用于防治蓝莓毛色二胞枝枯病的解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其制备方法
阅读：1030发布：2020-05-29
专利汇可以提供用于防治蓝莓毛色二胞枝枯病的解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一株解 淀粉 芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensHMQAU140045，2015年12月1日保藏于中国科学院 微 生物 所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.11768。本发明为 蓝莓 毛色二胞枝枯病提供了一个高效的微生物，开辟了一个新的途径；本发明解淀粉芽孢杆菌菌株HMQAU140045对蓝莓毛色二胞枝枯病具有显著防效，且对其它病原菌引起的蓝莓枝枯病也具有较好的防效。，下面是用于防治蓝莓毛色二胞枝枯病的解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMQAU140045，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.11768。
2.一种由权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMQAU140045制备的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，菌剂的活性成分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMQAU140045的菌体和/或发酵滤液。
4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMQAU140045用于防治蓝莓毛色二胞枝枯病。
5.权利要求2或3所述的菌剂用于防治蓝莓毛色二胞枝枯病。
6.一种权利要求2或3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将低温保存的HMQAU140045菌株在LB固体培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上28℃培养24小时，获得活化的菌种；
(2)用无菌的接种环从LB斜面上刮取一环活化的菌种，接种于50mL LB液体培养基
130rpm，30℃振荡24h，收集菌体，并调整菌体浓度为108cfu/mL，获得种子液；
(3)发酵培养按体积比1.5％将步骤(2)得到的种子液接种于发酵培养基，于28℃，
180r/min摇培84h；
摇培得到的发酵液离心后，菌体用无菌水洗涤两次，离心，刮取沉淀的菌体置于无菌水中，配制得到只含菌体的菌剂A；
摇培得到的发酵液于4℃，12000rpm离心20分钟获得上清液，通过0.22μm的滤器，即得到只含发酵滤液的菌剂B；
摇培得到的发酵液离心后，刮取沉淀的菌体置于发酵滤液中，得到包含菌体和发酵滤液的菌剂C。
7.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法，其特征在于，
所述的LB固体培养基和LB斜面培养基的组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠
5g，琼脂粉15g，水1000mL，pH7.0；
所述的LB液体培养基的组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.0。
8.根据权利要求7所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：玉米粉1.0-3.0％，酵母提取物0.5-1.5％，胰蛋白胨0.5-1.5％，磷酸氢二钾0.3-0.7％，pH7.0，余量为水。
9.根据权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMQAU140045，其特征在于，所述用于检测解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMQAU140045的方法，是以待测菌株的基因组DNA为模版，以27f 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492r 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’为引物扩增16SrDNA，如果所得扩增产物为SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，即为HMQAU140045菌株。
用于防治蓝莓毛色二胞枝枯病的解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其
制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株防治蓝莓毛色二胞枝枯病的解淀粉芽孢杆菌HMQAU140045的筛选、鉴定、发酵、抑菌活性测定及蓝莓毛色二胞枝枯病的防治，属于农业生物技术领域。
背景技术
