一种乳酸菌颗粒胶囊的制备方法
阅读：1发布：2021-05-13
专利汇可以提供一种乳酸菌颗粒胶囊的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，包括菌株的制备：将乳酸菌接种于含有甘露醇的MRS液体培养基中菌株驯化， 收获 的最佳时间为菌种生长稳定期的中前期，将结束培养的乳酸菌液离心收集菌泥，后用PBS缓冲液对菌泥洗涤，再次离心收集获得乳酸菌的湿菌泥，加入无菌 水 搅拌后加入抗 氧 化剂，获得乳酸菌制粒的菌芯；菌芯的制粒：所得菌芯使用第一层包衣剂包衣得到轻压即散的湿菌粉；对湿菌粉进行第一次制粒后用第二层包衣剂进行第二层包衣，第二次制粒后菌粒干燥得到乳酸菌颗粒；胶囊 包装 。本发明采用甘露醇驯化提高菌体的耐受性，降低在后处理的菌活性损失；在生长稳定期的中前期收获的乳酸菌在制备成菌剂后可最大程度的保存菌株活性。，下面是一种乳酸菌颗粒胶囊的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，其特征在于，步骤包括：
一、菌株的制备：将乳酸菌接种于含有甘露醇的MRS液体培养基中进行菌株培养以提高其耐脱水性，菌株收获的最佳时间为菌种生长稳定期的中前期，将结束培养的乳酸菌液投入离心机中离心分离，收集沉淀在底部的菌泥，然后，将PBS缓冲液投入到菌泥中进行菌体洗涤，再次使用离心机离心分离并收集沉淀在底部的菌泥以获得乳酸菌的湿菌泥，加入无菌水，搅拌均匀后加入抗氧化剂，继续搅拌至均匀以获得乳酸菌制粒的菌芯；
二、菌芯的制粒：对步骤一所得菌芯使用第一层包衣剂进行第一层包衣，得到轻压即散的湿菌粉，第一层包衣剂为无菌固态玉米淀粉和羟甲基纤维素钠；利用造粒机对湿菌粉进行第一次制粒，而后用第二层包衣剂对菌粒进行第二层包衣，第二层包衣剂为无菌固态玉米淀粉或无菌固态玉米淀粉与乳糖或L-赖氨酸盐中的任一种形成的固态混合物，再次使用造粒机对二次包衣的菌粒进行第二次制粒，将二次制粒后的菌粒进行干燥得到乳酸菌颗粒；
三、胶囊包装：将步骤二中得到的乳酸菌颗粒装入胶囊，包装即得。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，将–
20℃保存的乳酸菌接种到含有甘露醇的MRS液体培养基中，菌株培养3～5次后，得到驯化后的乳酸菌菌株，将其保存于–20℃备用；含有甘露醇的MRS液体培养基指将基础液体培养基的葡萄糖调整为葡萄糖、蔗糖、乳糖中的任一种糖分与甘露醇组成的混合物，其与甘露醇的质量比为1：1～1：3；基础液体培养基由下述成分组成：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉 5g/L、牛肉膏10 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、MgSO4﹒7H2O 0.58g/L、MnSO4﹒H2O 0.25 g/L、CH3COONa﹒3H2O 5 g/L、K2HPO4 2 g/L， CaCO3 10 g/L、Tween-80 10ml/L。
3.根据权利要求2所述的乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，将–
20℃保存的驯化后的乳酸菌接种到基础液体培养基中，振摇培养8h，速度为70rpm，得到一级摇瓶种子液；将一级摇瓶种子液按8%的接种量接种到基础液体培养基或新配MRS液体培养基的任一种培养基中，振摇培养8h，速度为70rpm，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，用于确定菌株达到生长稳定期的中前期的时间，培养结束后得到二级摇瓶种子液；将二级摇瓶种子液按8%的接种量接种到基础培养基或新配MRS液体培养基的任一种培养基中，振摇培养至菌株生长稳定期的中前期；新配MRS液体培养基由下述成分组成：蛋白胨5 g/L、玉米浆干粉5 g/L、酵母粉5 g/L、红糖120 g/L或含糖量为120 g/L的高粱汁、柠檬酸氢二铵
2 g/L、乙酸钠5 g/L、丙酮酸钠0.18 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.05 g/L、血红素0.5 g/L、维生素K2 2 g/L、碳酸钙10 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO4·H2O 0.25 g/L、Tween-80 1ml/L；其pH值为6.4，在121℃灭菌15分钟制得。
