用于抑制口腔病原菌的乳酸菌菌株的食品、口腔清洁以及医药组合物
阅读：804发布：2020-05-11
专利汇可以提供用于抑制口腔病原菌的乳酸菌菌株的食品、口腔清洁以及医药组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于抑制 口腔 病原菌的乳酸菌菌株的食品、口腔清洁以及医药组合物。本发明涉及副干 酪乳 酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于 牙齿 美白和/或抑制口腔病原菌的用途。本发明还涉及一种含乳酸菌菌株食品组合物、医药组合物或口腔清洁组合物，其包含：副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通 微 生物 菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15077；以及赋形剂、稀释剂和/或载体。上述乳酸菌菌株具有抑制口腔病原菌的作用，且可以以食品、口腔清洁或医药组合物的形式存在。，下面是用于抑制口腔病原菌的乳酸菌菌株的食品、口腔清洁以及医药组合物专利的具体信息内容。
1.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于牙齿美白和/或抑制口腔病原菌的用途。
2.一种含乳酸菌菌株的组合物，其包含：
副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15077；以及赋形剂、稀释剂和/或载体，其中所述组合物为食品组合物、医药组合物或口腔清洁组合物。
3.如权利要求2所述的含乳酸菌菌株的组合物，其中该乳酸菌菌株为具有活性的菌株和/或去活性的菌株。
4.如权利要求2或3所述的含乳酸菌菌株的组合物，其中所述组合物为用于牙齿美白和/或抑制口腔病原菌的组合物。
5.如权利要求2或3所述的含乳酸菌菌株的组合物，其中该赋形剂、稀释剂和/或载体为食品。
6.如权利要求5所述的含乳酸菌菌株的组合物，其中该食品包含乳制饮品、茶、咖啡、口香糖及洁牙糖、宠物用肉干或以上的组合。
7.如权利要求2或3所述的含乳酸菌菌株的组合物，其为口服剂型或外用剂型。
8.如权利要求2或3所述的含乳酸菌菌株的组合物，其中该赋形剂、稀释剂和/或载体为牙膏、洁牙粉、漱口水、口气清新喷雾、涂氟剂、假牙清洁剂、宠物用洁牙胶或宠物用化毛膏、牙刷、牙间刷、牙线、口腔棉棒或宠物用洁牙骨。
9.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于制备食品组合物、医药组合物或口腔清洁组合物的用途。
10.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于制备抑制口腔病原菌的医药组合物的用途。
用于抑制口腔病原菌的乳酸菌菌株的食品、口腔清洁以及医
药组合物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种食品组合物、口腔清洁组合物以及医药组合物， 特别是一种包含抑制口腔病原菌的乳酸菌菌株的食品组合物、口腔清 洁组合物以及医药组合物。
背景技术
[0002] 幼儿的乳齿保健将会影响到未来的恒久齿，因此，从婴儿时期开 始，口腔清洁即十分重要。若口腔有细菌滋生，细菌容易附着于牙龈 表面，待乳齿长出后会直接附着于婴儿的乳齿上造成龋齿。乳齿是一 切牙齿的基础，乳齿可维系适当的空间及距离以提供未来恒久齿的生 长。若乳齿没有照顾好，放任乳齿产生龋齿，龋齿会导致空间严重丧 失，且将来恒久齿在发育时，恒久齿的周围都是细菌与脓包，导致新 长出来的牙齿也比较容易形成龋齿，甚至影响成年及老年后的牙周病 发生率。
[0003]
[0004] 一般食用含乳酸菌(LAB)的产品仅具有调整肠道健康的效果。虽 然有数以万计的乳酸菌菌株存在自然界，但目前仅发现少数乳酸菌菌 株可能具有维护口腔健康及美白牙齿的潜在性附属特质。这些菌株所 具有的抑制口腔病原菌的能力、吸附口腔黏膜表皮细胞的能力、在洁 牙产品中是否尚能维持抑制病原菌及产生过氧化氢的能力等特性，是 激发菌株在口腔展现功能，控制口腔中的微生态平衡、筛选有维护口 腔健康及美白牙齿功能性菌株时的重要依据。
[0005] 文献指出益生菌可以与病原菌竞争贴附的生存区域及营养需求， 促进病原菌产生聚集特性，并分泌抑菌物质使得病原菌较虚弱或甚至 杀死病原菌，来达到减少口腔病原菌数量并维持口腔健康的功效，以 及分泌过氧化氢去除口腔气味及美白牙齿的目的。
[0006] 时至今日，仅有少数菌株经实验过程发现具备有维持口腔健康及 美白牙齿的活性效果的乳酸菌菌株被确认。而乳酸菌对身体健康的功 能在于菌株(strain)的特异性而非菌种(species)，此种对于人的身体健 康有特殊功效的菌株称为功能性益生菌(Guidelines for the evaluation of probiotics in food；Report of joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food；London Ontario，Canada April 30and May 1，2002：1-7)。
