一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法专利检索-滤纸饮料胶囊食品包装专利检索查询-专利查询网

一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法

阅读：503发布：2024-02-15

专利汇可以提供一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法，包括：培养液的制备、检测材料的准备、超高效液相色谱- 串联质谱检测、酶活性的分析四个步骤。在培养液中加入15N标记的茶氨酸合成底物(15N标记的盐酸乙胺)，通过超高效液相色谱-串联质谱检测反应产物中合成的茶氨酸含量，运用其中14N-茶氨酸与15N-茶氨酸的比例，来区分培养过程中合成的茶氨酸，以分析茶氨酸合成酶活性。本发明针对性强，方法简单，准确性强，灵敏度高，能够准确检测到茶氨酸合成酶反应产物；操作方便，检测方法精确，避免了以前茶氨酸合成酶检测过程中，其提取的粗酶液中含有的高含量茶氨酸本底，在酶活性较低，产物较少的情况下无法检测到酶活性。，下面是一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)培养液的制备
(1-1)培养液的制备
按照体积比为4:1的比例将30mmol/L KH2PO4溶液和30mmol/L K2HPO4溶液混合，调节混合溶液pH至5.6，得到K-Pi缓冲液，备用；
配制200mmol/L的蔗糖溶液，备用；
将K-Pi缓冲液和200mmol/L的蔗糖溶液按体积比19:1的比例混匀后灭菌，冷却后取
4ml加入40mg抗坏血酸钠盐，得到溶液A；
(1-2)稳定性同位素培养液的制备
15
在(1-1)步中制备的溶液A中加入300mmol/L N标记的盐酸乙胺；
(2)检测材料的准备
(2-1)植物材料的处理
取茶树组织，用70％酒精快速消毒，蒸馏水洗净，滤纸吸干，称重后切成约2mm×2mm的块状，在无菌操作台中，将已切成块状的茶树组织加入培养液中，28℃在摇床中培养12h，转速160rpm；
(2-2)培养后材料的处理
终止培养，取出培养液中的茶树材料，用蒸馏水冲洗吸干，加入液氮，快速研磨成粉末状，转移至离心管中，在-20℃下冷冻4h，再在冷冻干燥机中冷冻至足干，并留取其培养液待测；
(2-3)材料中茶氨酸的提取
取冻干后的粉末，转移至10ml离心管中，加入3ml沸水，100℃水浴20min后离心分离
15min取上清液，重复两次，定容至10ml；
将提取液和留取的培养液通过水相滤头过滤待测；
(3)材料中茶氨酸的超高效液相色谱–串联质谱分析
(3-1)标准曲线的制备
利用茶氨酸标品配制浓度分别为0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.01mg/mL，
0.001mg/mL，0.0001mg/mL，0.000001mg/mL的茶氨酸标准样品，将上述不同浓度的茶氨酸标准样品进行LC-MS/MS分析，以茶氨酸浓度为横坐标，以茶氨酸离子相对吸收峰值为纵坐标，求得标准曲线；
(3-2)将培养12h后的茶树组织提取液和培养液进行LC-MS/MS分析，根据标准曲线计
14 15
算培养12h后的茶树组织提取液和培养液中总茶氨酸的含量，N-茶氨酸的含量，N-茶氨酸的含量，计算茶氨酸合成酶活力。
2.根据权利要求1所述的快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法，其特征在于：步骤
15
(1-2)中所涉及的茶氨酸合成底物采用 N标记的盐酸乙胺，去除了样品本身所含茶氨酸的影响。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法，其特征在于：
14 15
步骤(3)中应用的LC-MS/MS检测手段能分离开 N、N标记的茶氨酸。