4.根据权利要求1所述的乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤一中所述PBS缓冲液是指：每300ml水溶液中含NaCl 2.4g、KCl 0.06g、Na2HPO4·12H2O 0.462g、KH2PO4
0.06g。
5.根据权利要求1所述的乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，其特征在于：所述抗氧化剂为维生素C、维生素E和谷氨酸钠中的2～3种，抗氧化剂的添加量为湿菌体质量的4%～8%。
6.根据权利要求1所述的乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤二中的第一层包衣是指：将无菌固态玉米淀粉按照其与步骤一中的湿菌泥的质量比6：1～8：1的比例加入到步骤一所制备的菌芯中，搅拌均匀，搅拌速度为50rpm～70rpm，而后加入羟甲基纤维素钠，其添加量为步骤一中湿菌泥的质量的0.5%～1.5%，继续搅拌至均匀，搅拌速度为
50rpm～70rpm，得到轻压即散的湿菌粉；第一次制粒是指：将湿菌粉投入造粒机内，调整粒度为65～100目，得乳酸菌的菌粒；第二次包衣是指：将无菌固态玉米淀粉或无菌固态玉米淀粉与乳糖、L-赖氨酸盐中的任一种物质形成的固态混合物按一定比例加入到第一次制粒制备的菌粒中，固态玉米淀粉加入量为步骤一中的湿菌泥质量的3～5倍，乳糖和L-赖氨酸盐添加量分别为步骤一中的湿菌泥质量的0.5%～1.5%，然后，用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为10rpm～30rpm；菌粒的第二次制粒：将第二次包衣后的菌粒投入造粒机，调整粒度为50～
80目，制备乳酸菌的菌粒。
7.根据权利要求1所述的乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，其特征在于：所述菌粒的干燥是指：将步骤二中第二次制粒得到的菌粒投入干燥器内进行干燥，控制温度40℃，时间24h，翻拌速度为0rpm～20rpm。
8.根据权利要求1所述的乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，其特征在于：所述乳酸菌为副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、屎肠球菌和乳酸肠球菌中的任一种。
一种乳酸菌颗粒胶囊的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，属于乳酸菌技术领域。
背景技术
[0002] 乳酸菌或其培养物等已被开发为健康食品、药品、食品添加剂、饲料添加剂、牧草青贮添加剂等材料，而且，最近研究表明活的乳酸菌到达肠道后，能提高产品使用者的肠道功能；提高该产品的活性和降低该产品的生产成本具有应用到特定产品等产业方面的优点。
[0003] 但是, 乳酸菌的高活性受到菌株、培养时间、保护剂、制备方法等的影响，乳酸菌菌剂的生产成本受到乳酸菌的耐受性、制备仪器、能耗等的影响，难以在保持乳酸菌高活性的同时维持制品的低成本。因此，一直以来常使用真空冷冻干燥的制备工艺以获得高活性的乳酸菌，但存在着成本高的问题。另外，真空冷冻干燥条件下制备的菌饼易结成块，这会造成菌饼包衣的不完整，这将导致乳酸菌活性降低和使用难度增大。
[0004] 如专利文献1: 中华人民共和国国家知识产权局于2011年9月21日公告的发明授权专利一种乳酸菌微胶囊及其制备方法和用途(专利号ZL 101496555 A)，授权公告号为CN101496555B，公开号101496555。作为乳酸菌菌剂冷冻制备中为保存乳酸菌高活性的制造方法，公开了在菌剂中加入保护剂脱脂奶粉、海藻糖、甘油、谷氨酸钠和麦芽糊精，使乳酸菌的存活率提高。然而，这些保护剂需要通过多个添加步骤，这增加了操作的难度和染菌的机会。
[0005] 专利文献2: 中华人民共和国国家知识产权局于2014年4月23日公告的发明授权专利一种复方包被乳酸菌产品及制备方法(专利号ZL 102987055 A)，授权公告号为CN102987055B。还公开了通过复方包被法制备乳酸菌菌剂的方法,公开了在发酵的乳酸菌液中通过添加阿拉伯胶、海藻酸钠、液体石蜡、氯化钙等以制成乳酸菌胶囊，乳酸菌胶囊的发酵液再进行经玉米淀粉、微晶纤维素的微囊化和经玉米淀粉、羟丙基甲基纤维素、果胶、卡拉胶的包被，使乳酸菌的耐受性提高。然而，复方包被法制备菌剂的过程中选用的包被剂为液态，这会造成菌剂干燥次数的增加及水消耗量的增加，这将增加乳酸菌活性降低的风险和水资源的浪费，而且，包被剂的价格较高，这将提高乳酸菌菌剂的生产成本，另一方面，复方包被法制备菌剂的制粒仪器多选用流化床，这会造成菌剂得率低和菌粒难溶的现象。