[0007] 综上所述，开发具有抑制口腔病原菌的活性效果的功能性益生菌 是目前需努力的目标。
发明内容
[0009] 在一些实施方案中，本发明提供一种培养物，其包所述的副干酪 乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株。在一些实施方案中， 所述培养物还可以包括适当的乳酸菌培养基，包括固体培养基和液体 培养基，例如MRS培养基。在一些实施方案中，所述培养物包括副 干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株的冷冻干燥培养物。
[0010] 在一些实施方案中，本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于牙齿美白和/或抑制口腔病原菌的用途。在 一些实施方案中，本发明提供用于牙齿美白和/或抑制口腔病原菌和/ 或治疗口腔病原菌感染的疾病的方法，所述方法包括将副干酪乳酸杆 菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株施用给受试者。在一些实施方 案中，本发明提供治疗例如龋齿、蛀牙、牙周病如牙周炎、口臭等疾 病的方法，所述方法包括将副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei) ET-22菌株施用给受试者。在一些实施方案中，副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株可以以组合物如食品组合物、口 腔清洁组合物以及医药组合物的形式提供给受试者。在一些实施方案 中，本发明提供抑制口腔病原菌和/或治疗口腔病原菌感染的疾病的 方法，所述口腔病原菌可以包括变形链球菌(Streptococcus mutans)， 具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)(包括多型亚种subsp. polymorphum)、放线共生放线杆菌(Aggregatibacter
actinomycetemcomitans)和牙龈卟啉单孢菌(Porphyromonas gingivalis) 等。
actinomycetemcomitans)和牙龈卟啉单孢菌(Porphyromonas gingivalis) 等。
[0011] 在一些实施方案中，本发明提供一种含乳酸菌菌株的组合物，其 包含：副干酪乳酸杆菌(Lactobacillusparacasei)ET-22菌株，保藏于 中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15077；以 及赋形剂、稀释剂和/或载体。在一些实施方案中，所述组合物为适 合用于口腔的组合物，例如用于牙齿美白和/或用于抑制口腔细菌的 组合物。
[0012] 在一些实施方案中，该乳酸菌菌株为具有活性的菌株。
[0013] 在一些实施方案中，该乳酸菌菌株为去活性的菌株。
[0014] 在一些实施方案中，所述组合物可以为适合使用的任何组合物形 式，例如可以为食品(包括饮料)组合物、医药组合物或口腔清洁组 合物。在一些实施方案中，所述食品组合物、医药组合物或口腔清洁 组合物为用于口腔的组合物，例如用于牙齿美白和/或用于抑制口腔 细菌的食品组合物、医药组合物或口腔清洁组合物。在一些实施方案 中，含有本发明乳酸菌菌株的组合物具有牙齿美白和/或抑制口腔病 原菌的作用，且以食品、口腔清洁或医药组合物的形式存在。
[0015] 在一些实施方案中，所述组合物可以为食品组合物。在一些实施 方案中，该赋形剂、稀释剂和/或载体可以为食品。
[0016] 在一些实施方案中，该食品可以包括饮品如粮食制品、油、肉制 品、乳制品、水产品、罐头、含糖食品、冷食、酒品、宠物食品等。 在一些实施方案中，所述食品可以包括饮品如乳制饮品、茶、咖啡、 口香糖及洁牙糖、宠物用肉干或以上的组合。
[0017] 在一些实施方案中，所述组合物可以为医药组合物。在一些实施 方案中，所述组合物可以制成口服剂型或外用剂型。在一些实施方案 中，所述组合物可以包括治疗和/或预防用组合物。在一些实施方案 中，所述组合物可以是营养组合物。在一些实施方案中，所述组合物 可以制成干剂或湿剂。在一些实施方案中，所述组合物可以制成凝胶、 乳膏、喷雾剂、气溶胶、软膏、乳剂、混悬剂、贴片、口含片剂、舌 下片剂等形式。