说明书全文

一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法，属于生物材料检测技术领域。

背景技术

[0002] 茶氨酸是茶树中一种比较特殊的存在一般植物中罕见的氨基酸，占茶叶干重1％-2％，从发现到现在为止，除了在一种蕈及茶梅中检出外，在其他植物中尚未发现。茶树中茶氨酸和代谢和氮代谢有较大的相关性，茶氨酸可能是茶树氮代谢的核心，在茶树代谢具有十分重要的生理意义。茶氨酸具有降压安神、缓解生理及心理紧张、抗肿瘤以及拮抗咖啡碱引起的神经系统兴奋等重要生理功能。也是决定茶叶饮料品质特征的重要因素之一，由此成为茶叶功能性成分开发利用的研究热点之一。

[0003] 茶树中与茶氨酸代谢直接相关的酶：催化L-谷氨酸和乙胺生成茶氨酸，即L-茶氨酸合成酶。经国内外研究人员研究表明该酶是茶树特有的合成酶，并有乙胺高亲合力。但是，因为茶树体内L-茶氨酸合成酶极不稳定，其分离纯化工作一直没有很大的进展。近些年，由于茶氨酸在茶树代谢中重要的作用以及其巨大的经济价值，L-茶氨酸合成酶在茶树体内的代谢机制引起了关注。

[0004] L-茶氨酸合成酶的酶活研究一般通过体外粗酶活的测定，及用底物谷氨酸、乙胺，加入提取的粗酶液经过反应后，检测产物中茶氨酸的含量。由于粗酶活实验要注意保证酶的活性，易受到酶提取率、底物浓度、产物浓度、PH的影响，并且由于该酶的不稳定性，以及粗酶液在提取过程中本身具有茶氨酸存在，因此在酶活性不稳定或者活性不高的情况下，在产物检测中要除去粗酶液本身含有的茶氨酸就变得比较困难。而同位素标记在近些年的药代动力学、物质在动植物体内的转运和代谢途径等研究中被广泛应用，由于其灵敏度高，定位定量准确，取得了很高的研究成果，由于放射性同位素危险较大，对实验条件和实验人员的素质要求很高，而稳定性同位素要求的实验室条件一般，且安全。

[0005] 本申请人首次利用直接培养活体茶树组织、稳定性同位素标记底物、超高效液相色谱和串联质谱技术，检测茶树中茶氨酸合成与代谢的情况，以此推断出茶氨酸合成酶的活性。

发明内容

[0006] 针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法，其特征在于包括以下操作步骤：

[0007] (1)培养液的制备

[0008] (1-1)培养液的制备

[0009] 按照体积比为4:1的比例将30mmol/L KH2PO4溶液和30mmol/L K2HPO4溶液混合，调节混合溶液pH至5.6，得到K-Pi缓冲液，备用；

[0010] 配制200mmol/L的蔗糖溶液，备用；

[0011] 将K-Pi缓冲液和200mmol/L的蔗糖溶液按体积比19:1的比例混匀后灭菌，冷却后取4ml加入40mg抗坏血酸钠盐，得到溶液A；

[0012] (1-2)稳定性同位素培养液的制备

[0013] 在(1-1)步中制备的溶液A中加入300mmol/L 15N标记的盐酸乙胺；

[0014] (2)检测材料的准备

[0015] (2-1)植物材料的处理

[0016] 取茶树组织，用70％酒精快速消毒，蒸馏水洗净，滤纸吸干，称重后切成约2mm×2mm的块状，在无菌操作台中，将已切成块状的茶树组织加入培养液中，28℃在摇床中培养12h，转速160rpm；

[0017] (2-2)培养后材料的处理

[0018] 终止培养，取出培养液中的茶树材料，用蒸馏水冲洗吸干，加入液氮，快速研磨成粉末状，转移至离心管中，在-20℃下冷冻4h，再在冷冻干燥机中冷冻至足干，并留取其培养液待测；