[0002] 蓝莓属于杜鹃花科Ericaceae，越橘属Vaccinium，是一种具有极高经济价值的小浆果果树，因其突出的营养保健价值，已被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一。蓝莓已经成为一个全国性的新兴主导产业，一个调整农业产业结构，带动农民致富，具有现代农业特征，并为中华民族健康服务的健康产业，蓝莓种植产业也已经成为我国果树种植业最热门的产业之一。近些年来，蓝莓种植面积也随之迅速扩大，2015年全国总面积达栽培31210公顷，比2013年的15300公顷激增了51％。
[0003] 然而，随着种植面积的迅速扩大和种植园的年限增加、年限增长、技术经验缺乏以及个体散户的管理不当等原因，蓝莓病害的种类日趋增多且危害程度日趋严重，蓝莓枝枯病目前已经成为制约蓝莓产量及品质的一种主要病害，而且引起枝枯病的病原种类也是复杂多样，目前中国报道的主要致病菌乌饭树拟茎点霉Phomopsis vaccinii、棒状拟盘多毛Pestalotiopsis clavispora、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea等。近年，在山东省青岛市胶南蓝莓病害调查中发现一种新的枝枯病病原真菌假可可毛色二胞Lasiodiplodia pseudotheobromae，该病侵染速度更加迅速，已对蓝莓生产构成了威胁。而且以上枝枯病病原菌可单独侵染，亦可复合侵染。对于蓝莓枝枯病的防治调查发现，田间目前主要还是采用化学药剂防治手段，但长期使用化学药剂导致的食品安全、病原菌抗药性及生态破坏也必将成为生产上面临的问题。因此寻找一种新的安全有效的措施来防治蓝莓毛色二胞枝枯病是当务之急。
[0004] 生物防治作为对环境友好，防效稳定、持久，不易产生抗药性的措施，必将推动农业的可持续发展。如今，对于生物防治的研究已经成为国内外的研究热点，利用生防细菌来防治植物病害是生物防治的一种主要手段。经检索，发明人在现有的专利和非专利文献中没有检索到解淀粉芽孢杆菌用于蓝莓毛色二胞枝枯病生物防治的相关报道和专利。
发明内容
[0005] 本发明目的在于提供防治蓝莓毛色二胞枝枯病的解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效，杀菌谱广的优点。
[0006] 实现本发明的技术方案如下所述。
[0007] 一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensHMQAU140045，2015年12月1日保藏于中国科学院微生物所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.11768。
[0008] 利用上述解淀粉芽孢杆菌HMQAU140045生产的三种微生物菌剂(A、B、C)，A活性成分为HMQAU140045菌体，B活性成分为发酵滤液，C活性成分为菌体和发酵滤液。
[0009] 本发明的一个方面，包含解淀粉芽孢杆菌的菌剂，所述菌剂可以是本领域技术人员所知任何技术手段制备的任何菌剂。例如通过发酵培养后液体形式的浓缩剂，也可以是通过冻干获得的干菌剂。
[0010] 上述微生物菌剂中的A和C活菌体数应大于3.2x1010cfu/mL。
[0011] 上述微生物菌剂的制备步骤如下：
[0012] (1)菌种活化，将低温保藏的菌株HMQAU140045于LB固体培养基平板上28℃培养48h，再转接到LB固体斜面培养基上28℃培养24h，得到活化的菌种；
[0014] (3)发酵培养按体积比1.5％将步骤(2)得到的种子液接种于最佳发酵培养基于28℃，180r/min摇培84h后,进行菌剂制备。A菌剂制备，摇培得到的发酵液离心后，菌体用无菌水洗涤两次，离心，刮取沉淀的菌体置于无菌水中，配制成菌剂A；B菌剂制备，发酵液于4℃，12000rpm离心20分钟获得上清液，通过0.22μm的滤器，收集过滤液体即为菌剂B；C菌剂制备，发酵液离心后，刮取沉淀的菌体置于无菌滤液(没有进行稀释)中，配制成菌剂C。
[0015] 上述解淀粉芽孢杆菌在蓝莓毛色二胞枝枯病上的应用。
[0016] 本发明微生物菌剂的使用方法，将上述所得微生物菌剂中A为用水稀释菌体浓度至1×108cfu/mL，B为发酵滤液，C为用发酵滤液稀释菌体浓度至1×108cfu/mL，于蓝莓枝枯病病发病前施用即可。
[0017] HMQAU140045菌株的筛选分离：HMQAU140045菌株是发明人从山东省青市黄岛区的蓝莓根际土壤中分离得到。2014年4月发明人从山东省青岛市黄岛区的蓝莓园，五点采样法采集根际土，混匀后称取10g土加入250三角瓶中，加入90mL无菌水，在摇床上振荡20min，静置约30秒，上清液即为10-1稀释液，再逐级稀释成10-2，10-3，10-4，10-5等稀释倍数，取后三个浓度的稀释液1mL与熔化后冷却的LB培养基9mL混合成平板，每个浓度重复三次，在28℃培养1-3d,进行细菌的分离和纯化，并以蓝莓毛色二胞枝枯病菌为靶标，通过平板对峙法，孢子萌发法及离体枝条试验进行拮抗菌株的筛选，最终获得一株对蓝莓毛色二胞枝枯病具有明显防治效果的菌株，命名为HMQAU140045。
[0018] HMQAU 140045菌剂的分类鉴定：
[0019] (1)形态特征鉴定
[0020] 在LB固体培养基上30℃培养2d，菌落直径0.5～2.5mm，菌落凸起呈乳白色、不透明、圆形、边缘不规则、表面有褶皱，在菌落边缘有晶体状物质。菌体革兰氏染色阳性，杆状,(0.93±0.24)μm～(2.01±0.52)μm，单个或成对排列，产芽孢。生理生化测定结果显示该菌株为兼性厌氧菌，能水解淀粉、还原硝酸盐，能够利用柠檬酸盐、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇，接触酶、氧化酶及V-P反应为阳性，反硝化和甲基红反应为阴性。该菌株在2％～7％NaCl和pH5的酸性条件下具有耐受性，在10％NaCl和pH9的碱性条件下不具有耐受性；4℃不能生长，51℃能够生长。通过形态学及生理生化鉴定初步鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；