[0006] 专利文献3: 中华人民共和国国家知识产权局于2012年6月20日公告的发明授权专利一种乳酸菌阴道胶囊及其制备方法(专利号ZL 101690734 A)，授权公告号为CN101690734B。还公开了通过制备乳酸菌胶囊而制备乳酸菌菌剂的方法，公开了在发酵的乳酸菌液中通过添加碳酸钙和药用淀粉的赋形剂，经37℃恒温干燥或冷冻干燥制成乳酸菌粉，再用常规方法将乳酸菌药粉装入胶囊。然而，乳酸菌胶囊材料中的乳酸菌粉在制备过程中易板结，而且，乳酸菌在制备过程中易受到氧气、干燥条件或冷冻条件的损害，这会造成菌剂中菌株活性低和胶囊中菌粒难溶的现象。
[0007] 综上所述可以看出，现有技术没有解决在保持乳酸菌高活性的同时维持制品低成本的技术难题。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供一种将乳酸菌菌株特点与菌剂制备方法相结合，生产工艺简单、生产成本低的乳酸菌颗粒胶囊的制备方法。
[0009] 本发明为了实现上述目的，采用的技术解决方案是：一种乳酸菌颗粒胶囊的制备方法，步骤包括：
[0010] 一、菌株的制备：将乳酸菌接种于含有甘露醇的MRS液体培养基中进行菌株培养以提高其耐脱水性，菌株收获的最佳时间为菌种生长稳定期的中前期，将结束培养的乳酸菌液投入离心机中离心分离，收集沉淀在底部的菌泥，然后，将PBS缓冲液投入到菌泥中进行菌体洗涤，再次使用离心机离心分离并收集沉淀在底部的菌泥以获得乳酸菌的湿菌泥，加入无菌水，搅拌均匀后加入抗氧化剂，继续搅拌至均匀以获得乳酸菌制粒的菌芯；
[0011] 二、菌芯的制粒：对步骤一所得菌芯使用第一层包衣剂进行第一层包衣，得到轻压即散的湿菌粉，第一层包衣剂为无菌固态玉米淀粉和羟甲基纤维素钠；利用造粒机对湿菌粉进行第一次制粒，而后用第二层包衣剂对菌粒进行第二层包衣，第二层包衣剂为无菌固态玉米淀粉或无菌固态玉米淀粉与乳糖或L-赖氨酸盐中的任一种形成的固态混合物，再次使用造粒机对二次包衣的菌粒进行第二次制粒，将二次制粒后的菌粒进行干燥得到乳酸菌颗粒；
[0012] 三、胶囊包装：将步骤二中得到的乳酸菌颗粒装入胶囊，包装即得。
[0013] 进一步的，所述步骤一中，将–20℃ 保存的乳酸菌接种到含有甘露醇的MRS液体培养基中，菌株培养3 ～ 5 次后，得到驯化后的乳酸菌菌株，将其保存于–20℃备用；含有甘露醇的MRS液体培养基指将基础液体培养基的葡萄糖调整为葡萄糖、蔗糖、乳糖中的任一种糖分与甘露醇组成的混合物，其与甘露醇的质量比为1：1 ～ 1：3；基础液体培养基由下述成分组成：葡萄糖 20 g/L、 蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5g/L、 牛肉膏 10 g/L、柠檬酸氢二铵 2 g/L、 MgSO4﹒7H2O 0.58 g/L、 MnSO4﹒H2O 0.25 g/L、 CH3COONa﹒3H2O 5 g/L、 K2HPO4 2 g/L，10 g CaCO3 10 g/L、Tween-80 10ml/L。
[0014] 更进一步的，所述步骤一中，将–20℃ 保存的驯化后的乳酸菌接种到基础液体培养基中，振摇培养8 h,速度为70rpm/min，得到一级摇瓶种子液；将一级摇瓶种子液按8%的接种量接种到基础液体培养基或新配MRS液体培养基的任一种培养基中，振摇培养8 h，速度为70rpm/min，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，用于确定菌株达到生长稳定期的中前期的时间，培养结束后得到二级摇瓶种子液；将二级摇瓶种子液按8%的接种量接种到基础培养基或新配MRS液体培养基的任一种培养基中，振摇培养至菌株生长稳定期的中前期；新配MRS液体培养基由下述成分组成:蛋白胨5 g/L、玉米浆干粉5 g/L、 酵母粉5 g/L、 红糖120 g/L或含糖量为120 g/L的高粱汁、柠檬酸氢二铵 2 g/L、乙酸钠 5 g/L、丙酮酸钠0.18 g/L、L- 半光胱胺酸盐酸盐 0.05 g/L、血红素0.5 g/L、维生素K2 2 g/L、碳酸钙 10 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO4·H2O 0.25 g/L、Tween-80 1ml/L ；其pH 值为6.4, 在121°C 灭菌15 分钟制得。
[0015] 进一步的，所述步骤一中所述PBS缓冲液是指：每300 ml水溶液中含Nacl 2.4g、KCL 0.06g 、Na2HPO4·12H2O 0.462g、KH2PO4 0.06g。
