一种含乳双歧杆菌的发酵乳制品及其应用
阅读：1037发布：2020-06-28
专利汇可以提供一种含乳双歧杆菌的发酵乳制品及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种含乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)的 发酵 乳制品及其应用。具体而言，本发明提供了一种发酵乳制品，其中包含保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。所述保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌可以以活性菌或灭活形式存在于发酵乳制品中。本发明的发酵乳制品具有 预防 骨质疏松、调节肠道菌群平衡等功效。，下面是一种含乳双歧杆菌的发酵乳制品及其应用专利的具体信息内容。
1.一种发酵乳制品，其中包含保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌
(Bifidobacterium lactis)。
2.根据权利要求1所述的发酵乳制品，其为活菌型或灭菌型的发酵乳、风味发酵乳或发酵乳饮料。
3.根据权利要求1所述的发酵乳制品，其中，所述保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以活性菌或灭活形式存在于发酵乳制品中。
4.根据权利要求1所述的发酵乳制品，其中，所述保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆
3 10
菌在发酵乳制品中的含量为1.0×10CFU/mL～1.0×10 CFU/mL；或者，
以发酵乳制品的总重量为100％计，保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以菌体的重量计为0.001μg/mL～100mg/mL，优选为0.01μg/mL～100mg/mL，更优选为0.01μg/mL～
10mg/mL。
5.根据权利要求1所述的发酵乳制品，其是以生鲜乳或复原乳为原料，添加或不添加其它原料，经杀菌、接种包括保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌的发酵剂菌种发酵而制成的。
6.根据权利要求5所述的发酵乳制品，其中，所述发酵剂菌种为保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌；或者，
所述发酵剂菌种包括保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌，还包括嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的混合菌种，二者活菌数比例为1:1～1:2；优选地，所述发酵剂菌种还包括嗜酸乳杆菌、其它乳双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。
7.保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌在制备具有预防骨质疏松功效的发酵乳制品中的应用。
8.保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌在制备具有调节胃肠道菌群平衡功效的发酵乳制品中的应用。
9.保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌在制备具有提高免疫力功效的发酵乳制品中的应用。
10.根据权利要求7或8或9所述的应用，其中，所述发酵乳制品为权利要求1～6任一项所述的发酵乳制品。
一种含乳双歧杆菌的发酵乳制品及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 骨质疏松症是以骨量减少，骨的微细结构破坏为特征的一种全身性代谢性的骨骼疾病。其表现为骨脆性增加，易诱发骨折。目前全球约2亿人口患有骨质疏松。由于骨质疏松症引起的髋部骨折的发病率在全世界都在增加，老年人群大部分受到骨折风险的影响。在世界范围内统计每年残疾总数为580万。这一数字中有51％是因骨折而引起的，主要发生在欧洲和美洲。因此，在发达国家，骨质疏松性骨折被认为是死亡率和发病率的重要原因。最常见的骨质疏松症类型是与50岁及以上的女性的绝经后有关。50岁以上的老人中，1/3的女性和1/5的男性会受到骨质疏松的威胁。中国卫生部2002年至2005年的调查结果显示，骨质疏松症患病率为8.8％，名列中国居民慢性病患病率的第三位。
[0004] 乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)已经有报道有各种健康功效如免疫调节和肠道健康等，并已广泛应用于发酵乳、风味发酵乳、乳饮料等发酵乳制品中。
[0005] 然而，经查，鲜有关于乳双歧杆菌用于治疗和/或预防骨质疏松的技术报道。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种具有治疗和/或预防骨质疏松功效的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，并据此提供了一种含有所述乳双歧杆菌或其活性物质的发酵乳制品。
[0007] 一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，本发明的乳双歧杆菌单菌即能用于治疗或预防骨质疏松，并具有提高血液的钙离子和/或磷离子等功效。不抗酸、不耐受胃肠液是双歧杆菌属的普遍性能，这将导致双歧杆菌很难通过胃液到达肠道并在肠道中定殖。而本发明提供的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，其具有耐胃酸和耐肠液性能，在pH2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上；在pH6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。
[0008] 本发明中将所提供的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)命名为BL-99。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)；保藏编号为CGMCC No.15650。
