薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液，以及液体、乳液、膏霜、粉、
块状等化妆品剂型。
[0020] 本发明所述的豌豆低聚肽粉用于制备
治疗或
预防自由基过多引起的症状的食品、保健食品或药品。
[0021] 与现有产品和技术相比，本发明具有如下优点：
[0022] (1)本发明提供的豌豆低聚肽粉具有纯度高、分子量小的特点，更易吸收，功效更强。
[0023] (2)本发明提供的豌豆低聚肽粉
水溶性很好，其水溶液澄清，口感好，尤其适合用作液体饮料等。
[0024] (3)本发明提供的豌豆低聚肽粉的制备工艺，仅用一步酶解、一种酶即可，无需多种酶多步
水解。使用到的生物酶种类越多，前期酶活力检测工作量也就越大，生物酶的购买成本也就越高，从而造成成本的上升。多步酶解造成工艺步骤复杂，水解时间延长，成本增加。
[0025] (4)本发明提供的豌豆低聚肽粉的制备工艺，不需要任何
有机溶剂，不需要任何有毒或有害的化学物质的加入，产品也就不可能有任何
有机溶剂或者任何有毒或有害的化学物质的残留，绿色环保，对人体无害，产品可以放心食用。
[0026] (5)本发明使用的蛋白酶均为食用酶，并且来源广泛、成本低、添加量少。
[0027] (6)本发明参照中华人民共和国国家标准GB/T 22492-2008附录B和GB/T 22729-2008所述的肽含量和相对分子量分布的测定方法进行检测，此方法公认度高。
实施例[0028] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。如无特别说明，实施例中用到的所有原料和溶剂均为市售产品。
[0029] 制备实施例1
[0030] 将100kg豌豆蛋白粉(蛋白含量为30wt％以上)，加水2000L，加入浓度约为2mol/L的食品级氢
氧化钠以调整pH为8.5～9.5，搅拌30min后，边搅拌边加入浓度约为1mol/L食品级
盐酸以调整pH为3.5～4.0，静置至沉淀物与上清液分离后，弃去上清液后，再加水至2000L，搅拌均匀，即为豌豆蛋白液。将豌豆蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入
100g食品级中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解至3h后，煮沸灭活2min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液经孔径为0.1μm的微滤膜处理后，在
温度约60℃下浓缩至固含为5wt％时，喷雾干燥，得到19.7kg豌豆低聚肽粉(批号W-1)，产率为19.7wt％。采用GB/T 22492-
2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为90.4％，小于1000Dalton分子量占95.6％。
[0031] 制备实施例2
[0032] 将100kg豌豆蛋白粉(蛋白含量为70wt％以上)，加水3000L，加入浓度约为2mol/L的食品级氢氧化钠以调整pH为10.5～11.0，搅拌30min后，边搅拌边加入浓度约为1mol/L食品级盐酸以调整pH为4.5～5.0，静置至沉淀物与上清液分离后，弃去上清液后，再加水至3000L，搅拌均匀，即为豌豆蛋白液。将豌豆蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入
100g食品级木瓜蛋白酶(酶活力为40万u/g)，搅拌酶解至3h后，煮沸灭活5min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液经孔径为0.5μm的微滤膜处理后，在温度约50℃下浓缩至固含为5wt％时，喷雾干燥，得到41.4kg豌豆低聚肽粉(批号W-2)，产率为41.4wt％。采用GB/T 22492-
2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为91.9％，小于1000Dalton分子量占96.3％。
[0033] 制备实施例3
[0034] 将100kg豌豆蛋白粉(蛋白含量为80wt％以上)，加水3000L，搅拌均匀，即为豌豆蛋白液。将豌豆蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入100g食品级中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解至3h后，煮沸灭活5min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液经孔径为0.5μm的微滤膜处理后，在温度约80℃下浓缩至固含为5wt％时，喷雾干燥，得到62.3kg豌豆低聚肽粉(批号W-3)，产率为62.3wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为92.4％，小于1000Dalton分子量占95.1％。
[0035] 制备实施例4
[0036] 将100kg豌豆蛋白粉(蛋白含量为80wt％以上)，加水3000L，搅拌均匀，即为豌豆蛋白液。将豌豆蛋白液加热至55℃，将pH值调节至中性，加入100g食品级菠萝蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解至3h后，煮沸灭活5min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液经孔径为0.5μm的微滤膜处理后，在温度约80℃下浓缩至固含为5wt％时，真空干燥后，得到60.9kg豌豆低聚肽粉(批号W-4)，产率为60.9wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为90.1％，小于1000Dalton分子量占95.8％。