[0019] (2-3)材料中茶氨酸的提取

[0020] 取冻干后的粉末，转移至10ml离心管中，加入3ml沸水，100℃水浴20min后离心分离15min取上清液，重复两次，定容至10ml；

[0021] 将提取液和留取的培养液通过水相滤头过滤待测；

[0022] (3)材料中茶氨酸的超高效液相色谱–串联质谱分析

[0023] (3-1)标准曲线的制备

[0024] 利用茶氨酸标品配制浓度分别为0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.01mg/mL，0.001mg/mL，0.0001mg/mL，0.000001mg/mL的茶氨酸标准样品，将上述不同浓度的茶氨酸标准样品进行LC-MS/MS分析，以茶氨酸浓度为横坐标，以茶氨酸离子相对吸收峰值为纵坐标，求得标准曲线；

[0025] (3-2)将培养12h后的茶树组织提取液和培养液进行LC-MS/MS分析，根据标准14
曲线计算培养12h后的茶树组织提取液和培养液中总茶氨酸的含量，N-茶氨酸的含量，
15
N-茶氨酸的含量，计算茶氨酸合成酶活力。

[0026] 步骤(1-2)中所涉及的茶氨酸合成底物采用15N标记的盐酸乙胺，去除了样品本身所含茶氨酸的影响。

[0027] 步骤(3)中应用的LC-MS/MS检测手段能分离开14N、15N标记的茶氨酸。

[0028] 本发明的优点在于：

[0029] 1、该方法操作简单，不需要提取植物组织粗酶液，保证了酶的活性，避免了繁琐的实验操作；

[0030] 2、应用了稳定性同位素标记的方法，准确性强、灵敏度高，安全性高，能够准确检测到茶氨酸合成酶的反应产物，证明检测到茶树组织中茶氨酸合成酶酶活；

[0031] 3、超高效液相色谱和串联质谱的应用保证了方法的迅速、准确；

[0032] 4、快速检测茶氨酸合成酶活性检测方法的建立为后续茶氨酸合成酶在茶树体内茶氨酸代谢途径的功能、作用等研究奠定坚实的实验技术基础；开拓酶活研究新途径以及提高茶叶品质均具有重要理论价值。附图说明

[0033] 图1是14N-盐酸乙胺培养生成的茶氨酸质谱图

[0034] 图2是15N-盐酸乙胺培养生成的茶氨酸质谱图

[0035] 图3是14N-茶氨酸，母离子(175)、子离子(158)电子流图

[0036] 图4是14N-茶氨酸，子离子(158)电子流图

[0037] 图5是15N-茶氨酸，母离子(176)、子离子(159)电子流图

[0038] 图6是15N-茶氨酸，子离子(159)电子流图。

具体实施方式

[0039] 下面结合实施例对本发明作进一步地说明。

[0040] 一、主要设备：

[0041] 1.超高效液相色谱仪(UPLC)；2.三重四极杆串联质谱仪；3.恒温水浴锅；4.冷冻干燥机；5.离心机；6.pH计；7.恒温摇床；8.离心机。

[0042] 二、材料与试剂：

[0043] 1、被检测材料：活体茶树组织。

[0044] 2、主要试剂

[0045] (1)a溶液：称取磷酸氢二钾1.72g，溶解于1000mL的蒸馏水中，称取磷酸二氢钾4.08g，溶解于1000mL的蒸馏水中，以磷酸氢二钾:磷酸二氢钾＝4:1的体积比混匀，并调节PH至5.6，4℃以下保存备用。

[0046] (2)b溶液：称取蔗糖2.39g，溶解于1000mL的蒸馏水中，4℃以下保存备用。

[0047] (3)1％(质量/体积)抗坏血酸。

[0048] (4)300mmol/L盐酸乙胺，4℃以下保存备用。

[0049] (5)300mmol/L 15N标记的乙酸乙胺，4℃以下保存备用。

[0050] (6)0.17％乙酸溶液，吸取色谱级乙酸1.7ml定容至1000ml，4℃以下保存备用。

[0051] (7)100％纯乙腈，4℃以下保存备用。

[0052] 三、色谱质谱条件：

[0053] 1、色谱条件

[0054] Agilent6460型液相色谱系统；色谱柱：Waters C18柱，3.5μm，150mm×1.7mm；流动相：A：含体积百分比0.17％乙酸的水，B：乙腈；梯度条件为：0min，97％A，0-3min，80％A，3-12min，50％A，12-16min，97％A，柱温40℃，流速：0.2mL/min；进样量3μL；