[0009] 本发明的研究发现，本发明的乳双歧杆菌BL-99(即保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌)可以用于治疗或预防骨质疏松，并具有提高血液的钙离子和/或磷离子浓度，具体包括：显著降低雌激素缺乏引起的骨量的丢失；提升血钙和血磷浓度；通过调节OPG/RANKL的比例，来抑制体内破骨细胞的数量，抑制其对骨的吸收作用；通过促进骨合成代谢相关因子基因的表达蛋白，如碱性磷酸酶和骨钙素的表达，提高其蛋白的水平从而来促进新骨的形成。
[0010] 本发明的研究还发现，本发明的乳双歧杆菌BL-99可以用于增强机体的免疫反映，具体包括：能够提高小鼠碳廓清指数；提高小鼠半数溶血值；提高小鼠抗体生成细胞数；激活NK细胞活性；迟发性免疫反应阳性；巨噬细胞吞噬率与吞噬指数增加。
[0011] 本发明的研究还发现，本发明的乳双歧杆菌BL-99具有促进肠道双歧杆菌和乳酸菌增长的能力，能够抑制肠道中脱硫弧菌和/或肠杆菌属的生长，特别是可抑制幽门螺旋杆菌和/或埃希氏菌-志贺菌属的生长。并且，研究表明，BL-99死菌对致病菌例如幽门螺旋杆菌、埃希氏菌-志贺菌属的抑制效果优于活菌。此外，小鼠实验表明该菌株无口服急性毒性，无抗生素耐受，安全可以用于食品加工。
[0012] 本发明的乳双歧杆菌BL-99，其可在领域中常用的乳双歧杆菌培养基(例如TPY培养基、BBL培养基等)中厌氧发酵培养。最佳发酵温度35～38℃，最佳发酵时间7～24h。本发明同时提供了一种乳双歧杆菌BL-99菌发酵培养产物的制作方法，其是将所述的菌株在液态发酵培养基中厌氧培养，获得包含菌体的发酵液。发酵液可直接或进一步浓缩后作为液态菌制剂，也可将发酵液干燥后制备菌粉，或是从发酵液中分离出菌体制备菌粉。本发明的液态菌制剂也可以是将菌体重悬于培养液、缓冲液或去离子水等溶剂后的液态制剂。本发明的BL-99液态菌制剂或固态菌制剂(菌粉)可以以活菌形式保存，在保藏期具有较好的稳定性。本发明的BL-99液态菌制剂或固态菌制剂(菌粉)也可以以灭活的死菌形式保存。所述的菌制剂可以用于制备本发明的发酵乳制品。
[0013] 进一步，本发明提供了一种发酵乳制品，其包含保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。
[0014] 根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品，其可以为活菌型或灭菌型的发酵乳、风味发酵乳或发酵乳饮料。
[0015] 根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品中，所述保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以活性菌或灭活形式存在于发酵乳制品中。
[0016] 本发明的活菌型的发酵乳、风味发酵乳或发酵乳饮料，可以是以包括保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌的发酵剂菌种发酵而制成，也可以是将保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌添加到发酵后的乳基料中而制成。
[0017] 本发明的灭菌型的发酵乳、风味发酵乳或发酵乳饮料，可以是以包括保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌的发酵剂菌种发酵后灭菌而制成，也可以是将保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌添加到发酵后的乳基料中、再经灭菌而制成，或者也可以是将灭菌后的保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌添加到灭菌后的发酵乳基料中而制成。
[0018] 本发明的发酵乳、风味发酵乳或发酵乳饮料的具体原料组成及制备方法可以参照现有技术中的发酵乳、风味发酵乳或发酵乳饮料的操作进行。
[0019] 根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品中，所述保藏编号CGMCC 3 10
No.15650的乳双歧杆菌在发酵乳制品中的含量为1.0×10 CFU/mL～1.0×10 CFU/mL；或者，以发酵乳制品的总重量为100％计，保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以菌体的重量计为0.001μg/mL～100mg/mL，优选为0.01μg/mL～100mg/mL，更优选为0.01μg/mL～10mg/mL。以CFU计的乳双歧杆菌含量优选适用于保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以活性菌形式存在的发酵乳制品。以菌体的重量计的乳双歧杆菌含量优选适用于保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以灭活形式存在的发酵乳制品。
No.15650的乳双歧杆菌在发酵乳制品中的含量为1.0×10 CFU/mL～1.0×10 CFU/mL；或者，以发酵乳制品的总重量为100％计，保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以菌体的重量计为0.001μg/mL～100mg/mL，优选为0.01μg/mL～100mg/mL，更优选为0.01μg/mL～10mg/mL。以CFU计的乳双歧杆菌含量优选适用于保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以活性菌形式存在的发酵乳制品。以菌体的重量计的乳双歧杆菌含量优选适用于保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以灭活形式存在的发酵乳制品。
[0020] 根据本发明的一些具体实施方案，本发明的发酵乳制品是以生鲜乳或复原乳为原料，添加或不添加其它原料，经杀菌、接种包括保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌的发酵剂菌种发酵而制成的。
[0021] 在本发明的一些更具体实施方案中，所述发酵剂菌种为保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌。即，所述发酵乳制品是以保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌单菌发酵制备而成。单菌发酵的工艺条件为：最佳发酵温度35～38℃，最佳发酵时间7～24h。