[0021] (2)分子鉴定
[0022] 以HMQAU140045基因组DNA为模板，利用引物27f/1492r对16srDNA片段进行扩增。所述引物序列为27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(5’-TACGGTTACCT TGTTACGACTT-3’)。扩增反应体系：10×Buffer 2.5μL，5mM dNTP 2μL，10μM引物27f和引物
1492r各1μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 2.5μL，补水至25μL。反应条件：94℃预变性
5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程(上海)有限公司进行纯化和双向测序，测序结果经Sequencher5.0软件自动装配后导出重叠群(Contig)并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)数据库中进行BLAST分析后提交给GenBank。再从GenBank中选取合适的序列，经CLUSTALW2.0软件进行序列对比，并用MEGA 5.05软件采用邻接法(neighbor–joining analysis，NJ)构建系统发育树，其中Bootstrap检验的重复次数为1,000次。结果表明，该菌株与来自云南土壤的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens(GenBank登录号为JN99860)的同源性达到99％。系统发育分析结果表明，该菌株与4株Bacillus amyloliquefaciens菌株的序列位于系统发育树的同一分支。同源性比对数据和系统发育树位置进一步证明了菌株HMQAU140045为Bacillus amyloliquefaciens。
1492r各1μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 2.5μL，补水至25μL。反应条件：94℃预变性
5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程(上海)有限公司进行纯化和双向测序，测序结果经Sequencher5.0软件自动装配后导出重叠群(Contig)并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)数据库中进行BLAST分析后提交给GenBank。再从GenBank中选取合适的序列，经CLUSTALW2.0软件进行序列对比，并用MEGA 5.05软件采用邻接法(neighbor–joining analysis，NJ)构建系统发育树，其中Bootstrap检验的重复次数为1,000次。结果表明，该菌株与来自云南土壤的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens(GenBank登录号为JN99860)的同源性达到99％。系统发育分析结果表明，该菌株与4株Bacillus amyloliquefaciens菌株的序列位于系统发育树的同一分支。同源性比对数据和系统发育树位置进一步证明了菌株HMQAU140045为Bacillus amyloliquefaciens。
[0023] 综合以上形态特征和16SrDNA序列同源性比对分析结果可知HMQAU140045属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并且和现有的解淀粉芽孢杆菌菌株不同，是一个新菌株。
[0024] 上述解淀粉芽孢杆菌株HMQAU140045的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为模板，以27f和1492r为引物的扩增，如果所得PCR产物为SEQIDNo:1所示的核苷酸序列，即为HMQAU140045菌株。
[0026] 本发明的优点和有益效果：(1)本发明为蓝莓毛色二胞枝枯病提供了一个高效的微生物，开辟了一个新的途径；(2)本发明解淀粉芽孢杆菌菌株HMQAU140045对蓝莓毛色二胞枝枯病具有显著防效，且对其它病原菌引起的蓝莓枝枯病也具有较好的防效实施。(3)本发明微生物菌剂对人、畜安全；不易产生抗药性，降低抗药性风险；为环境友好型，可减少化学杀菌剂的施用，减少对环境的破坏和对人类健康的影响，以实现蓝莓生产的安全高效的可持续发展。(4)本发明的生产成本低廉，制备方法和使用方法简单。附图说明
[0027] 本发明有如下附图：
[0028] 图1为解淀粉芽孢杆菌菌株HMQAU140045对蓝莓毛色二胞枝枯病菌的拮抗效果；
[0029] 图2为解淀粉芽孢杆菌菌株HMQAU140045发酵滤液对假可可毛色二胞分生孢子萌发的影响；
[0030] 图3为解淀粉芽孢杆菌菌株HMQAU140045菌落形态及革兰氏染色；
[0031] 图4为基于16SrDNA基因序列构建的拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌菌株HMQAU140045和相关细菌的NJ(neighbor-joining analysis)系统发育树；