[0016] 进一步的，所述步骤一中湿菌泥中加入的无菌水，水体积与湿菌体质量比为3.5：1 ～ 4：1，所述抗氧化剂为维生素C、维生素E和谷氨酸钠中的2 ～3种，抗氧化剂的添加量为湿菌体质量的4%～8%。
[0017] 进一步的，所述步骤二中的第一层包衣是指：将无菌固态玉米淀粉按照步骤一中的湿菌泥的质量比6：1～8：1的比例加入到步骤一所制备的菌芯中，搅拌均匀，搅拌速度为50 rpm / min ～ 70 rpm / min，而后加入羟甲基纤维素钠，其添加量为步骤一中湿菌泥的质量的0.5 % ～ 1.5%，继续搅拌至均匀，搅拌速度为50 rpm / min ～ 70 rpm / min，得到轻压即散的湿菌粉；第一次制粒是指：将湿菌粉投入造粒机内，调整粒度为65～ 100目，得乳酸菌的菌粒；第二次包衣是指：将无菌固态玉米淀粉或无菌固态玉米淀粉与乳糖、L-赖氨酸盐中的任一种物质形成的固态混合物按一定比例加入到第一次制粒制备的菌粒中，固态玉米淀粉加入量为步骤一中的湿菌泥质量的3～5倍，乳糖和L-赖氨酸盐添加量分别为步骤一中的湿菌泥质量的0.5% ～1.5%，然后，用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为10 rpm / min ～ 30 rpm / min；菌粒的第二次制粒：将第二次包衣后的菌粒投入造粒机，调整粒度为50～80目，制备乳酸菌的菌粒。
[0018] 进一步的，所述菌粒的干燥是指：将步骤二中第二次制粒得到的菌粒投入干燥器内进行干燥，控制温度40℃，时间24h，翻拌速度为0 rpm / min ～ 20 rpm / min。
[0020] 本发明的有益效果是：采用甘露醇驯化提高菌体的耐受性，降低了乳酸菌液在后处理工艺的菌活性损失。乳酸菌液是在生长稳定期的中前期，这个时期制备的菌剂活性在耐温、耐酸和耐胆盐的耐受性试验中要高于其他时间段，这个时间段收获的乳酸菌在制备成菌剂后可最大程度的保存菌株活性。乳酸菌在制备成菌剂前加入了抗氧化剂，这将使乳酸菌在后续的制备工艺中降低了氧气对其造成的损伤，这将有利于菌株在后续工艺中保留高活性而降低染菌的风险。包衣剂为固体，减少水的消耗。
具体实施方式
[0021] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；所述百分含量或浓度，如无特殊说明均为质量百分数。
[0022] 下述实施例中所用的培养基如下：
[0023] 基础液体培养基：葡萄糖 20 g/L、 蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5g/L、 牛肉膏 10 g/L、柠檬酸氢二铵 2 g/L、 MgSO4﹒7H2O 0.58 g/L、 MnSO4﹒H2O 0.25 g/L、 CH3COONa﹒3H2O 5 g/L、 K2HPO4 2 g/L，10 g CaCO3 10 g/L、Tween-80 10ml/L；pH值为6.4, 121°C灭菌15分钟。
[0024] 新配MRS液体培养基:蛋白胨5 g/L、玉米浆干粉5 g/L、 酵母粉5 g/L、 红糖120 g/L或含糖量为120g/L的高粱汁、柠檬酸氢二铵 2 g/L、乙酸钠 5 g/L、丙酮酸钠0.18 g/L、L- 半光胱胺酸盐酸盐 0.05 g/L、血红素0.5 g/L、维生素K2 2 g/L、碳酸钙 10 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO4·H2O 0.25 g/L、Tween-80 1ml/L ；其pH 值为6.4, 在121° C 灭菌15 分钟制得。
[0025] MRS固体培养基每升的组分及含量为: 上述基础液体培养基中加入1.5%琼脂粉(质量百分比), pH值为6.4, 121°C灭菌15分钟。
[0026] PBS缓冲液：每300 ml水溶液中含Nacl 2.4g、KCL 0.06g 、Na2HPO4·12H2O 0.462g、KH2PO4 0.06g。
[0027] 实施例1
[0028] 将–20℃ 保存的副干酪乳杆菌接种到基础液体培养基中，并将该培养基的葡萄糖调整为蔗糖与甘露醇组成的混合物，其质量比为1：1，菌株用此培养基培养5 次后，将此菌株保存于–20℃ 保存以待备用；
[0029] 将驯化后保存于–20℃的副干酪乳杆菌接种到基础液体培养基中，振摇培养8 h,速度为70rpm/min，得到一级摇瓶种子液；将一级种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，振摇培养8 h，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，确定菌株达到生长稳定期的中前期的时间为25 h，此时，停止培养，得到二级摇瓶种子液；将二级种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，振摇培养25 h；