[0022] 在本发明的另一些更具体实施方案中，所述发酵剂菌种包括保藏编号CGMCCNo.15650的乳双歧杆菌，还包括嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的混合菌种，通常情况下嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的活菌数比例为1:1～1:2。即，所述发酵乳制品是以包括保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌的复合菌发酵制备而成。更进一步地，所述发酵剂菌种还可以包括嗜酸乳杆菌、其它乳双歧杆菌(除本发明的保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌以外的乳双歧杆菌)、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。根据本发明的优选实施方案，在复合菌发酵时，保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌的用量(以乳双歧杆菌菌体质量计)不超过发酵乳制品总重量的0.5‰。其他菌种的用量及复配比例、以及发酵工艺条件可以参照所属领域的常规操作进行。在包含嗜热链球菌的复配菌发酵时，优选的发酵工艺条件为：发酵温度40～43℃，发酵时间3～12h。
[0023] 本发明的发酵乳制品，因包含所述的乳双歧杆菌BL-99而具有相应的防治骨质疏松、调节胃肠道菌群平衡、提高免疫力等功效。
[0024] 从而，另一方面，本发明还提供了保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌在制备具有预防骨质疏松功效的发酵乳制品中的应用。
[0025] 另一方面，本发明还提供了保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌在制备具有调节胃肠道菌群平衡功效的发酵乳制品中的应用。
[0026] 另一方面，本发明还提供了保藏编号CGMCC No.15650的乳双歧杆菌在制备具有提高免疫力功效的发酵乳制品中的应用。
[0028] 图1A显示乳双歧杆菌BL-99干预前后动物的体重变化。图1B显示乳双歧杆菌BL-99干预前后动物子宫重量变化。
[0030] 图3A显示乳双歧杆菌BL-99干预后胫骨TRAP染色结果。图3B显示乳双歧杆菌BL-99干预前后破骨细胞占骨表面百分比(OcS/BS)的变化。
[0031] 图4A-图4D分别显示乳双歧杆菌BL-99干预后血钙、血磷、血清骨钙素、I-型胶原C端肽变化。
[0032] 图5A-图5E显示乳双歧杆菌BL-99干预对调节骨代谢相关基因的影响。
[0033] 图6为本发明一具体实施例中的发酵工艺流程示意图。
[0035] 本发明的乳双歧杆菌BL-99：
[0036] 保藏日期：2018年04月26日；
[0037] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
[0038] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所[0039] 保藏编号：CGMCC No.15650；
[0040] 分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。
具体实施方式
[0041] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0042] 除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非另有说明，本发明中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。
[0043] 本发明的各实施例中，实验数据表示为Mean±S.E.M.数据采用PRISM version 5.0(GraphPad,San Diego,CA,USA)进行统计。组间差异采用one-way ANOVA跟随Tukery’s multiple comparison test的方法进行统计。P<0.05时具有显著的统计学差异。
[0044] 实施例1：乳双歧杆菌BL-99及其性能测定
[0045] 本发明的乳双歧杆菌BL-99，来自上海交大昂立股份有限公司，是自婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)；保藏编号为CGMCC No.15650。
[0046] 1.乳双歧杆菌BL-99的分类学特征
[0047] 理化试验结果:
[0048]
[0049] 16S rRNA基因序列测序结果(SEQ ID No.1)：
[0050] GCTCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACT
[0051] 2.乳双歧杆菌BL-99的人工胃液、肠液耐受性
[0052] 双歧杆菌为通常不抗酸的菌属。本实施例中，测试了本发明的乳双歧杆菌BL-99的人工胃液、肠液耐受性，同时以目前领域中公认耐酸性能极好、可以通过胃肠道存活的乳双歧杆菌 作为对比。
[0053] 测试方法：将乳双歧杆菌BL-99菌株于MRS液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。
[0054] 将待测菌株分别在人工胃液、人工小肠液中培养，37℃处理0、30min、2h后进行活菌计数分析，以存活率评价菌株的耐酸及耐肠液性能。存活率＝(处理后的活菌数/0时刻活菌数)×100％。
[0055] 菌株在人工胃酸(pH2.5)中的存活率检测结果如表1所示，BB-12在人工胃酸(pH2.5)中处理30min时活菌存活率7.04％，处理2小时活菌存活率仅1.64％；而本发明的乳双歧杆菌BL-99在人工胃酸(pH2.5)中处理30min时活菌存活率62.60％，处理2小时活菌存活率61.83％。表明本发明的乳双歧杆菌BL-99具有优异的耐胃酸能力，能较为顺利地通过胃到达肠道发挥益生作用。
[0056] 表1、菌株在人工胃酸(pH2.5)中的存活率
[0057]
[0058] 菌株在人工小肠液(pH6.8)中的存活率检测结果参见表2。数据显示，BB-12在人工小肠液(pH6.8)中处理2小时活菌存活率仅28.95％；而本发明的乳双歧杆菌BL-99在人工胃酸(pH2.5)中处理2小时活菌存活率70.23％。表明本发明的乳双歧杆菌BL-99具有优异的耐肠液能力，可以在肠道内存活并定殖。
[0059] 表2、菌株在人工小肠液(pH6.8)中的存活率
[0060]
[0061] 3.乳双歧杆菌BL-99的的毒力实验及安全性检测