[0032] 图5为解淀粉芽孢杆菌菌株HMQAU140045的蛋白酶和纤维素酶检测结果。
具体实施方式
[0033] 下面实施案例用于进一步解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施案例中的试验方法，如无特殊说明，一般为常规方法；下述实施案例中的百分含量，如无特殊说明，均为重量百分含量。
[0034] 实施例1
[0035] 拮抗菌株的分离与筛选。
[0036] (1)分离：2014年4月于山东省青岛市黄岛区的蓝莓园中采集蓝莓植株的根际土。采用稀释平板法分离细菌菌株，培养基为LB固体培养基，待长出菌落后，挑取细菌单菌落于LB固体平板划线纯化并保存于青岛农业大学真菌学研究室。
[0037] (2)初筛：以假可可毛色二胞为靶标，采用对峙平板法，PDA平板中央划线接种细菌，距细菌2.5cm的两端接种病原菌菌饼，25℃恒温培养，对照只接种病原菌菌饼。每个处理设3个重复，待对照长满3/4培养皿时，测量抑菌带宽度，筛选出对假可可毛色二胞有明显拮抗作用的细菌菌株。
[0038] (3)复筛：初筛后的细菌菌株制备种子液，取1mL种子液接种于50mL LB培养基中，130r/min、30℃恒温振荡培养48h。将发酵液离心，0.22μm微孔滤膜过滤制备拮抗菌的无菌滤液。采用菌丝生长速率法，将发酵液无菌滤液与融化后冷却的PDA培养基(45～50℃)混匀，倒平板，以加入等体积LB液体培养基的PDA培养基作为对照，于平板中央接种直径为5mm的假可可毛色二胞病菌菌饼。每个处理设3个重复，待对照长满3/4培养皿时，十字交叉法测量对照组及处理组菌落直径，计算抑菌率，筛选出对假可可毛色二胞拮抗效果最优的细菌菌株。
[0039] 抑制率(％)＝(对照菌落半(mm)―处理菌落半径(mm))/对照菌落半径(mm)×100％
[0040] 试验同时采用以上两种方法测定筛选得到的抑菌效果最好的拮抗菌株对其他三株蓝莓枝枯病菌棒状拟盘多毛Pestalotiopsis clavispora、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、乌饭树拟茎点霉Phomopsis vaccinii的抑制作用。
[0041] (4)结果与分析：利用稀释平板法从健康蓝莓植株的根际土中分离得到20株细菌，对峙平板法筛选出7株对假可可毛色二胞有明显抑制效果的拮抗菌株，占所分离菌株的35％，其中菌株HMQAU140045拮抗效果最好，抑菌带宽度达到14.50mm(图1-A)。选取该菌株的LB发酵滤液于PDA培养基中稀释10倍进行菌丝生长速率法试验，结果表明该菌株的发酵滤液对假可可毛色二胞菌丝生长的抑制率可达到100％(图1-B)。此外，菌株HMQAU140045对葡萄座腔菌、乌饭树拟茎点霉及棒状拟盘多毛孢的抑菌带宽度分别为12.63mm，18.3mm,
8.75mm。该菌株稀释10倍的LB发酵滤液对葡萄座腔菌、乌饭树拟茎点霉及棒状拟盘多毛孢的抑制率分别为100％，89.67％，76.74％。说明菌株HMQAU140045对多种蓝莓枝枯病病原菌具有较好的抑菌效果。
8.75mm。该菌株稀释10倍的LB发酵滤液对葡萄座腔菌、乌饭树拟茎点霉及棒状拟盘多毛孢的抑制率分别为100％，89.67％，76.74％。说明菌株HMQAU140045对多种蓝莓枝枯病病原菌具有较好的抑菌效果。
[0042] 实施例2
[0043] 拮抗菌株HMQAU140045发酵培养基及条件的优化。
[0044] (1)发酵培养基的优化
[0045] 采用单因素及正交试验的优化方法，先通过单因素试验(碳源、氮源、无机盐)确定最佳的培养基组分，再选择各组分的合适取值水平，进行正交试验。试验以假可可毛色二胞为供试病原菌。接入种子液后30℃，130r/min摇培48h。，用分光光度计测定不同因素对HMQAU140045菌体产生量的影响。采用菌丝生长速率法测定发酵滤液对假可可毛色二胞的抑菌率(碳、氮源发酵滤液稀释50倍，其它稀释100倍)。
[0046] 单因素优化。
[0047] 碳源优化：以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、D-木糖、乳糖、可溶性淀粉、马铃薯淀粉、玉米粉为供试碳源，在基础培养基(LB培养基)中加入2％的碳源，每个碳源设三个重复，以不加碳源的基础培养基为对照。
[0048] 氮源优化：以硫酸铵、尿素、豆饼、花生饼、黄豆粉、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉。以基础培养基(LB培养基)中加入最优碳源作为对照(CK)，分别以2.0％氮源等量替代对照培养基中的胰蛋白胨及酵母提取物，每个处理3次重复。
[0049] 无机盐优化：以CuSO4、MnSO4、MgSO4、CaCO3、K2HPO4为供试无机盐，以最适碳氮源加NaCl为对照，分别以0.5％无机盐等量替换对照培养基中的NaCl。
[0050] 正交优化：以单因素试验筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐为变异因素，选用4因素3水平L9(34)正交表进行培养基优化试验，确定培养基各组分的最佳配比(表1)。
[0051] (2)发酵条件的优化
[0052] 发酵条件的优化分为单因素试验(转速、温度、初始pH、培养时间、接种量和装液量)及正交试验，在单因素试验的基础上，选择合适的水平进行正交试验，确定最佳发酵条件组合。试验以假可可毛色二胞为供试病原菌。
[0053] 表1发酵培养基组分因素水平表。
[0054]