[0055] 2、质谱条件

[0056] Agilent 6460型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和Qualitative[0057] B.04.00 数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；电喷雾电压为4500V；温度350℃；源内气体1：氮气压力40PSI；气体2：氮气压力60PSI；气帘气：氮气压力25PSI；扫描方式为多重反应监测；茶氨酸的多重反应监测设定值分别为，Q1：195，Q2：158；Q3：196，Q4：159。

[0058] 一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法，包括以下操作步骤：

[0059] (1)培养液的制备

[0060] (1-1)培养液的制备

[0061] 按照体积比为4:1的比例将30mmol/L KH2PO4溶液和30mmol/L K2HPO4溶液混合，调节混合溶液pH至5.6，得到K-Pi缓冲液，备用；

[0062] 配制200mmol/L的蔗糖溶液，备用；

[0063] 将K-Pi缓冲液和200mmol/L的蔗糖溶液按体积比19:1的比例混匀后灭菌，冷却后取4ml加入40mg抗坏血酸钠盐，得到溶液A；

[0064] (1-2)稳定性同位素培养液的制备

[0065] 在(1-1)步中制备的溶液A中加入300mmol/L 15N标记的盐酸乙胺；

[0066] (2)检测材料的准备

[0067] (2-1)植物材料的处理

[0068] 取茶树组织，用70％酒精快速消毒，蒸馏水洗净，滤纸吸干，称重后切成约2mm×2mm的块状，在无菌操作台中，将已切成块状的茶树组织加入培养液中，28℃在摇床中培养12h，转速160rpm；

[0069] (2-2)培养后材料的处理

[0070] 终止培养，取出培养液中的茶树材料，蒸馏水冲洗吸干，加入液氮，快速研磨成粉末状，转移至离心管中，在-20℃下冷冻4h，再在冷冻干燥机中冷冻至足干，并留取其培养液待测；

[0071] (2-3)材料中茶氨酸的提取

[0072] 取冻干后的粉末，转移至10ml离心管中，加入3ml沸水，100℃水浴20min后离心15min取上清液，重复两次，定容至10ml；

[0073] 将提取液和留取的培养液通过水相滤头过滤待测；

[0074] (3)材料中茶氨酸的超高效液相色谱–串联质谱分析

[0075] (3-1)标准曲线的制备

[0076] 利用茶氨酸标品配制浓度分别为0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.01mg/mL，0.001mg/mL，0.0001mg/mL，0.000001mg/mL的茶氨酸标准样品，将上述不同浓度的茶氨酸标准样品进行LC-MS/MS分析，以茶氨酸浓度为横坐标，以茶氨酸离子相对吸收峰值为纵坐标，求得标准曲线；

[0077] (3-2)将培养12h后的茶树组织提取液和培养液进行LC-MS/MS分析，根据标准14
曲线计算培养12h后的茶树组织提取液和培养液中总茶氨酸的含量，N-茶氨酸的含量，
15
N-茶氨酸的含量，计算茶氨酸合成酶活力。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种测定煤焦油六组分的方法	2020-05-08	341
一种繁育东亚小花蝽的方法	2020-05-08	751
一种基于全流触探的饱和黏土试样强度及应变软化参数测量装置	2020-05-08	445
NaOH和Na2CO3混合碱熔粉煤灰合成4A型分子筛的方法	2020-05-11	974
一种分子筛复合膜及其制备方法和应用	2020-05-08	347
一种可通过水洗重复利用的碱性精密pH试纸及其制备方法和应用	2020-05-08	196
集成核酸提取、扩增和检测的微流控芯片、系统及方法	2020-05-08	921
LIBS检测用样品的制备方法和肥料养分的检测方法	2020-05-08	732
一种螺杆鼓风机	2020-05-08	37
一种昆虫饲养装置	2020-05-08	11

一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法

一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：