[0062] 将本发明的乳双歧杆菌BL-99接种于BBL液体培养基中，36±1℃厌氧培养48±2小时，计数培养液中乳双歧杆菌BL-99活菌数为3.7×108cfu/mL，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0mL/kg BW给受试小鼠连续灌胃3天，观察7天。试验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。试验结果表明：乳双歧杆菌BL-99的BBL培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的影响无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。
[0063] 采用SN/T 1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定》方法，评估乳双歧杆菌BL-99的抗生素敏感性能。评价结果显示，乳双歧杆菌BL-99对氨苄西林Ampicillin、青霉素G PenicillinG、红霉素Erythromycin、氯霉素Chloramphenicol、克林霉素Clindamycin、万古霉素Vancomycin和四环素Tetracycline等敏感。符合欧洲食品安全委员会(European Food Safety Authority)对食用细菌耐药性评价规范中的要求。乳双歧杆菌BL-99不含外源抗生素耐药基因，食用安全。
[0064] 4.防治骨质疏松功效检测
[0065] 4.1去卵巢大鼠动物模型和益生菌干预
[0066] 将乳双歧杆菌BL-99菌株于MRS液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后冷冻干燥，-18℃以下保存。用于防治骨质疏松功效检测的实验研究。
[0067] 17周龄雌性成年SD大鼠85只，体重200-300g。大鼠随机分成3组，每组10只。20只大鼠进行去卵巢手术，剩余10只大鼠进行假手术。大鼠每天12h光照/黑暗，室温在25℃左右，自由饮水。术干预12周后，处死模型考察组动物，收集子宫、股骨、胫骨等样品，并测定子宫系数、骨微观结构形态、骨结构模型参数等骨质疏松相关指标。
[0069] 动物具体分组情况如下：
[0070] 组1-假手术空白对照组(假手术)，10只，空白溶剂；
[0071] 组2-去卵巢空白对照组(OVX)，10只，空白溶剂；
[0072] 组3-去卵巢+益生菌BL-99组，10只，益生菌剂量109CFU/mL。
[0073] 动物在干预前后的体重变化见图1A。模型建立成功后，假手术假手术组的体重明显低于其他各去卵巢组，这与绝经后女性的体重明显增加相一致。各干预组在12周干预期间体重都有了一定程度的增加。去卵巢空白组与去卵巢+益生菌BL-99干预组比较体重在干预前后无显著差异。
[0074] 12周干预后，处死动物，收集、称量并记录子宫的重量，计算子宫系数(即子宫重量与体重的比值)。实验结果(图1B)显示，去卵巢OVX组与假手术假手术组的子宫系数有极其显著的差异(P<0.001vs.假手术)，说明去卵巢后，随着体内雌激素的减少，子宫显著的萎缩。而去卵巢空白组和去卵巢+益生菌BL-99干预组对子宫的重量均无影响，说明其无雌激素样副作用。
[0075] 4.2骨组织形态计量学测定
[0076] 取左侧胫骨近端1/3处，沿矢状面纵向切开，取材约1×0.5×0.5cm3，在脱钙液10％EDTA/PBS(PH7.4)中浸泡至完全脱钙，约1周左右，每3天换液一次，然后常规脱水，石蜡包埋，沿矢状面(厚度4μm)，HE染色，用病理图像分析仪可测定总组织面积、骨小梁面积、骨小梁总周长，再用计算公式换算出骨小梁面积百分率、骨小梁数目、骨小梁厚度和骨小梁分离度。骨组织切片还观察骨小梁外观、排列及形态结构完整性等情况.
[0077] 益生菌BL-99干预12周以后，HE染色结果(图2A)，假手术组骨小梁排列紧密,结构完整；而OVX空白组骨小梁排列松散稀疏，结构不完整，与假手术组比，骨小梁面积百分比显著减低(P<0.001vs.假手术)。而与OVX空白组相比较，益生菌BL-99组能增加骨小梁面积百分比约12.5％(OVX：16.8±2.5％，OVX+BL-99:18.9±1.8)(P<0.05vs.OVX)(图2B)，提示益生菌BL-99能抑制由雌激素缺乏导致的骨丢失，对骨有一定的保护作用。
[0078] 破骨细胞是体内负责骨吸收的主要细胞，在骨发育、生长、修复、重建中具有重要的作用。破骨细胞来源于单核－巨噬细胞系统，是一种特殊的终末分化细胞，它可由其单核前体细胞通过细胞融合形成巨大的多核细胞。破骨细胞与成骨细胞在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)是破骨细胞主要标志之一。胫骨TRAP染色结果如图3A所示，染色阳性结果为定位于破骨细胞胞浆被染成酒红色。OVX空白组的大鼠胫骨表面TRAP染色的破骨细胞数目显著高于假手术组大鼠。与OVX空白组大鼠相比较，益生菌BL-99组TRAP染色破骨细胞的数量出现显著降低约17.9％(OVX：22.3±1.1％，OVX+BL-99:18.3±0.6)(P<0.05vs.OVX)。在体内雌激素能抑制破骨细胞的活性，同时诱导破骨细胞的凋亡进而发挥抗骨吸收作。在OVX的动物中，由于雌激素的水平明显低下，导致其对破骨细胞的抑制作用缺失，破骨细胞的数量和骨吸收的能力明显增加(图3B)，最终的后果就是松质骨骨量的明显减少。而从图2A、图2B和图3A、图3B的结果提示BL-99干预能抑制OVX引起的骨量的丢失，可能是通过减少破骨细胞的数量。
[0079] 4.3生化指标的测定
[0080] 测定的生化指标包括血钙、血磷、血清骨钙素(Osteocalcin,OCN)、I-型胶原C端肽(C-terminal telopeptides of type I collagen,CTX-I)。采用原子吸收分光光度法测定血钙、血磷，血清样品直接测定。检测所用试剂盒包括：Calcium Test(REF 0155-225)，Phosphorus Test(REF 0830-125)，生产商均为Stanbio
Laboratory(NorthMainBoerne,FX,USA)如图4A-图4D所示，与假手术组对比，OVX空白组的血钙和血磷水平降低，虽然血钙的降低没有统计学意义。但与OVX空白组相比较，益生菌BL-
99干预组能显著提升高血清钙离子(OVX：2.28±0.02mg/dl，OVX+BL-99:2.49±0.03mg/dl)，升高约10％，和磷离子(OVX：1.02±0.08mg/dl，OVX+BL-99:1.41±0.11mg/dl)，升高约
40％。