[0018] 在一些实施方案中，所述组合物可以为口腔清洁组合物。在一些 实施方案中，该赋形剂、稀释剂和/或载体可以为牙膏、洁牙粉、漱 口水、口气清新喷雾、涂氟剂、假牙清洁剂、宠物用洁牙胶或宠物用 化毛膏。在一些实施方案中，该赋形剂、稀释剂和/或载体为牙刷、 牙间刷、牙线、口腔棉棒或宠物用洁牙骨。在一些实施方案中，此外， 所述组合物可以为固体、粉状、或浆状口腔卫生组合物。在一些实施 方案中，所述组合物可以为牙膏，口香糖，糖果、液体漱口液如漱口 剂等。
[0019] 在一些实施方案中，本发明的组合物可以用作益生菌和/或益生 元组合物、用于治疗口腔感染的药物组合物、或功能食品。在一些实 施方案中，该副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株具 有抑制口腔病原菌的活性。
[0020] 在本文中，益生菌可以指使用活的微生物，其能够添加到组合物 如食品(如牛奶、乳酪)、药品(如胶囊、片剂、丸剂、粉剂等)或口腔 卫生用品等中，保持活性并且对摄取含有所述益生菌的组合物的对象 发挥其生理学作用。益生元可以指这样的物质，所述物质被添加到组 合物如食品(如牛奶、乳酪)、药品(如胶囊、片剂、丸剂、粉剂等)或 口腔卫生用品等中，其对微生物群的组分发挥作用，有利于建立对健 康有利的细菌和/或阻碍致病细菌建立。在一些实施方案中，本发明 的菌株可以制备成益生菌或益生元的形式。
[0021] 在一些实施方案中，本发明提供一种含乳酸菌菌株的食品组合物， 包含：
[0022] 具有抑制口腔病原菌的活性效果的乳酸菌菌株，该乳酸菌菌株选 自以下群组中的至少一种经分离的乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌种保 藏中心(保藏编号CGMCC No.15077)；以及生理上可接受的赋形剂 或稀释剂。
[0023] 在一些实施方案中，该乳酸菌菌株为具有活性的菌株。
[0024] 在一些实施方案中，该乳酸菌菌株为去活性的菌株。
[0025] 在一些实施方案中，该赋形剂或稀释剂为食品。
[0026] 在一些实施方案中，该食品包含乳制饮品、茶、咖啡、口香糖及 洁牙糖、宠物用肉干或以上的组合。
[0027] 在一些实施方案中，本发明提供一种含乳酸菌菌株的医药组合物， 包含：
[0028] 具有抑制口腔病原菌的活性效果的乳酸菌菌株，该乳酸菌菌株选 自以下群组中的至少一经分离的乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌种保 藏中心(保藏编号CGMCC No.15077)；以及医药上可接受的赋形剂 或稀释剂。
[0029] 在一些实施方案中，该乳酸菌菌株为具有活性的菌株。
[0030] 在一些实施方案中，该乳酸菌菌株为去活性的菌株。
[0031] 在一些实施方案中，该医药组合物为口服剂型或外用剂型。
[0032] 在一些实施方案中，本发明提供一种含乳酸菌菌株的口腔清洁组 合物，包含：
[0033] 具有抑制口腔病原菌的活性效果的乳酸菌菌株，该乳酸菌菌株选 自以下群组中的至少一经分离的乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌种保 藏中心(保藏编号CGMCC No.15077)。
[0034] 在一些实施方案中，该乳酸菌菌株为具有活性的菌株。
[0035] 在一些实施方案中，该乳酸菌菌株为去活性的菌株。
[0036] 在一些实施方案中，该口腔清洁组合物的赋形剂或稀释剂为牙膏、 洁牙粉、漱口水、口气清新喷雾、涂氟剂、假牙清洁剂、宠物用洁牙 胶或宠物用化毛膏。
[0037] 在一些实施方案中，该载体为牙刷、牙间刷、牙线、口腔棉棒或 宠物用洁牙骨。
[0038] 在一些实施方案中，本发明提供一种含乳酸菌菌株的食品组合物、 口腔清洁组合物以及医药组合物，其可抑制口腔病原菌的生长，以维 持口腔健康。
[0039] 本发明一个实施方案的含乳酸菌菌株的食品组合物包含具有抑 制口腔病原菌的活性效果的乳酸菌菌株，该乳酸菌菌株选自以下群组 中的至少一经分离的乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌(Lacfobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(保藏 编号CGMCC No.15077)；以及生理上可接受的赋形剂或稀释剂。
[0040] 本发明另一个实施方案的含乳酸菌菌株的医药组合物包含具有 抑制口腔病原菌的活性效果的乳酸菌菌株，该乳酸菌菌株选自以下群 组中的至少一株经分离的乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌种保 藏中心(保藏编号CGMCC No.15077)；以及生理上可接受的赋形剂 或稀释剂。
[0041] 本发明再一个实施方案的含乳酸菌菌株的口腔清洁组合物包含 具有抑制口腔病原菌的活性效果的乳酸菌菌株，该乳酸菌菌株选自以 下群组中的至少一株经分离的乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌种保 藏中心(保藏编号CGMCC No.15077)；以及生理上可接受的赋形剂 或稀释剂。