[0055] 单因素试验：在优化得到最佳发酵培养基的条件下，确定pH(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)、培养温度(24、28、32、36和40℃)、转速(100、120、140、160、180和200rpm)、装液量(20、
30、40、50和60mL)、初始接种量(1、2、4、6和8％)对抑菌活性的影响，每个处理三次重复。测定方法同发酵培养基优化(发酵滤液稀释100倍)。
30、40、50和60mL)、初始接种量(1、2、4、6和8％)对抑菌活性的影响，每个处理三次重复。测定方法同发酵培养基优化(发酵滤液稀释100倍)。
[0056] 正交试验：采用优化培养基,在最适转速的条件下，以培养温度、初始pH、培养时间、接种量和装液量为考察因素,按正交设计表L25(55)设计5个因素、5个水平的正交试验(表2),比较各种发酵条件组合对生防菌株发酵液的无菌滤液抗菌活性的影响，确定最适发酵条件。测定方法同发酵培养基优化(发酵滤液稀释100倍)。
[0057] 表2发酵条件因素水平表。
[0058]
[0059] (1)发酵培养基的优化结果。
[0060] 单因素优化。
[0061] 碳源的单因素筛选结果表明，当玉米粉作为碳源时，发酵后菌量最大，其后菌量大小依次为麦芽糖>马铃薯淀粉>乳糖>可溶性淀粉>D-木糖>葡萄糖>蔗糖>果糖>不加碳源；抑菌率的大小依次为麦芽糖>玉米粉>马铃薯淀粉>可溶性淀粉>乳糖>D-木糖>蔗糖>葡萄糖>果糖>不加碳源。同时发现以玉米粉作为碳源时，抑菌率虽然不及麦芽糖，但无显著性差异，而且玉米粉作为碳源时菌量最高，且材料易得，成本低廉，因此选择玉米粉作为碳源。
[0062] 氮源的单因素筛选结果表明，在不同氮源条件下菌量大小依次为酵母提取物>CK(酵母提取物与胰蛋白胨的组合)>牛肉膏>蛋白胨>黄豆粉>胰蛋白胨>豆饼>麦麸>花生饼>尿素>硫酸铵；抑菌率的大小依次为CK(酵母提取物与胰蛋白胨的组合)>酵母提取物>胰蛋白胨>蛋白胨>牛肉膏>尿素>花生饼>豆饼>麦麸>黄豆粉>硫酸铵。试验发现无论是菌体量还是抑菌率，营养较高、氮量高的有机氮源要明显好于无机氮源。对照与酵母提取物在菌体产量上无显著性差异，但对照的抑菌率要优于其他氮源，因此选择酵母提取物与胰蛋白胨的组合作为氮源。
[0063] 无机盐的单因素筛选结果表明，在不同无机盐条件下菌量大小依次为MnSO4>K2HPO4>CaCO3>MgSO4>NaCl>CuSO4；抑菌率的大小依次为K2HPO4>CaCO3>MgSO4>NaCl>MnSO4>CuSO4。在菌体产量上MnSO4与K2HPO4无显著差异，高于其他无机盐，由于试验以抑菌活性作为主要的评价因素，所以选择K2HPO4作为无机盐。
[0064] 正交试验：为进一步研究营养源因子之间的相关性，在单因素试验确定了玉米粉2.0％、酵母提取物1.0％、胰蛋白胨1.0％、K2HPO40.5％的基础上，进行培养基优化L9(33)正交实验，结果如表3。由表3可以看出，发酵培养基的不同因素组合对菌株140045发酵影响显著，当培养基因素组合为A3B1C3D2，发酵液抑菌活性最高，说明该组合有利于菌株140045的发酵。但A因素均值2时为最大值,此时A因素水平为2.0％；B因素均值2时达到最大值，此时B因素水平为1.0％；C因素均值2时达到最大值，此时C因素水平为1.0％；D因素均值2时达到最大值，此时D因素水平为0.5％。最适合菌株140045发酵产生抑菌活性物质的培养基因素组合为A2B2C2D2。根据各组分极差看出R的大小分别为A>C>D>B，玉米粉是菌株140045发酵的最大影响因素，因此，在发酵产酶过程中要控制好玉米粉的用量。
[0065] 表3发酵培养基组分正交筛选。
[0066]
[0067] (2)发酵条件的优化结果。
[0068] 单因素试验。
[0069] 温度发酵条件结果表明，当温度为24℃～32℃时，菌体量随着温度升高而提高；当温度为32℃时，菌体量达到最大值；当温度高于32℃时，菌体量呈下降趋势。对于抑菌率，发现温度在24℃～32℃之间时抑菌率较高，28℃达到最大值，当温度高于32℃时抑菌率显著下降。
[0070] 转速发酵条件结果表明，当转速为100rpm～180rpm时，菌体量与抑菌率随转速升高而升高；当转速为180rpmin时，菌体量与抑菌活性达到最大值；当转速高于200rpmin时，菌体量与抑菌率呈下降趋势。因此，发酵最适转速为180rpmin。
[0071] 接种量发酵条件结果表明，接种量为1％～2％时，菌体量与抑菌率随接种量增加而提高；接种量为2％时，菌体量与抑菌率达到最大值；接种量高于2％时，菌体量与抑菌率开始随接种量升高而下降。因此，发酵最适接种量为2％。
[0072] 在150mL控制装瓶量分别为20mL、35mL、50mL、65mL、80mL，发酵结果表明,当装瓶量为20mL～80mL时，菌体量随着装瓶量升高而降低，成线性下降；当装瓶量为20mL时，菌体量达到最大值。对于抑菌率，发现装瓶量为20mL～65mL时抑菌率较高，50mL达到最大值，当装瓶量高于65mL时抑菌率显著下降。
[0073] 控制pH分别为5、6、7、8、9，发酵结果表明，pH为5～7时，菌体量与抑菌率随接种量增加而提高；pH为7时，菌体量与抑菌率达到最大值；pH高于7时，菌体量与抑菌率开始随pH升高而下降。因此，确定发酵最适pH为7。
[0074] 控制发酵时间分别为24h、48h、72h、96h、120h，发酵结果表明，发酵时间为24h～72h时，菌体量与抑菌率随发酵时间增加而提高；发酵时间为72h时，菌体量与抑菌率达到最大值；发酵时间长于72h时，菌体量与抑菌率开始随发酵时间的延长而下降。因此，确定发酵最适时间为72。