Laboratory(NorthMainBoerne,FX,USA)如图4A-图4D所示，与假手术组对比，OVX空白组的血钙和血磷水平降低，虽然血钙的降低没有统计学意义。但与OVX空白组相比较，益生菌BL-
99干预组能显著提升高血清钙离子(OVX：2.28±0.02mg/dl，OVX+BL-99:2.49±0.03mg/dl)，升高约10％，和磷离子(OVX：1.02±0.08mg/dl，OVX+BL-99:1.41±0.11mg/dl)，升高约
40％。
[0081] 血清骨钙素是由成骨细胞分泌的一种活性多肽，在调节骨代谢中起重要的作用，其水平反映成骨细胞活性。I型胶原C端肽是I型胶原降解后的小片段，其含量和变化可评价骨吸收状态。血清骨钙素和I型胶原C末端肽采用ELASA试剂盒测定，测定方法按照试剂盒中说明书进行。检测所用试剂盒如下：Rat Osteocalcin ELISA Kit，Rat C-telopeptide of Collagen alpha-1(I)chain ELISA Kit，生产商均为SAB(SABiosciences,USA)。
[0082] 如图4A-图4D所示与OVX空白组相比较，益生菌BL-99干预组能显著提升血清骨钙素的水平约44.6％(OVX：68.6±16.4pg/dl，OVX+BL-99:92.6±24.3pg/dl)，降低血清I-型胶原C端肽约14.6％，但没有统计学的意义。
[0083] 4.4骨标本PCR的检测
[0084] 本实施例继续研究和检测骨标本中与破骨细胞形成和成骨细胞形成相关的基因表达。益生菌BL-99干预方式同前。骨组织利用Trizol提取总RNA后，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，之后用不同基因引物(如下表)进行PCR扩增。
[0085]
[0086] 与OVX空白对照组相比，益生菌BL-99干预组能显著提升骨保护素(OPG)的基因表达，而对RANKL的基因表达没有显著的影响，从而挺高了OPG/RANKL的比值。RANKL与破骨细胞表面上的RANK受体结合，促进破骨细胞的分化和激活，并抑制其凋亡；骨保护素OPG阻止RANKL与RANK的结合，从而阻止破骨细胞的激活，抑制破骨细胞的功能，减少骨吸收，起负调节作用。OPG/RANKL的比值提示体内调控破骨细胞的水平。本研究发现BL-99干预后OPG/RANKL基因表达比值升高，从去卵巢空白组的1到1.75，提升比值约75％，此结果提示BL-99有明显的抑制破骨细胞形成的作用。另外，如图5A-图5E所示：与OVX空白组比较，BL-99干预组可以提高骨钙素约1.1倍(OVX：0.908±0.107，OVX+BL-99：2.075±0.643)和碱性磷酸酶约37.8％(OVX：0.990±0.217，OVX+BL-99：1.364±0.513)的基因表达水平，这两个基因的表达水品与骨形成的能力密切相关，因此BL-99干预可通过促进成骨的相关基因的表达，来促进新骨的形成而拮抗OVX引起的骨量的丢失。
[0087] 以上研究结果证实：本发明的乳双歧杆菌BL-99能显著抑制去卵巢或雌激素低下导致的骨量的丢失，提升血钙和血磷。
[0088] 5.免疫调节活性分析
[0089] 将乳双歧杆菌BL-99菌株于MRS液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后冷冻干燥，-18℃以下保存。用于本实施例的各项实验研究。
[0090] 健康雄性BALB/C小鼠700只，6-8周龄，16-18g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。饲养于中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所动物实验室：维持室温(25±2℃)，相对湿度(55±2)％，12h/12h光照，自由进食和饮水。
[0091] 动物随机分为5个大组，分别用于本实施例的各项试验研究，每个大组140只小鼠，每个大组中设立1个正常对照组，每种益生菌样品设立1个剂量组。
[0092] 以灌胃的方式给予小鼠受试样品28天，每天灌胃一次，灌胃体积为0.2mL/10g，对照组灌胃给予蒸馏水。
[0093] 依据益生菌样品信息，参考每日人体需求量及70Kg成人与20g小鼠使用剂量的换算系数，计算出需给予小鼠的各受试样品的剂量，BB-12组的剂量为2.36mg/kg，BL-99组的剂量为6.34mg/kg。
[0094] 5.1单核-巨噬细胞功能
[0095] 5.1.1碳廓清实验
[0096] 动物连续给样28天，称体重，尾静脉注射印度墨汁，注入墨汁后第2min及第10min，取血20μL，加入2M的l0.1％碳酸钠溶液中，600nm处测定OD值。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。
[0097] 以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力，按照公式进行计算
[0098]
[0099]
[0100] 碳廓清实验的吞噬指数结果见表3。结果显示，BL-99组低于对照组，BB-12的小鼠碳廓清实验的吞噬指数与对照组相比无显著差异(p＞0.05)。
[0101] 表3、碳廓清实验中吞噬指数结果
[0102]组次 动物数(只) 吞噬指数 与对照组相比较的p值
对照 8 7.64±0.62 --
BB-12组 8 7.56±0.61 0.902
BL-99组 9 6.43±0.55 0.039*
对照 8 7.64±0.62 --
BB-12组 8 7.56±0.61 0.902
BL-99组 9 6.43±0.55 0.039*
[0103] 5.1.2脏器、体重比值测定
[0104] 将小鼠初始体重和给样28天后称重分别作为初始体重和终体重，小鼠脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏、体重比值和胸腺、体重比值。
[0105] 结果见表4。给予受试样品后，与对照组相比，BL-99与BB-12组脾脏/体重比值、胸腺/体重比值与对照组均无显著性差异，说明样品BL-99与BB-12对小鼠脾脏/胸腺未造成影响。
[0106] 表4、小鼠脏器/体重比值变化
[0107]
[0108] 5.2体液免疫实验
[0109] 5.2.1血清溶血素半数溶血值(HC50)的测定
[0110] 动物连续给样28天后，经腹腔对每只小鼠注射SRBC 0.2mL进行免疫。4天后，摘除眼球取血于1.5mL离心管内，4℃放置约1h，使血清充分析出，2000r/min离心10min收集血清。取血清用SA缓冲液稀释100倍。将稀释后的血清加入96孔板，每孔100μL，再依次加入10％(v/v)SRBC50μL，补体100μL(用SA溶液按1:8稀释)，置37℃恒温水浴中保温30min，