[0042] 在一些实施方案中，本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于制备组合物如食品组合物、医药组合物或 口腔清洁组合物的用途。
[0043] 在一些实施方案中，本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于制备抑制口腔病原菌的医药组合物的用途。 在一些实施方案中，已经令人吃惊的发现副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株与不含所述菌株的对照或对照菌 株如其它乳杆菌菌株(如普通副干酪乳酸杆菌菌株)相比具有优异的 抑制口腔病原菌的作用。在一些实施方案中，副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株与不含所述菌株的对照或对照菌 株如其它乳杆菌菌株(如普通副干酪乳酸杆菌菌株)相比具备产生过 氧化物活性，由此可以用于例如牙齿美白。在一些实施方案中，副干 酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株与不含所述菌株的对 照或对照菌株如其它乳杆菌菌株(如普通副干酪乳酸杆菌菌株)相比 能够抑制下述一种或多种口腔病原菌或具有提高的抑制活性(例如提 高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、 2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍) 的抑制活性：变形链球菌(Streptococcus mutans)，具核梭杆菌 (Fusobacterium nucleatum)(包括多型亚种subsp.polymorphum)、放 线共生放线杆菌(Aggregatibacter actmomycetemcomitans)和牙龈卟啉 单孢菌(Porphyromonas gingivalis)等。在一些实施方案中，副干酪乳 酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株与不含所述菌株的对照或 对照菌株如其它乳杆菌菌株(如普通副干酪乳酸杆菌菌株)相比能够 抑制全部口腔病原菌或具有提高的抑制活性(例如提高10％、20％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4 倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍)的抑制活性：变 形链球菌(Streptococcus mutans)，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)(包括多型亚种subsp.polymorphum)、放线共生放线杆菌 (Aggregatibacter actinomycetemcomttans)和牙龈卟啉单孢菌 (Porphyromonas gingivalis)。在一些实施方案中，副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株与不含所述菌株的对照或对照菌 株如其它乳杆菌菌株(如普通副干酪乳酸杆菌菌株)相比尤其能够抑 制下述口腔病原菌或具有提高的抑制活性(例如提高10％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5 倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍)的抑制活性：具核梭 杆菌(Fusobacterium nucleatum)(包括多型亚种
subsp.polymorphum)、 放线共生放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)和牙龈卟 啉单孢菌(Porphyromonas gingivalis)。在一些实施方案中，所述医药 组合物可以用于治疗例如龋齿、蛀牙、牙周病如牙周炎、口臭等疾病。 在一些实施方案中，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22 菌株可以制备用于牙齿美白和/或治疗口腔疾病的组合物和/或试剂盒。 在一些实施方案中，所述牙齿美白和/或治疗口腔疾病的组合物和/或 试剂盒还可以包括其它适当的牙齿美白和/或治疗口腔疾病的物质。
40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5 倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍)的抑制活性：具核梭 杆菌(Fusobacterium nucleatum)(包括多型亚种