[0030] 将上步培养的菌株投入到离心机进行离心，收集沉淀在底部的菌泥，然后，将PBS溶液投入到菌泥中进行菌体洗涤，再次离心并收集沉淀在底部的菌泥；将得到的湿菌泥加入无菌水，水体积与湿菌泥质量的比例为4：1 (V：W)，充分搅拌以混合均匀，然后，再按4 %的质量比例(W：W)加入维生素C、维生素E和谷氨酸钠中的3 种抗氧化剂，充分搅拌以混合均匀；
[0031] 将无菌固态玉米淀粉按其与上步中制备的湿菌泥的质量比为6：1（W：W）的比例加入到制备的含抗氧化剂的乳酸菌泥中，用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为50 rpm / min，再加入羟甲基纤维素钠，其添加量为制备的湿菌泥的质量的0.5 % (W：W)，用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为50 rpm / min，得到轻压即散的湿菌粉；
[0032] 将制备的湿菌粉投入造粒机内，调整粒度为65目，得到65目的乳酸菌的菌粒；将无菌固态玉米淀粉加入到菌粒中，无菌固态玉米淀粉加入量为制备的湿菌泥的质量的3倍 (W：W)，然后，混合物用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为10 rpm / min；
[0033] 将制备的菌粒投入造粒机内，调整粒度为50 目，得到50 目的乳酸菌的菌粒；将制备的菌粒投入干燥器内进行干燥，控制温度为40℃，翻拌速度为5 rpm / min，24 h后得到50 目的乳酸菌颗粒。
[0034] 菌粒的胶囊包装：按常规的方法将干燥后的菌粒装入胶囊，包装即得。
[0035] 实施例2
[0036] 与实施例1不同之处在于：
[0037] 菌粒的第二层包衣：将无菌固态玉米淀粉与乳糖形成的固态混合物按比例加入到第一次制粒中制备的菌粒中，无菌固态玉米淀粉加入量为湿菌泥的质量的3倍 (W：W)，乳糖添加量为湿菌泥的质量的0.5% (W：W) ，然后，混合物用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为10 rpm / min。
[0038] 实施例3
[0039] 与实施例1不同之处在于：
[0040] 菌粒的第二层包衣：将无菌固态玉米淀粉与L-赖氨酸盐形成的固态混合物按比例加入到第一次制粒中制备的菌粒中，其中，无菌固态玉米淀粉加入量为湿菌泥质量的3倍 (W：W)，L-赖氨酸盐添加量分别为湿菌泥质量的0.5% (W：W) ，然后，混合物用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为10 rpm / min；
[0041] 菌粒的第二次制粒：将上步制备的菌粒投入造粒机内，调整粒度为50 目，得到50 目的乳酸菌菌粒。
[0042] 实施例4
[0043] 与实施例1不同之处在于：
[0044] 将一级种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，振摇培养8 h，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，确定菌株达到生长稳定期的末期的时间为30 h，此时，停止培养，得到二级摇瓶种子液；将二级种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，振摇培养30 h。
[0045] 实施例5
[0046] 与实施例1不同之处在于：
[0047] 将一级种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，振摇培养8 h，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，确定菌株达到生长稳定期的末期的时间为30 h，此时，停止培养，得到二级摇瓶种子液；将二级种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，振摇培养30 h。
[0048] 菌粒的第二层包衣：将无菌固态玉米淀粉与乳糖形成的固态混合物按一定比例加入到第一次制粒中制备的菌粒中，无菌固态玉米淀粉加入量为湿菌泥质量的3倍 (W：W)，乳糖添加量分别为湿菌泥质量的0.5% (W：W)。
[0049] 实施例6
[0050] 与实施例1 的不同之处在于：