1500r/min离心10min。然后样品孔和空白对照孔各取上清液50μL，加入另一个96孔培养板内，加文奇氏试剂150μL，同时设半数溶血孔，加入10％(v/v)SRBC12.5μL，再加文奇氏试剂至200μL，用震荡期充分混匀，放置10min后，与540处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。
1500r/min离心10min。然后样品孔和空白对照孔各取上清液50μL，加入另一个96孔培养板内，加文奇氏试剂150μL，同时设半数溶血孔，加入10％(v/v)SRBC12.5μL，再加文奇氏试剂至200μL，用震荡期充分混匀，放置10min后，与540处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。
[0111] 溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按以下公式计算：
[0112]
[0113] 结果见表5。从表5可以看出，与对照组相比，BL-99与BB-12组半数溶血值HC50均有升高(p＜0.05)，且BL-99组高于BB-12组。
[0114] 表5、半数溶血值HC50结果
[0115]组别 动物数(只) HC50 p值
对照 14 51.07±2.17 --
BB-12组 14 66.31±3.66 0.000**
BL-99组 14 67.43±4.04 0.000**
对照 14 51.07±2.17 --
BB-12组 14 66.31±3.66 0.000**
BL-99组 14 67.43±4.04 0.000**
[0116] 5.2.2抗体生成细胞检测实验
[0117] 经过绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑，溶血空斑数可反映抗体生成细胞数。
[0118] 动物连续给样28天后，经腹腔对每只小鼠注射SRBC 0.2mL进行免疫。将SRBC免疫4天后的小鼠处死，取脾，制成5×106个细胞/mL的细胞悬液。将琼脂糖加热溶解后，与等量双倍的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加20％(V/V，用生理盐水配置)压积SRBC50μL，脾细胞悬液200μL，迅速混匀，倾倒至已刷琼脂糖薄层的六孔板上，带琼脂凝固后，放入二氧化碳培养箱中继续孵育1h，然后加入SA缓冲液稀释的补体(1:10)，继续孵育2h，计数溶血空斑数。
[0119] 抗体生成细胞数结果如表6所示，样品组与对照组相比，BL-99与BB-12组显著高于对照组(p＜0.05)，且BL-99组与对照组相比呈现出显著性差异(p＞0.05)。
[0120] 表6、抗体生成细胞数结果
[0121]组别 动物数(只) 溶血空斑数/106脾细胞 p值
对照 11 18.64±1.91 --
BB-12组 10 23.30±3.13 0.003**
BL-99组 9 28.67±2.87 0.000**
对照 11 18.64±1.91 --
BB-12组 10 23.30±3.13 0.003**
BL-99组 9 28.67±2.87 0.000**
[0122] 5.3NK细胞活性试验
[0123] 5.3.1ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验
[0124] 动物连续给样28天后，将小鼠处死，在75％酒精的烧杯中消毒后，无菌取脾，置于装有3cm×3cm四层纱布(高压灭菌)的小平皿中，加入适量无菌Hank’s液，用纱布将脾宝珠，用弯头蹑轻轻地将脾磨碎，制成单细胞悬液，用Hank’s液洗2次，每次1000rpm离心10min，然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，计数活细胞数，调整细胞浓度为5×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养办中，每孔1mL，在其中一孔加入75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置于5％CO2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装2孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增值能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
[0125] 结果见表7。由表7可以得出，与对照组相比，BB-12组显著高于对照组(p＜0.05)，而BL-99与对照组相比无显著性变化(p＞0.05)。
[0126] 表7、小鼠脾淋巴细胞转化实验结果
[0127]
[0128] 5.3.2NK细胞活性测定
[0129] 动物连续给样28天，开始实验前24h将靶细胞YAC-1进行传代培养，用前以Hank’s5
液洗2次，用含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×10 个/mL(靶细胞)。小鼠颈椎脱臼猝死，无菌取脾，制成皮细胞悬液，用Hank’s液洗2次，1000rpm离心
10min，再用2mL含10％含小牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬，用台盼蓝活细胞染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为1×107个/mL(效应细胞)，使效靶比为100:1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL，上述均设三个平行孔。37℃，5％CO2培养箱中培养4h，将96孔培养板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，然后每孔加入1mol/L的HCL溶液30μL终止反应，在酶标仪490nm处测OD值，NK活性按下式计算：
液洗2次，用含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×10 个/mL(靶细胞)。小鼠颈椎脱臼猝死，无菌取脾，制成皮细胞悬液，用Hank’s液洗2次，1000rpm离心