subsp.polymorphum)、 放线共生放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)和牙龈卟 啉单孢菌(Porphyromonas gingivalis)。在一些实施方案中，所述医药 组合物可以用于治疗例如龋齿、蛀牙、牙周病如牙周炎、口臭等疾病。 在一些实施方案中，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22 菌株可以制备用于牙齿美白和/或治疗口腔疾病的组合物和/或试剂盒。 在一些实施方案中，所述牙齿美白和/或治疗口腔疾病的组合物和/或 试剂盒还可以包括其它适当的牙齿美白和/或治疗口腔疾病的物质。
[0044] 在一些实施方案中，本发明提供制备组合物如食品组合物、医药 组合物或口腔清洁组合物的方法，所述方法包括将副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)ET-22菌株加入到组合物中。
[0046] 图1为本发明的乳酸菌菌株产过氧化氢的试验结果。
[0047] 图2为本发明的活性乳酸菌菌株抑制口腔病原菌的试验结果。
[0048] 图3为本发明的去活性乳酸菌菌株抑制口腔病原菌的试验结果。
[0049] 【生物材料保藏】
[0050] 本发明的副干酪乳酸杆菌(Lactobacillusparacasei)ET-22菌株保 藏于：
[0051] 中国典型培养物保藏中心/中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年12月18日、保藏编号 CGMCC No.15077；该保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
[0052] 以下将详述本发明的各实施例，并配合图式作为例示。除了这些 详细说明之外，本发明亦可广泛地施行于其它的实施例中，任何所述 实施例的轻易替代、修改、等效变化都包含在本发明的范围内，并以 申请专利范围为准。在说明书的描述中，为了使读者对本发明有较完 整的了解，提供了许多特定细节；然而，本发明可能在省略部分或全 部特定细节的前提下，仍可实施。此外，众所周知的步骤或组件并未 描述于细节中，以避免对本发明形成不必要的限制。图式中相同或类 似的组件将以相同或类似符号来表示。特别注意的是，图式仅为示意 之用，并非代表组件实际的尺寸或数量，有些细节可能未完全绘出， 以求图式的简洁。
[0053] 本发明所述的乳酸菌菌株的冷冻干燥培养物已保藏于中国典型 培养物保藏中心以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心。保藏的详细资料如表1所示：
[0054] 表1乳酸菌菌株的保藏资料
[0055]菌株名 分类 保藏编号 保藏日期
ET-22 副干酪乳酸杆菌 CGMCC 15077 2017年12月18日
ET-22 副干酪乳酸杆菌 CGMCC 15077 2017年12月18日
[0057] MRS液体培养基：蛋白胨，10.0g；牛肉膏，10.0g；酵母浸粉， 5.0g；葡萄糖，20.0g；磷酸氢二钾，5.0g；柠檬酸氢二铵，2.0g；乙 酸钠，5.0g；七水合硫酸镁，0.5g；四水合硫酸锰，0.2g；吐温80， 1.0g；琼脂15.0g；蒸馏水1000mL。调整pH至6.2～6.4之间，121℃ 灭菌15分钟。
[0058] L.paracasei ET-22为微好氧菌，兼性厌氧环境生长较佳，产乳 酸，具有耐酸性，可耐受pH值2.5的酸性环境及耐0.4％的胆盐环境 4小时，嗜中温菌，生长温度范围在15～45℃，最适生长温度在37℃ 左右。
[0059] 如表1所列已保藏的一株乳酸菌中，副干酪乳酸杆菌ET-22菌株 被发现具有抑制口腔病原菌的能力，例如龋齿菌、牙龈菌及口腔气味 菌等。此外，副干酪乳酸杆菌ET-22菌株可以分泌过氧化氢，除了抑 制口腔病原菌之外，还可以达到美白牙齿的功效。
[0060] 本发明包含具有抑制口腔病原菌的活性效果的乳酸菌菌株，该乳 酸菌菌株选自以下群组中的至少一经分离的乳酸菌菌株：副干酪乳酸 杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌 种保藏中心(保藏编号CGMCC No.15077)，以及生理上可接受的赋 形剂、稀释剂或载体所组成的食品组合物或口腔清洁组合物，或医药 上可接受的赋形剂或稀释剂所组成的医药组合物。其中乳酸菌菌株可 为具有活性或去活性(inactivated)的菌株。
[0061] 于食品组合物的实施例中，生理上可接受的赋形剂或稀释剂可为 食品，举例而言，食品可包含但不限于乳制饮品、茶、咖啡、口香糖 及洁牙糖(例如口含片、咀嚼锭、软糖等)、宠物用肉干或以上的组合， 其中乳制饮品可包含发酵乳、酸奶、奶酪或乳粉。于口腔清洁组合物 的实施例中，赋形剂或稀释剂可为牙膏、洁牙粉、漱口水、口气清新 喷雾、涂氟剂(例如涂抹于幼儿牙齿的氟剂)、假牙清洁剂、宠物用洁 牙胶或宠物用化毛膏等；载体可为牙刷、牙间刷、牙线、口腔棉棒或 宠物用洁牙骨等。医药组合物可包含口服剂型或外用剂型。举例而言， 口服剂型可为锭剂、胶囊、溶液剂及粉剂等。