[0051] 将一级种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，振摇培养8 h，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，确定菌株达到生长稳定期的末期的时间为30 h，此时，停止培养，得到二级摇瓶种子液；将二级种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，振摇培养30 h；
[0052] 菌粒的第二层包衣：将无菌固态玉米淀粉与L-赖氨酸盐形成的固态混合物按比例加入到第一次制粒制备的菌粒中，无菌固态玉米淀粉加入量为湿菌泥质量的3倍 (W：W)，L-赖氨酸盐添加量分别为湿菌泥质量的0.5% (W：W)；
[0053] 菌粒的第二次制粒：将上步制备的菌粒投入造粒机内，调整粒度为50 目，得到50 目的乳酸菌的菌粒。
[0054] 实施例7
[0055] 将–20℃ 保存的植物乳杆菌接种到基础液体培养基中，并将该培养基的葡萄糖调整为蔗糖与甘露醇组成的混合物，其质量比为1：3，菌株用此培养基培养5 次后，将此菌株保存于–20℃ 保存以待备用；
[0056] 将驯化后保存于–20℃的植物乳杆菌接种到基础液体培养基中，静止搅拌培养8 h，得到一级摇瓶种子液；将一级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养8 h后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，确定菌株达到生长稳定期的中前期的时间为18h，此时，停止培养，得到二级摇瓶种子液；将二级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养18 h；
[0057] 将上步培养的菌株投入到离心机进行离心，收集沉淀在底部的菌泥，然后，将PBS溶液投入到菌泥中进行菌体洗涤，再次离心并收集沉淀在底部的菌泥；将得到的湿菌泥，加入无菌水，水体积与湿菌泥质量的比例为4：1 (V：W)，充分搅拌以混合均匀，然后，再按6 %的质量比(W：W)加入维生素C、维生素E和谷氨酸钠3种抗氧化剂，充分搅拌以混合均匀；
[0058] 菌泥的第一层包衣：将无菌固态玉米淀粉按其与湿菌泥质量比7：1（W：W）的比例加入到含抗氧化剂的乳酸菌泥中，用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为60 rpm / min，再加入羟甲基纤维素钠，其添加量为湿菌泥质量的1.5 % (W：W)，用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为60 rpm / min，得到轻压即散的湿菌粉；
[0059] 第一次制粒：将上步制备的湿菌粉投入造粒机内，调整粒度为65目，得到65目的乳酸菌的菌粒；
[0060] 菌粒的第二层包衣：将无菌固态玉米淀粉按比例加入到上步制备的菌粒中，无菌固态玉米淀粉加入量为湿菌泥质量的5倍 (W：W)，然后，混合物用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为10 rpm / min；
[0061] 菌粒的第二次制粒：将上步制备的菌粒投入造粒机内，调整粒度为50 目，得到50 目的乳酸菌的菌粒；
[0062] 菌粒的干燥：将上步制备的菌粒投入干燥器内进行干燥，控制温度为40℃，翻拌速度为5 rpm / min，24 h后得到50 目的乳酸菌颗粒；
[0063] 菌粒的胶囊包装：按常规的方法将上步干燥后的菌粒装入胶囊，包装即得。
[0064] 实施例8
[0065] 与实施例7不同之处在于：
[0066] 菌粒的第二层包衣：将无菌固态玉米淀粉与乳糖形成的固态混合物按比例加入到上步制备的菌粒中，无菌固态玉米淀粉加入量为湿菌泥质量的5倍 (W：W)，乳糖添加量分别为湿菌泥质量的1.0% (W：W)。
[0067] 实施例9
[0068] 与实施例7的不同之处在于：
[0069] 将一级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养8 h，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，确定菌株达到生长稳定期的末期的时间为24 h，此时，停止培养，得到二级摇瓶种子液；将二级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养24 h。
[0070] 实施例10
[0071] 与实施例7的不同之处在于：