[0075] 发酵条件正交试验，为进一步研究发酵条件之间的相关性，试验选取温度、接种量、装液量、pH、发酵时间五个因素进行培养基优化L25(55)正交实验，结果如表4。由表4可以看出，发酵条件不同的因素组合对菌株140045发酵影响显著，当发酵条件因素组合为A2B2C3D4E5，发酵液抑菌活性最高，说明该组合有利于菌株140045的发酵。
[0076] 表4发酵条件组分正交表。
[0077]
[0078] 实施例3
[0079] HMQAU140045微生物菌剂的制备。
[0080] (1)菌种活化：将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株HMQAU140045(保藏编号：CGMCC No.11768)，于LB固体培养基(胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠5g,琼脂粉15g,水1000mL，pH7.0)平板上28℃培养48h，再转接到LB固体斜面培养基上28℃培养24h，得到活化的菌种。
[0081] (2)种子液的制备按常规方法制备LB液体培养基(胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠5g,水1000mL)，在150mL三角瓶中装入50mL培养基，121℃湿热灭菌后，每瓶接入一菌环步骤(1)活化的菌种，130rpm，30℃振荡24h，收集菌体，并调到108cfu/mL1，制备种子液。
[0082] (3)发酵培养发酵培养基(玉米粉20.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母提取物10.0g，磷酸氢二钾0.5g，用蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0)，分装于500mL三角瓶，每瓶装200mL,，121℃湿热灭菌后，冷却后至室温备用，再将步骤(2)制备的种子液接种按接种量1.5％接种于发酵培养基中28℃、180r/min摇培84h后,进行菌剂制备。A菌剂制备，最佳发酵培养基和发酵条件摇培得到的发酵液离心后，菌体用无菌水洗涤两次，离心，刮取沉淀的菌体置于无菌水中，配制成菌剂A。B菌剂制备，为菌株在最优发酵培养基和发酵条件得到的发酵液，在4℃、12000rpm离心20分钟获得上清液，通过0.22μm的滤器，收集过滤液体即为菌剂B。C：菌体+无菌发酵液制备，最佳发酵培养基摇培得到的发酵液离心后，刮取沉淀的菌体置于无菌滤液(没有进行稀释)中，配制成菌剂C。
[0083] 实施例4
[0084] HMQAU140045发酵滤液对蓝莓枝枯病菌的抑制作用。
[0085] (1)发酵滤液对蓝莓枝枯病菌孢子萌发抑制作用试验
[0086] 对拮抗菌株HMQAU 140045的发酵培养基及发酵条件进行了优化，并在最优条件下发酵得到菌株140045的无菌滤液进行以下实验。采用凹玻片法观察菌株HMQAU 140045对假可可毛色二胞分生孢子萌发的影响，挑取蓝莓枝干溢出的假可可毛色二胞分生孢子角，用无菌水制备孢子悬浮液，浓度为106个/mL。将140045发酵滤液按50、100、150和200倍的稀释比例分别与孢子悬浮液混匀，各取40μL滴在凹载玻片的凹槽中，以无菌水配置的孢子悬浮液为对照。将玻片置于培养皿中25℃恒温保湿培养，4h后在显微镜下观察孢子萌发情况，计算抑菌率，并进行显微拍照。每个处理设3个重复，该试验重复3遍。
[0087] (2)发酵滤液对蓝莓枝枯病菌菌丝生长的抑制作用试验
[0088] 采用菌丝生长速率法将其与固体PDA培养基混合稀释50、100、150、200倍测定对假可可毛色二胞的抑制作用，计算抑菌率，以加入等体积无菌培养液的PDA培养基作为对照，每个处理设5个重复。实验并挑取处理组及对照组病原菌菌丝，在光学显微镜下观察菌株140045发酵滤液对菌丝形态的影响，进行显微拍照。
[0089] (3)发酵滤液对蓝莓枝枯病菌孢子萌发的抑制作用结果
[0090] 稀释不同倍数的发酵滤液对假可可毛色二胞都具有不同程度的抑制作用，发酵滤液稀释50倍完全抑制病原菌孢子萌发，抑制率达到100％，稀释100倍仍能达到85％以上，随着发酵滤液稀释倍数增加抑制率逐渐下降。显微观察发现，对照组的孢子萌发较好，芽管较长，粗细均匀(图2-A)；处理组的孢子不能萌发或萌发畸形，芽管顶端或中间膨大，部分孢子内容物外泄(图2-B C D)。
[0091] (4)发酵滤液对蓝莓枝枯病菌菌丝生长的抑制作用结果
[0092] 菌株HMQAU140045发酵滤液对假可可毛色二胞菌丝生长具有明显的抑制作用，发酵滤液稀释50倍完全抑制病原菌菌丝生长，稀释100倍抑制率仍接近90％，随着发酵滤液稀释倍数增加抑制率逐渐下降，但稀释150倍和200倍对菌丝生长的抑制率仍能达到71.25％和57.49％(表5)。显微观察发现，对照的菌丝粗细一致、分支较少、原生质分布均匀；处理组内除了稀释50倍外的其它三组处理，虽然菌丝生长，但菌丝体膨大变粗、畸形、分支增多，菌丝聚集成瘤状，有些菌丝内原生质流出形成空壳。
[0093] 表5菌株HMQAU140045发酵滤液对蓝莓毛色二胞枝枯病菌孢子萌发及菌丝生长的抑制
[0094]
[0095] 注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)。
[0096] 实施例5
[0097] 拮抗菌株HMQAU140045发酵液抑菌谱的测定。
[0098] 材料与方法：采用菌丝生长速率法将发酵滤液与固体PDA培养基混合稀释100倍测定对蓝莓枝枯病菌、苹果树腐烂病菌、苹果斑点落叶病菌、苹果炭疽病菌、苹果霉心病菌、黄瓜靶斑病菌等15种供试病原真菌的抑制作用，计算抑菌率，以加入等体积无菌培养液的PDA培养基作为对照，每个处理设5个重复。