10min，再用2mL含10％含小牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬，用台盼蓝活细胞染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为1×107个/mL(效应细胞)，使效靶比为100:1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL，上述均设三个平行孔。37℃，5％CO2培养箱中培养4h，将96孔培养板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，然后每孔加入1mol/L的HCL溶液30μL终止反应，在酶标仪490nm处测OD值，NK活性按下式计算：
[0130]
[0131] 结果见表8。从表8可以看出，BL-99的NK细胞活性高于对照组与BB-12，且差异具有显著性。
[0132] 表8、NK细胞活性结果
[0133]组别 动物数(只) 细胞活性(％) P值
对照 14 30.70±3.31 --
BB-12组 14 33.38±4.17 0.078
BL-99组 14 47.92±5.63 0.000**
对照 14 30.70±3.31 --
BB-12组 14 33.38±4.17 0.078
BL-99组 14 47.92±5.63 0.000**
[0134] 5.4细胞免疫反应
[0135] 5.4.1迟发型变态反应
[0136] 动物连续给样28天后，每鼠腹腔注射2％压积SRBC(v/v，用生理盐水配制)SRBC 0.2mL，致敏4天后，测量左后足趾部厚度，同一部位测量3次，取平均值。然后在测量部位皮下注射20％SRBC 20μL，注射后于24h测量左后足趾部厚度，同一部位测量3次取平均值，以攻击前后足趾厚度的差值(足趾肿胀度)来表示DTH的程度。
[0137] 结果见表9。从表9可以看出，SRBC攻击前，各组小鼠的足趾厚度均处于同一水平，SRBC共计24h后，小鼠足趾部出现肿胀，肿胀度使用攻击前后足趾部厚度差值表示。通过统计分析发现，与对照组相比，BB-12与BL-99组显著高于对照组(p＜0.05)。
[0138] 表9、小鼠迟发型变态反应足趾肿胀结果
[0139]
[0140] 5.4.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验
[0141] 动物连续给样28天后，灌胃结束前4天给每只小鼠腹腔注射0.2mL 2％SRBC激活小鼠巨噬细胞，实验当天用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液3mL/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔洗液0.5mL混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱内37℃孵育15-20min。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲净，于甲醇液中固定1min，Giemsa染色15min。用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40×显微镜计数吞噬率和吞噬指数。吞噬率为每100个吞噬细胞中，吞噬鸡红细胞的吞噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个吞噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。
[0142] 结果按下式计算：
[0143]
[0144]
[0145] 结果见表10。从吞噬细胞吞噬率和吞噬指数结果可以得出，BB-12组吞噬率和吞噬指数与对照组相比无差异，则BB-12组巨噬细胞吞噬实验结果阴性；BL-99组吞噬率和吞噬指数均高于对照组，则BL-99组巨噬细胞吞噬实验结果阳性。
[0146] 表10、巨噬细胞吞噬率及吞噬指数结果
[0147]组别 动物数(只) 吞噬率(％) p值 吞噬指数 p值
对照 14 22.55±1.58 -- 0.42±0.04 --
BB-12组 14 22.28±2.75 0.799 0.47±0.04 0.055
BL-99组 14 25.48±2.86 0.005** 0.53±0.04 0.000**
对照 14 22.55±1.58 -- 0.42±0.04 --
BB-12组 14 22.28±2.75 0.799 0.47±0.04 0.055
BL-99组 14 25.48±2.86 0.005** 0.53±0.04 0.000**
[0148] 以上结果证实，本发明的分离菌株乳双歧杆菌BL-99能够提高机体的免疫脏器指数、非特异性免疫功能和特异性免疫功能特性，从而达到提高机体免疫里的活性。
[0149] 6.肠道菌群调节效果
[0150] 本研究中，分别检测了不同剂量活性乳双歧杆菌BL-99及灭活菌种的肠道菌群调节效果。
[0151] 活菌样品：依据样品规格，称取1g活菌样品，使用PBS溶液悬浮至40ml，即活菌浓度均为2.5x109CFU/ml。
[0152] 高剂量组：按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，高剂量组小鼠灌胃剂量为109CFU/20g。
[0153] 中剂量组：分别取5ml高剂量悬浮液加入PBS定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，中剂量组小鼠灌胃剂量为108CFU/20g。
[0154] 低剂量组：分别取5ml中剂量组悬浮液加入PBS定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌7
胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，低剂量组小鼠灌胃剂量为10CFU/20g。
胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，低剂量组小鼠灌胃剂量为10CFU/20g。
[0155] 死菌样品：依据样品规格，称取1g活菌样品，使用PBS溶液悬浮至40ml，即活菌浓度为2.5x109CFU/ml。将浓度为2.5x109CFU/ml的活菌样品菌液100℃热杀死20min。其高、中、低剂量组样品配置方法与上述活菌组相同。
[0156] 6周龄BABL/c小鼠饲养于清洁级动物房，温度22℃，湿度10-60％，12小时明暗交替照明，标准饲料喂养，自由饮水。适应性喂养5天，182只小鼠随机分为13组，每组14只，分组情况见表11。
[0157] 表11、调节肠道菌群实验分组
[0158]