[0072] 将一级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养8 h，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，确定菌株达到生长稳定期的末期的时间为24 h，此时，停止培养，得到二级摇瓶种子液；将二级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养24 h。
[0073] 菌粒的第二层包衣:将无菌固态玉米淀粉与乳糖形成的固态混合物按比例加入到上步制备的菌粒中，无菌固态玉米淀粉加入量为湿菌泥质量的5倍 (W：W)，乳糖添加量为湿菌泥质量的1.0% (W：W)。
[0074] 实施例11
[0075] 将–20℃保存的屎肠球菌接种到基础液体培养基中，并将该培养基的碳源调整为蔗糖与甘露醇组成的混合物，其质量比为1：2，菌株用此培养基培养5 次后，将此菌株保存于–20℃ 保存以待备用；
[0076] 将上步驯化后保存于–20℃的屎肠球菌接种到基础液体培养基中，静止搅拌培养8 h，得到一级摇瓶种子液；将一级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养8 h，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，确定菌株达到生长稳定期的中前期的时间为25 h，此时，停止培养，得到二级摇瓶种子液；将二级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养25 h；
[0077] 将上步培养的菌株投入到离心机进行离心，收集沉淀在底部的菌泥，然后，将PBS溶液投入到菌泥中进行菌体洗涤，再次离心并收集沉淀在底部的菌泥；将制备的湿菌泥加入无菌水，水体积与湿菌体质量比为4：1 (V：W)，充分搅拌以混合均匀，然后，再按6 %的质量比(W：W)加入维生素C、维生素E和谷氨酸钠3 种抗氧化剂，充分搅拌以混合均匀；
[0078] 菌泥的第一层包衣：将无菌固态玉米淀粉按其与湿菌泥质量比7：1（W：W）的比例加入到含抗氧化剂的乳酸菌泥中，用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为50 rpm / min，再加入羟甲基纤维素钠，其添加量为湿菌泥质量的1.5 % (W：W)，用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为50 rpm / min，得到轻压即散的湿菌粉；
[0079] 第一次制粒：将上步制备的湿菌粉投入造粒机内，调整粒度为80目，得到80目的乳酸菌的菌粒；
[0080] 菌粒的第二层包衣：将无菌固态玉米淀粉与乳糖形成的固态混合物按比例加入到上步制备的菌粒中，无菌固态玉米淀粉加入量为湿菌泥质量的4倍(W：W)，乳糖添加量为湿菌泥质量的1.5% (W：W)，然后，混合物用搅拌器搅拌均匀，搅拌速度为10 rpm / min；
[0081] 菌粒的第二次制粒：将上步制备的菌粒投入制粒机内，调整粒度为65 目，得到65 目的乳酸菌的菌粒；
[0082] 菌粒的干燥：将上步制备的菌粒投入干燥器内进行干燥，控制温度为40℃，翻拌速度为5 rpm / min，24 h后得到65 目的乳酸菌颗粒。
[0083] 菌粒的胶囊包装：按常规的方法将上步干燥后的菌粒装入胶囊，包装即得。
[0084] 实施例12
[0085] 与实施例11的不同之处在于：
[0086] 将一级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养8 h，然后，每间隔30min测定菌株的生长曲线，确定菌株达到生长稳定期的末期的时间为30 h，此时，停止培养，得到二级摇瓶种子液；将二级摇瓶种子液按8%的接种量接种到新配MRS液体培养基中，静止搅拌培养30 h。
[0087] 实施例13
[0088] 乳酸菌颗粒胶囊耐酸测定
[0089] (1)菌剂：实施例1 ～实施例12的乳酸菌颗粒胶囊。
[0090] (2)酸性环境:基础液体培养基用5M HCl调整pH值为2、2.5和3。
[0091] (3)耐酸测定:分别秤取1g乳酸菌颗粒胶囊加入到9 mL的pH值为2、2.5和3的基础液体培养基中，37℃温育2h，然后，取出样品加入到9mL的0.4 M 的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，混匀，取0.5 mL混合液涂布于常用MRS固体培养基， 37℃培养24 h后进行平板上菌落数的计数，存活率为测定的活菌数与未处理的活菌数的比值，每个pH测定设置3个重复。