[0099] 结果与分析：菌株HMQAU140045发酵滤液抑菌谱测定结果表明，发酵滤液稀释100倍后对15种供试植物病原真菌具有不同的抑菌活性。其中对苹果腐烂病的抑制效果最好，抑制率达到100％；其次是蓝莓葡萄座腔菌枝枯病菌、蓝莓毛色二胞枝枯病菌、小麦根腐叶斑病菌、蓝莓拟茎点枝枯病菌及小麦赤霉病菌，抑制率均为76％以上；对其他7种病原菌的抑制率也在53.36％～70.73％之间；对番茄枯萎病菌(粉红单端孢)和苹果霉心病菌的抑制率相对较差，分别为40.22％和35.45％以上。这说明菌株140045抗菌谱较广，抗菌效果较好，具有较高的生防潜力。
[0100] 表6菌株140045发酵液对15种病原菌菌丝生长的抑制率
[0101]
[0102]
[0103] 注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)。
[0104] 实施例6
[0105] 菌株HMQAU140045的鉴定。
[0106] (1)形态及生理生化特征鉴定
[0107] 鉴定方法参照东秀珠和蔡妙英的《常见细菌系统鉴定手册》进行。
[0108] (2)16S rDNA分子生物学鉴定
[0109] 基因组DNA的提取参考夏涵等的chelex100法。16srDNA的PCR扩增及序列分析：提取菌株基因组DNA后，利用细菌通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程(上海)有限公司进行纯化和双向测序，测序结果经Seqencher5.0软件自动装配后导出重叠群(Contig)并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)数据库中进行BLAST分析后提交给GenBank。再从GenBank中选取合适的序列，经CLUSTALW 2.0软件进行序列对比，并用MEGA 5.05软件采用邻接法(neighbor-joininganalysis，NJ)构建系统发育树，其中Bootstrap检验的重复次数为1,000次。
[0110] (3)形态及生理生化特征：菌株HMQAU140045在LB固体培养基上30℃培养2d，菌落直径0.5～2.5mm，菌落凸起呈乳白色、不透明、圆形、边缘不规则、表面有褶皱，在菌落边缘有晶体状物质(图3-AB)。菌体单个或成对排列,革兰氏染色阳性，杆状(0.93±0.24)μm～(2.01±0.52)μm，(图3-C)，产芽孢。生理生化鉴定结果见表7。通过形态学及生理生化鉴定初步鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
[0111] 表7菌株HMQAU140045生理生化鉴定表。
[0112]
[0113] (4)分子鉴定结果：利用细菌通用引物27f/1492r对菌株140045的16srDNA片段进行PCR扩增，经测序分析，确定该片段全长1406bp。将扩增得到的序列与GenBank中BLAST数据库中的核酸序列进行同源性比较，结果表明，菌株HMQAU140045与来自云南土壤的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens(GenBank登录号为JN99860)的同源性达到99％。系统发育分析结果表明，菌株HMQAU140045与4株Bacillus amyloliquefaciens菌株的序列位于系统发育树的同一分支(图4)。同源性比对数据和系统发育树位置进一步证明了菌株140045为Bacillus amyloliquefaciens。
[0114] 实施例7
[0115] 菌株HMQAU140045对离体蓝莓枝枯病的抑制作用。
[0116] 材料与方法：从青岛胶南蓝莓种植基地采集当年生的健康蓝莓枝条(品种：杜克)，剪成粗细一致的枝段，自来水冲洗后，用75％乙醇表面消毒，最后用无菌水冲洗。试验分四种喷施药剂(A菌剂稀释为1×108cfu/mL、B菌剂、C菌剂稀释为1×108cfu/mL、D：甲基硫菌灵1500倍稀释液)，三种处理(1：施药24h后接种病原菌菌饼、2：施药后待药稍干燥立即接种病原菌菌饼、3：接种病原菌菌饼24h后施药)，共12种组合。
[0117] 采用针刺法接种病原菌假可可毛色二胞菌饼，每个枝条接种1个点，每个处理重复5个枝条，以接种无菌水和液体发酵培养基的枝条作为对照，试验重复3次。接种病原菌菌饼后，在菌饼上用保鲜膜缠绕固定并保湿，培养条件为25℃，12h光暗交替。培养24h后去掉保鲜膜并开始观察记录发病情况。7天后测量病斑大小，按照椭圆面积公式计算病斑面积和防治效果；防治效果(％)＝[(对照病斑面积－处理病斑面积)/对照病斑面积]×100％。
[0118] 结果与分析：菌株HMQAU140045的菌悬液和发酵滤液对蓝莓毛色二胞枝枯病均有明显的防治效果，且优于对照(表8)。结果显示，施药24h后接种病原菌的4个处理中，A(菌体)与C(发酵液)的防效与D(甲基硫菌灵)的防效之间无显著差异，抑制率均在96％以上；B(发酵滤液)的防效要差于前三种处理，但仍能达到93％以上。施药后同时接种病原菌，发现B(发酵滤液)与C(发酵液)的防效与D(甲基硫菌灵)的防效之间无显著性差异，A(菌体)防效明显低于其他三种处理为82.56％。接种病原菌24h后施药，发现C(发酵液)的防效与D(甲基硫菌灵)的防效之间无显著性差异，D效果最佳，其次是B(发酵滤液)，A(菌体)效果最差，抑菌率只有67.06％。因此，施用发酵液(菌体与发酵液的组合)效果要优于单独施用发酵滤液与菌体，先施药后接种病原菌效果优于先接种病原菌后施药。