[0062] 在组合物中，所述菌株可以以有效量存在。例如在食品组合物或 医药组合物中，乳酸菌菌株的数量为106CFU以上，例如107CFU以 上，108CFU以上，109CFU以上，1010CFU以上；较佳者，乳酸菌 菌株的数量为1010CFU以上。
[0063] 目前已知部份菌株对于抑制龋齿菌及牙周菌是有功效的，但文献 指出，多数的研究都是针对个别菌株在口腔内的功效进行试验，且不 是所有的试验结果皆证明乳酸菌对于口腔健康是有帮助的，还是有菌 株功效上的个体差异(Anna Haukioja，European Journal of Dentistry 2010(4)：348-355)。举例而言，Vuotto C等(International Journal of Oral Science 2014(6)：189-194)针对益生菌对于病原菌的抑制能力分析，提 到任何一株益生菌都不会是相同的，即便是同种不同株的益生菌，试 验的结果有时都会是相反的。这样的结果更加强调益生菌对于口腔病 原菌的抑制及美白牙齿等功效确实是有菌株特异性的现象。
[0064] 事实上，由本发明的下列试验结果可知，多数乳酸杆菌菌株并不 具有抑制口腔病原菌及美白牙齿的作用。国内外目前针对益生菌在维 护口腔健康相关功能研究的文献报导在近期才有陆续增加的趋势。早 期认为益生菌之中的乳酸菌各属，由于产酸的特性有可能与口腔病原 菌共存之外，还有可能促成腐蚀珐琅质，而造成龋齿。但实际上，由 实验显示乳酸菌不但可以抑制龋齿菌及牙周菌之外，还能与之竞争口 腔黏膜的生存空间及营养来源，并且造成口腔病原菌的凝集而易排除。 但这些特性都必须透过实验才能确认，并非所有的菌株皆有相同的特 性及实验结果。应说明的是，本发明所请求保护的菌株仅包含保藏于 中国典型培养物保藏中心/中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心的副干酪乳酸杆菌ET-22菌株，保藏于中国普通微生物菌种保 藏中心(保藏编号CGMCC No.15077)，并非广泛地包含以上所有相 同菌种的乳酸菌。
[0065] 实例1：维持口腔健康的乳酸菌的形态学以及一般性质
[0066] 根据16S rDNA序列分析以及API细菌鉴定系统分析结果来确认 菌株在分类学上的特征。上述菌株在形态学及一般性质上的特征详细 列于表2：
[0067] 表2乳酸菌菌株的形态学及一般性质特征
[0068]
[0069]
[0070] 实例2：分析菌株产生过氧化氢的特性，以确认对于牙齿美白的 功能
[0071] 检视本发明的乳酸菌菌株-副干酪乳酸杆菌ET-22菌株产生过 氧化氢的能力，藉此来验证本发明的乳酸菌菌株的美白牙齿的能力。 实验步骤如下：
[0072] 1.制备益生菌产过氧化氢筛选平板。
[0073] 2.在平板内加入三甲基硼(Trimethyl borane TMB)0.25mg/mL 与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase HR)0.01mg/mL。
[0074] 3.在平板上以画四区方式培养目标菌株。
[0075] 4.培养两天后，有产生过氧化氢的乳酸菌菌株，会在菌落周围呈 现蓝色。
[0077] 6.培养乳酸菌菌液并以4500rpm离心5分钟。
[0078] 7.取菌体的部分溶于4.9毫升100mM的哌嗪-1，4-二乙磺酸 (Piperazine-1，4-bisethanesulfonicacid，PIPES)。
[0079] 8.以37℃220rpm培养5小时，将菌体离心后取10微升(μL) 上清液或沉降的菌体滴于过氧化氢检测试纸(Merck)反应10秒钟， 观察颜色变化并与比色卡比对记录浓度。
[0080] 实验结果如图1所示。图1为副干酪乳酸杆菌ET-22菌株在过氧 化氢检测平板上培养后，在平板上显示分泌过氧化氢能力的结果。
[0081] 由图1的试验结果可知，培养两天后，在菌株的生长过程中，本 发明的副干酪乳酸杆菌ET-22菌株有良好的过氧化氢分泌情形。另须 说明的是，非本发明的相同菌种的乳酸菌菌株，例如副干酪乳酸杆菌 9菌株(BCRC 16093)，则没有分泌过氧化氢的能力，如图1所示。
[0082] 实例3：维持口腔健康的活性乳酸菌对于口腔病原菌的抑制能力