[0037] 制备实施例5
[0038] 将100kg豌豆蛋白粉(蛋白含量为80wt％以上)，加水3000L，搅拌均匀，即为豌豆蛋白液。将豌豆蛋白液加热至50℃，将pH值调节至8.0～9.0，加入100g食品级碱性蛋白酶(酶活力为20万u/g)，搅拌酶解至3h后，煮沸灭活5min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液经孔径为10μm的微滤膜处理后，在温度约80℃下浓缩至固含为5wt％时，冷冻干燥后，得到62.6kg豌豆低聚肽粉(批号W-5)，产率为62.6wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为91.5％，小于1000Dalton分子量占96.0％。
[0039] 制备实施例6
[0040] 将100kg豌豆蛋白粉(蛋白含量为80wt％以上)，加水3000L，搅拌均匀，即为豌豆蛋白液。将豌豆蛋白液加热至45℃，将pH值调节至8.5～9.0，加入100g食品级胰蛋白酶(酶活力为20万u/g)，搅拌酶解至4h后，煮沸灭活2min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液经孔径为5μm的微滤膜处理后，在温度约60℃下浓缩至固含为5wt％时，常压干燥，得到64.2kg豌豆低聚肽粉(批号W-6)，产率为64.2wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为90.8％，小于1000Dalton分子量占95.6％。
[0041] 制备实施例7
[0042] 将100kg豌豆粉，加水3000L，加入浓度约为2mol/L的食品级氢氧化钠以调整pH为9.5～10.0，搅拌60min后，边搅拌边加入浓度约为1mol/L食品级盐酸以调整pH为3.5～4.0，静置至沉淀物与上清液分离后，弃去上清液后，再加水至3000L，搅拌均匀，即为豌豆蛋白液。将豌豆蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入100g食品级中性蛋白酶(酶活力为
30万u/g)，搅拌酶解至5h后，煮沸灭活20min，得到蛋白酶解液。将蛋白酶解液经孔径为0.5μm的微滤膜处理后，在温度约50℃下浓缩至固含为5wt％时，喷雾干燥，得到11.1kg豌豆低聚肽粉(批号W-7)，产率为12.3wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为91.8％，小于1000Dalton分子量占95.2％。
[0043] 生物活性实施例
[0044] PBS缓冲液的配制：称取
氯化钠8g，氯化
钾0.2g，
磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.62g，置于1000mL烧杯中，加入800mL蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，转移至1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
[0045] ABTS+贮存溶液的配制：精密称取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL蒸馏水，超声5min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密称取过
硫酸钾76mg左右，置于2mL棕色容量瓶中，加入1mL蒸馏水，超声使其溶解，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确吸取352μL过硫酸钾溶液加入至ABTS溶液中，摇匀，静置过夜。
[0046] ABTS+工作溶液的配制：精确吸取贮存溶液1mL，加入65mL左右PBS缓冲液，摇匀。
[0047] 供试品溶液的配制：取豌豆肽粉(W-1)适量，精密称定，置于20mL棕色容量瓶中，加入15mL PBS缓冲液，超声5min，用PBS缓冲液定容至刻度，摇匀，即得。
[0048] 操作步骤：准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均匀；准确吸取0.5mL供试品溶液和5mL PBS缓冲液混合均匀；准确吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS缓冲液混合均匀，立即在734nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
[0049] IR％＝[1-(Ai-Aj)/A0]*100％；
[0050] 其中，Ai表示待测溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
[0051] Aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
[0052] A0表示ABTS和溶剂混合后溶液的吸光度。
[0053] 配制豌豆肽粉(W-1)浓度为500μg/mL和1000μg/mL，以维生素C为阳性对照(浓度为100μg/mL)，测试结果如表1所示：
[0054] 表1豌豆肽粉清除自由基测试结果
[0055]
[0056] 由表1可知，本发明方法所制备的豌豆肽粉对ABTS自由基显示了较好的清除作用，具有较好的抗氧化活性。