[0092] 表1 不同酸性条件下乳酸菌颗粒胶囊中存活的活菌数均值
[0093]
[0094] 从表1看出，在酸性条件下，菌株在稳定期的中前期制备的颗粒胶囊(实例1、2、3、7、8、11)的活菌数要大于菌株在稳定期的末期制备的颗粒胶囊(实例4、5、6、9、10、12)。
[0095] 实施例14
[0096] 乳酸菌颗粒胶囊耐胆盐测定
[0097] (1)菌剂：实施例1 ～实施例12的乳酸菌颗粒胶囊。
[0098] (2)胆盐环境:基础液体培养基中加入不同含量的猪胆盐,使其终浓度分别为0.3% 和0.6%,并用5M HCl调整pH值为5.8。
[0099] (3)耐胆盐测定:分别称取1g乳酸菌颗粒胶囊加入到9 mL的胆盐浓度为0.3%和0.6%的基础液体培养基中，37℃温育2h，然后，取出样品加入到9mL的0.4 M 的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，混匀，取0.5 mL混合液涂布于常用MRS固体培养基， 37℃培养24 h后进行平板上菌落数的计数，存活率为测定的活菌数与未处理的活菌数的比值，每个测定设置3个重复。
[0100] 表2 不同浓度猪胆盐条件下乳酸菌颗粒胶囊中存活的活菌数均值
[0101]
[0102] 从表2看出，在不同猪胆盐浓度条件下，菌株在稳定期的中前期制备的菌粒胶囊(实例1、2、3、7、8、11)的活菌数要大于菌株在稳定期的末期制备的菌粒胶囊(实例4、5、6、9、10、12)。
[0103] 实施例15
[0104] 乳酸菌颗粒胶囊耐高温测定
[0105] (1)菌剂：实施例1 ～实施例12的乳酸菌颗粒胶囊。
[0106] (2)高温环境:设置62℃、 80℃和95℃三个温度梯度。
[0107] (3)耐高温测定:分别称取1g乳酸菌菌粒胶囊放入到铁盘中，将铁盘分别置于62℃、 80℃和95℃的烘箱中，放置时间为2min，然后，取出样品加入到5mL的基础液体培养基中，混匀，取0.5 mL混合液涂布于常用MRS固体培养基， 37℃培养24 h后进行平板上菌落数的计数，存活率为测定的活菌数与未处理的活菌数的比值，每个测定设置3个重复。
[0108] 表3 不同温度条件下乳酸菌颗粒胶囊中存活的活菌数均值
[0109]
[0110] 从表3看出，在不同高温条件下，菌株在稳定期的中前期制备的菌粒胶囊(实例1、2、3、7、8、11)的活菌数要大于菌株在稳定期的末期制备的菌粒胶囊(实例4、5、6、9、10、12)。
[0111] 实施例16
[0112] 乳酸菌颗粒胶囊对鲜苜蓿青贮的测定
[0113] (1)菌剂：选取实施例1 ～实施例12的乳酸菌颗粒胶囊中的实施例3、实施例7和实施例11为本实施例的菌剂，临用前用低于40℃的水配制1010cfu/mL浓度的乳酸菌溶液。
[0114] (2)青贮材料：处于初蕾期的苜蓿植物。
[0115] (3)分组及剂量设置：试验苜蓿按300g一组的方式分成10组，每组设置3个重复，每组苜蓿切割为5～7cm长，每组切割后的苜蓿加入乳酸菌颗粒胶囊的溶解液并翻拌均匀，然后，装入500mL的玻璃瓶中并压实，乳酸菌的浓度设为109cfu/mL和1010cfu/mL的两个浓度梯度，试验一至三组分别为109cfu/mL的实施例3、实施例7和实施例11的菌剂溶液，试验四至六组分别为1010cfu/mL的实施例3、实施例7和实施例11的菌剂溶液，试验七组为109cfu/mL9
的实施例3和实施例7的复合菌剂溶液，试验八组为10 cfu/mL的实施例3和实施例11的复合菌剂溶液，试验九组为109cfu/mL的实施例7和实施例11的复合菌剂溶液，试验十组为
109cfu/mL的实施例3、实施例7和实施例11的复合菌剂溶液。
的实施例3和实施例7的复合菌剂溶液，试验八组为10 cfu/mL的实施例3和实施例11的复合菌剂溶液，试验九组为109cfu/mL的实施例7和实施例11的复合菌剂溶液，试验十组为
109cfu/mL的实施例3、实施例7和实施例11的复合菌剂溶液。
[0116] (4)青贮苜蓿的品质测定：30天后，均匀准确称取20 g样品;加入180 mL蒸馏水，搅拌均匀，加保鲜膜;4℃下浸提24 h，经四层纱布和定性滤纸两次过滤所得液体为浸提液。浸提液用来测定苜蓿青贮料pH值，pH值使用雷磁PHS-25型pH仪测定。水溶性碳水化合物采用蒽酮 — 硫酸比色法测定,粗蛋白采用凯氏定氮法测定(FOSS公司全自动凯氏定氮仪)。
[0117] 表4 乳酸菌颗粒胶囊青贮效果值的均值
[0118]
[0119] 从表4看出，制备的乳酸菌颗粒胶囊均能对苜蓿达到好的青贮效果。
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