[0083] 乳酸菌要发挥口腔保健功能，首重口腔病原菌的抵抗能力是否强 大。口腔病原菌不仅仅只是大众比较熟知的变形链球菌(Streptococcus mutans)，还包含具核梭杆菌多型亚种(Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum)、放线共生放线杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans)、牙龈卟啉单孢菌(Porphyromonas gingivalis) 等。各菌株所引起的症状分别是：变形链球菌造成龋齿；具核梭杆菌 多型亚种主要造成牙周病、口臭及结肠癌等问题；放线共生放线杆菌 则是引起牙周炎、口腔发炎及肺炎的主要菌种；牙龈卟啉单孢菌则是 成人型牙周炎致病菌及口臭的主因。此外，对于口腔气味，除了牙龈 卟啉单孢菌是引起口臭的主要菌种外，具核梭杆菌多型亚种、放线共 生放线杆菌以及牙龈卟啉单孢菌皆会产生硫化物，也是影响口腔气味 的主要菌种之一。
[0084] 因此，本发明进行病原菌抑制试验，评估本发明的活性副干酪乳 酸杆菌ET-22菌株抑制口腔病原菌的能力，进而达成维持口腔健康的 效果。使用如下的实验步骤：
[0085] 1.将活性乳酸菌涂布于MRS平板中央两公分直径处，培养两天。
[0086] 2.倒入口腔病原菌之培养基于已生长乳酸菌之平板上方，待凝固 后，将高浓度口腔致病菌涂布于病原菌培养基平板上，涂布均匀。
[0087] 3.培养在37℃环境中2-4天。
[0088] 4.中央下层培养基有涂布乳酸菌的部分是否有抑制病原菌生长， 测量抑制直径大小。
[0089] 实验结果如图2所示，图2为本发明的乳酸菌菌株抑制口腔病原 菌的能力分析。
[0090] 如图2所示为本发明的副干酪乳酸杆菌ET-22菌株抑制口腔病原 菌生存的结果，与另一株副干酪乳杆菌9比较，ET-22的抑制效果最 为显著。
[0091] 实例4：维持口腔健康的去活性乳酸菌对于口腔病原菌的抑制能 力
[0092] 除了活性乳酸菌抑制口腔病原菌的功能外，去活性之乳酸菌对于 抑制口腔病原菌的能力是否尚保有其功能由为未未知，因此，本发明 进行病原菌抑制试验，评估本发明的去活性副干酪乳酸杆菌ET-22菌 株抑制口腔病原菌的能力，进而达成维持口腔健康的效果。使用如下 的实验步骤：
[0093] 1.活化口腔病原菌。
[0094] 2.将热致死乳酸菌调整菌数，依每毫升十亿菌体的比例与病原菌 共同培养。
[0095] 3.以厌氧方式、150rpm转速培养在37℃环境中2-4天。
[0096] 4.计数病原菌的数量。
[0097] 实验结果如图3所示，图3为本发明的去活性乳酸菌菌株抑制口 腔病原菌的能力分析；柱状图皆以Mean±SD表示之，并与另一株副 干酪乳杆菌9比较。
[0098] 如图3所示为本发明的去活性副干酪乳酸杆菌ET-22菌株抑制口 腔病原菌生存的结果，与副干酪乳杆菌9菌株的抑制效果相比，ET-22 最为显著。
[0099] 综合以上试验结果，本发明的含乳酸菌菌株的食品组合物以及医 药组合物可抑制口腔病原菌的生长，可作为降低人体龋齿、牙周病及 口气异味等应用。较佳者，可分泌过氧化氢的乳酸菌菌株对于牙齿的 美白亦有作用能力。本发明找出对人体无副作用且有益于维持口腔健 康乳酸菌作为维持口腔健康的新选择。
[0100] 实例5：肠道菌群调节效果(测序结果)
[0101] 本实施例意图证实本发明的副干酪乳杆菌在肠道调节方面的效 果，其原理和步骤参见“保健食品检验与评价技术规范-调节肠道菌群 功能判定标准”。本实验采用16S rDNA测序结果。
[0102] 实验样品：菌粉样品(活菌数见包装规格)由内蒙古乳业技术研 究院有限责任公司提供。
[0103] 实验材料：6周龄健康成年BABL/c小鼠182只，体重约18-20g。
[0104] 实验步骤
[0105] 1.样品准备
[0106] 活菌样品(ET-22)：依据样品规格，各称取1g活菌样品，分别 使用PBS溶液悬浮至40ml，即活菌浓度均为2.5x109CFU/ml。
[0107] 高剂量组：按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为 0.4ml，高剂量组小鼠灌胃剂量为109CFU/20g。
[0108] 中剂量组：分别取5ml高剂量悬浮液加入PBS定容至50ml，按 照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，中剂量组小 鼠灌胃剂量为108CFU/20g。
[0109] 低剂量组：分别取5ml中剂量组悬浮液加入PBS定容至50ml， 按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，低剂量组 小鼠灌胃剂量为107CFU/20g。
[0110] 2.调节肠道菌群实验
[0111] (1)6周龄BABL/c小鼠饲养于清洁级动物房，温度22℃，湿 度10-60％，12小时明暗交替照明，标准饲料喂养，自由饮水。
[0112] (2)适应性喂养5天，182只小鼠随机分为13组，每组14只， 分组情况见表3。
[0113] 表3调节肠道菌群实验分组
[0114]
[0115] (3)开始灌胃前，无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃ 保存，检测肠道菌群。