[0119] 表8菌株HMQAU140045三种菌剂对离体蓝莓毛色二胞枝枯病的防治效果
[0120]
[0121] 注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)。
[0122] 实施例8
[0123] 解淀粉芽孢杆菌对蓝莓毛色二胞枝枯病的防治效果。
[0124] 材料与方法：在青岛胶南的蓝莓基地，选取当年生的健康且生长一致蓝莓枝条，75％酒精消毒后，用昆虫针刺伤，伤口直径约1-2mm,将假可可毛色二胞于PDA培养基上活化
24小时后，从菌落边缘用直径5mm打孔器打取菌饼，分别接种菌株HMQAU140045的菌体(浓度
108cfu/mL)、发酵液(浓度108cfu/mL)及发酵滤液微晾干后将菌饼接种于其上，保湿24小时，以接种无菌水和甲基硫菌灵的枝条为对照。7天后测量病斑大小并计算防治效果。
24小时后，从菌落边缘用直径5mm打孔器打取菌饼，分别接种菌株HMQAU140045的菌体(浓度
108cfu/mL)、发酵液(浓度108cfu/mL)及发酵滤液微晾干后将菌饼接种于其上，保湿24小时，以接种无菌水和甲基硫菌灵的枝条为对照。7天后测量病斑大小并计算防治效果。
[0125] 结果与分析：试验结果显示，菌株HMQAU140045的发酵滤液和发酵液两种菌剂对蓝莓毛色二胞枝枯病的防治效果较好，且与甲基硫菌灵的效果无显著差异(表9)。
[0126] 表9菌株HMQAU140045三种菌剂对蓝莓毛色二胞枝枯病的防治效果
[0127]
[0128] 注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)。
[0129] 实施例9
[0130] 菌株HMQAU140045诱导酶的检测。
[0131] 材料与方法：
[0132] 供试培养基：
[0133] 几丁质酶检测培养基：NH4H2PO41.0g，KCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，胶体几丁质1％(w/v)蒸馏水定容至1000mL，琼脂20.0g，pH 7.0；
[0134] 蛋白酶检测培养基：酪蛋白10.0g，牛肉浸粉3.0g，NaCl 5.0g，K2HPO4 2.0g，琼脂15.0g，溴百里酚蓝0.05g，pH 7.4±0.1；
[0136] β-1,3-葡聚糖酶检测培养基：葡萄糖1.0g，茯苓粉4.0g，K2HPO4 1.0g，Na2HPO4 3.0g，苯胺蓝0.06g，FeSO4·7H2O 0.5g，琼脂粉12g，蒸馏水定容至1000ml，pH 7.0；
[0138] 检测140045菌体及发酵滤液是否具有酶活，菌体检测：用接种环挑取菌株140045菌体，点接在五种待测培养基平板上；发酵滤液检测：于检测平板周围打取三个直径6mm的圆孔，在圆孔中加入20μL的HMQAU140045在最佳发酵培养基和发酵条件获得的发酵滤液。28℃培养3d，观察几丁质酶、蛋白酶、β-1,3-葡聚糖酶检测培养基平板有无透明圈，观察嗜铁素检测培养基平板有无橘黄色晕圈产生，若产生透明圈或橘黄色晕圈则产生相应的酶。纤维素酶检测观察方法为向培养3d的培养皿中加入适量1mg/mL的刚果红溶液，染色1h，弃去染液，加入适量1M NaCl溶液，洗涤1h，若产生纤维素酶，则在菌落或发酵滤液的周围出现清晰的透明圈。
[0139] 结果与分析：诱导酶检测结果发现，在蛋白酶及纤维素酶检测培养基平板上，菌株HMQAU140045及其发酵滤液周围能够产生透明圈(图5)，表明该菌株能够产生蛋白酶及纤维素酶，发酵滤液里含有蛋白酶及纤维素酶，但在几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、嗜铁素检测培养基平板上未发现相应的透明圈或橘黄色晕圈，表明该菌株不能产生几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶及嗜铁素。
[0140] 实施例10
[0141] 菌株HMQAU140045发酵滤液的热稳定性检测。
[0142] 将菌株HMQAU140045发酵滤液于40℃、60℃、80℃、100℃、121℃分别处理60min，每个处理重复3次。待自然冷却后，以不做任何处理的发酵滤液为对照。每个处理重复三次。以假可可毛色二胞为供试菌，采用菌丝生长速率法测定发酵滤液在不同条件下处理后的抑菌活性(处理后的发酵滤液于PDA培养基中稀释100倍)，分别测定各处理对病原菌的抑菌活性。
[0143] 结果与分析：由表10可知，当温度在40℃～80℃范围内，拮抗菌发酵滤液抑菌率随温度升高略有下降，但抑菌率仍较高，与对照较接近。高至100℃时，拮抗菌发酵滤液抑菌活性下降明显，抑菌率相对于对照减小了27.40％；在121℃时，该菌发酵滤液抑菌活性几乎全部丧失，这表明发酵滤液中生物活性物质具有较强的热稳定性，但高温会对其活性造成严重影响，也说明其活性物质如蛋白酶和纤维素酶对病原菌的抑制过程中发挥了重要作用。
[0144] 表10菌株HMQAU140045发酵滤液的热稳定性
[0145]
[0146] 注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)[0147] 上述实施方案为本发明最佳的实施方案，但本发明的实施方案并不受上述实施方案的限制，其他的任何不违背本发明原理的条件下，可以通过改变参数的形式所产生的实施例，都包含于本发明的保护范围之内。
[0149]
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