[0159] 开始灌胃前，无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。实验按照0.2ml/10g灌胃量给予各受试物，对照组1-14天给予PBS，实验组分别依据表11灌胃给予相应剂量的受试物。小鼠每周称重一次，根据体重调整灌胃量。14天后无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。
[0160] 实验前后，各组小鼠体重无显著差异。在门的水平，补充不同剂量的益生菌后，小鼠肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度增加而拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)相对丰度降低。研究表明，厚壁菌门与拟杆菌门的比值与人体肠道疾病具有较强的相关性，肥胖病人倾向于二者比值降低。而肠炎、肠应激综合症患者则倾向于具有较高的变形菌门(Proteobacteria)丰度。
[0161] BL-99在属的水平对肠道菌群的影响参见表12。
[0162] 表12、BL-99对肠道菌群的影响
[0163]
[0164] 在属的水平，控制组相比，益生菌组小鼠肠道菌群中BL-99可显著增加小鼠肠道中的乳酸杆菌属(Lactobacillus)相对丰度，且BL-99低剂量组对乳酸杆菌(Lactobacillus)的增加程度最为显著。而BL-99死菌高剂量组对脱硫弧菌(Desulfovibrio)、肠杆菌属(Enterorhabdus)具有显著抑制作用。
[0165] BL-99对致病菌幽门螺杆菌、埃希氏菌-志贺氏菌属的抑制效果参见表13。
[0166] 表13、BL-99对致病菌的抑制效果
[0167]
[0168] 对致病菌进行分析，结果同样表明，BL-99低剂量组对幽门螺旋杆菌(Helicobacter)具有显著抑制作用，所有组别均对埃希氏菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)具有抑菌作用，且死菌效果更优。
[0169] 上述实验表明，补充低剂量组的BL-99即可以调节肠道菌群平衡，促进有益菌生长，抑制有害菌甚至是致病菌，且死菌同样有效，表明补充低剂量组的BL-99或BL-99死菌既可以起到潜在的健康的功效。
[0170] 实施例2：含乳双歧杆菌BL-99的发酵剂发酵制备的乳制品
[0171] 乳双歧杆菌单菌发酵剂的制备：参照图6所示的发酵工艺流程，将乳双歧杆菌BL-99(即保藏编号为CGMCC No.15650的乳双歧杆菌)在TPY液体培养基中进行厌氧培养。TPY液体培养基(g/L)：水解酪蛋白10.0，大豆胨5.0，酵母粉2.0，葡萄糖5.0，L-半胱氨酸0.5，磷酸氢二钾2.0，氯化镁0.5，硫酸锌0.25，氯化钙0.15，氯化铁0.0001，吐温80 1.0，pH值6.5±
0.1。经一级、二级并扩大培养后的发酵液，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。所收集的菌体经冷冻干燥，得到BL-99活性菌粉作为单菌发酵剂，-18℃以下保存。
0.1。经一级、二级并扩大培养后的发酵液，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。所收集的菌体经冷冻干燥，得到BL-99活性菌粉作为单菌发酵剂，-18℃以下保存。
[0172] 以上述单菌发酵剂与商购益生菌发酵剂(含有嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的复配菌)按照以下所示不同比例复配，发酵牛奶制备酸奶。
[0173]
[0174] 酸奶配方：每1000g发酵底物中，商购全脂巴氏杀菌奶930g，白砂糖70g。发酵剂菌种适量。
[0175] 酸奶发酵工艺：全脂巴氏杀菌奶与白砂糖混料，均质后杀菌，冷却至37℃，接种发酵剂厌氧发酵，发酵结束后破乳停止发酵，制备得到酸奶。BL-99单菌发酵工艺：37℃发酵15小时。添加了商购发酵剂的发酵工艺：43℃发酵4.5小时。
[0176] 各酸奶样品在2～8℃冷藏储存，检测不同储存期内样品的pH值、酸度、总活菌数和双歧杆菌数量，测定结果如下：
[0177] pH值检测：
[0178]储存时间 1d 7d 14d 21d
明0 4.35 4.35 4.29 4.25
明1 4.36 4.28 4.25 4.22
明2 4.32 4.22 4.18 4.17
明3 4.63 4.48 4.37 4.47
明4 4.6 4.59 4.45 4.46
明0 4.35 4.35 4.29 4.25
明1 4.36 4.28 4.25 4.22
明2 4.32 4.22 4.18 4.17
明3 4.63 4.48 4.37 4.47
明4 4.6 4.59 4.45 4.46
[0179] 酸度0T检测：
[0180]储存时间 1d 7d 14d 21d
明0 76 78.8 79.5 81.3
明1 78.9 82.4 82.2 85.8
明2 79.2 83.5 85.5 88.5
明3 70.4 71.6 76.5 70.5
明4 75.1 74.1 78.4 76.1
明0 76 78.8 79.5 81.3
明1 78.9 82.4 82.2 85.8
明2 79.2 83.5 85.5 88.5
明3 70.4 71.6 76.5 70.5
明4 75.1 74.1 78.4 76.1
[0181] 总活菌数cfu/g检测：
[0182]储存时间 1d 7d 14d 21d
明0 7.9*108 1.5*109 1.2*109 1.2*109
明1 1.4*109 1.9*109 2.6*109 1.4*109
明2 1.5*109 1.8*109 2.0*109 1.7*109
明3 3.7*108 5.2*109 7.4*108 5.0*108
明4 1.3*109 1.8*109 1.7*109 1.7*109
明0 7.9*108 1.5*109 1.2*109 1.2*109
明1 1.4*109 1.9*109 2.6*109 1.4*109
明2 1.5*109 1.8*109 2.0*109 1.7*109
明3 3.7*108 5.2*109 7.4*108 5.0*108
明4 1.3*109 1.8*109 1.7*109 1.7*109
[0183] 双歧杆菌cfu/g检测：
[0184]
[0185] 此外，对上述各酸奶样品进行品评实验，明0、明1、明2、明3酸奶样品整体风味差异不大，所有酸奶样品的风味愉悦可接受。
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