[0116] (4))实验按照0.2ml/10g灌胃量给予各受试物，对照组1-14天 给予PBS，实验组分别依据表3灌胃给予相应剂量的受试物。小鼠每 周称重一次，根据体重调整灌胃量。
[0117] (5)14天后无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存， 检测肠道菌群。
[0118] 3小鼠肠道微生物多样性变化
[0119] 微生物多样性是基于Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序 （Paired-End)的方法，构建小片段文库进行测序。通过对Reads拼接 过滤，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，并进行物种注释及 丰度分析，可以揭示样品的物种构成；将优化序列进行聚类，划分 OTU，并根据OTU的序列组成得到其物种分类。基于OTU分析结果， 对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在菌属水平上 的群落结构。
[0120] 通过Alpha多样性分析研究单个样品内部的物种多样性，统计了 各样品在97％相似度水平下的Ace、Chaol、Shannon及Simpson指 数，绘制了样品稀释曲线及等级丰度曲线；进一步进行α多样性分析 (Alpha Diversity)、β多样性分析(Beta Diversity)和显著物种差异分析 等等，可以挖掘样品之间的差异。肠道菌群α多样性指数比较：Chaol 和ACE指衡量物种丰度即物种数量的多少；Shannon和Simpson指 数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响。 相同物种丰度情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落 具有越大的多样性，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说 明样品的物种多样性越高。在属的水平与对照组相比，ET-22干预后 可显著增加小鼠肠道中的相对丰度。其中低剂量组的OTU、ACE、 Chaol指数显著上升，显示ET-22低剂量最能够明显增加肠道微生物 多样性。
[0121]
[0122] 黄色(下划线)标示：与对照组相比有统计上显著差异(p＜0.05)。
[0123] 在致病菌属的水平，控制组相比，ET-22低剂量与中剂量两组小鼠肠 道中的脱硫弧菌(Desulfovibrio)均显著下降；中剂量与高剂量两组的幽 门螺杆菌(Helicobacter)数量显著下降；低剂量与中剂量三组的高埃希氏 菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)均显著下降。BL-99可显著增加小 鼠肠道中的乳酸杆菌属(Lactobacillus)相对丰度，且BL-99低剂量组对 乳酸杆菌(Lactobacillus)的增加程度最为显著。
[0124] 因此，补充不同剂量的ET-22可以调节肠道菌群平衡，抑制有害菌甚 至是致病菌数量，起到潜在的健康之功效。
[0125] 除非另有说明，本说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分、 细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约” 的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据 通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前 的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识 到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案 的许多等同物。所附权利要求书意图涵盖这类等同物。
[0126] 本领域技术人员会清楚，可以进行本发明的许多修改和变化而不背离 其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并不意 味着以任何方式限制。本发明的真正范围和精神通过所附权利要求书示出， 说明书和实施例仅是示例性的。
[0127] 以上所述的实施例仅是为说明本发明的技术思想及特点，其目的在使 本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，当不能以之限定本发 明的专利范围，即大凡依本发明所揭示的精神所作的均等变化或修饰，仍 应涵盖在本发明的专利范围内。
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