一种解淀粉芽孢杆菌及在产低温淀粉酶中的应用
阅读：46发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种解淀粉芽孢杆菌及在产低温淀粉酶中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种解 淀粉 芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481及在产低温淀粉酶中的应用。通过对新疆 冰 川冰 缘地区阿勒泰进山口冻土中产低温淀粉酶菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.7481进行分子 生物 学鉴定，对菌株的DNA提取及PCR扩增，并结合 电泳 等技术，进一步确定菌株所属种属，以其为分子生物学技术在产低温淀粉酶菌株鉴定的准确性。本发明充分利用新疆 冰川 高寒冻土 植物 根际 未培养的微 生物群落 资源，开发适用于新疆特色果蔬加工所急需的低温酶制剂，具有重要应用价值。，下面是一种解淀粉芽孢杆菌及在产低温淀粉酶中的应用专利的具体信息内容。
一种解淀粉芽孢杆菌及在产低温淀粉酶中的应用
发明领域
[0001] 本发明涉及应用细菌产低温淀粉酶的技术领域，具体的，本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌及在产低温淀粉酶的应用的技术领域。
背景技术
[0002] 自然界中有许多微生物都能够产生淀粉酶，如根霉、曲霉、芽孢杆菌等。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称。本着营养、健康、安全的宗旨，低温淀粉酶非热加工已成为一种新型果蔬加工技术，具有减少营养损失、降低损耗和保持新鲜度等优点，能够提高果蔬加工产品品质，便于生产过程的控制和食品安全监控。
[0003] 目前，科学界对低温淀粉酶的研究主要集中在酶的结构与功能、酶的冷适应性机制以及在生物工程方面的应用等。尽管科学家们已经从低温微生物中分离纯化了低温淀粉酶，但国内目前对于产低温淀粉酶菌株的分子生物学特性及新疆特色果蔬加工所需的低温复合酶制剂开展的研究较少。由于新疆广阔的冰川冰缘地区蕴藏着丰富的微生物。研究新疆极端微生物不仅有助于扩大极端微生物资源库，也有利于新疆特殊环境微生物的开发和利用。利用新疆冰川资源优势，旨在开发果蔬加工用酶制剂，提高果蔬产品品质和附加值，减少营养损失，降低能源损耗都具有重要作用。
发明内容
[0004] 针对现有技术中未见有关利用新疆冰川资源开发利用解淀粉芽孢杆菌及在产低温淀粉酶应用的现状，基于新疆地区缺乏果蔬加工低温酶制剂的现状，充分利用新疆冰川高寒冻土植物根际未培养的微生物群落资源，开发适用于新疆特色果蔬加工所急需的低温酶制剂。本发明目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481及其在产低温淀粉酶的应用。
[0005] 本发明的技术方案：
[0006] 通过对新疆冰川冰缘地区冻土中产低温淀粉酶菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481进行分子生物学鉴定，通过对菌株的DNA提取及PCR扩增，并结合电泳等技术，进一步确定菌株所属种属，以其为分子生物学技术在产低温淀粉酶菌株鉴定的准确性。本发明充分利用新疆冰川高寒冻土植物根际未培养的微生物群落资源，开发适用于新疆特色果蔬加工所急需的低温酶制剂。
[0007] 具体的，本发明提供了一种产低温淀粉酶菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481。
[0008] 本发明从新疆阿勒泰地区进山口与乌鲁木齐南山、一号冰川等冰川冰缘地区采集的土样中取样，筛选出一株产低温淀粉酶的细菌，该菌株具有水解淀粉的特性或者功效，并具有良好的耐低温性和pH稳定性，其培养物对人畜无毒无害，不污染环境，它的次级代谢产物对真菌和细菌都具有强烈的抑制作用。
[0009] 本发明根据新疆的地理环境的特殊性，从新疆阿勒泰地区进山口与乌鲁木齐南山、一号冰川等典型的冰川冰缘地区冻土中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，编号为WKA-4，经微生物学分类与鉴定，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
[0010] 本发明具体提供了一种解淀粉芽孢杆菌，命名编号为WKA-4，其能够产低温淀粉酶。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对WKA-4菌株进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定编号WKA-4菌株为芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2013年4月17日，保藏号是CGMCC.No7481。经16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明，编号WKA-4菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，以下简称WKA-4。该菌株培养温度25℃，最适培养温度25℃；优先生长于LB培养基表面，LB培养基组分可溶性淀粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，琼脂15g/L，蒸馏水1L。菌株在LB培养基上菌落直径大小为2.2-4.5mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、不光滑、不规则；菌落不透明，呈乳白色，浑浊；具有一定粘稠性；表面褶皱，有扩散；盐浓度3％，自然pH值，革兰氏阳性菌。
[0012] 1、种子培养：将解淀粉芽孢杆菌的孢子接种于LB斜面培养基，25℃恒温培养24h，到培养基澄清变为浑浊，培养基液面出现少许泡沫，即得到斜面菌种；在500ml玻璃瓶中装入100ml种子培养基；将斜面斜面菌种挖块接种至种子培养基，25℃、180rpm培养24-36h，得到种子液；斜面培养基和种子培养基都选用LB培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，自然PH值。
[0013] 2、发酵培养：在500ml的三角瓶中装100ml发酵培养基，在培养基中接种5ml步骤1得到的种子液，25℃、180rpm培养24-36h，收获发酵液；发酵培养基选用LB培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，自然PH值。
[0014] 本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481在生产低温淀粉酶中的应用，提供的解淀粉芽孢杆菌能够高产低温淀粉酶，发酵温度25℃，最适pH值为6，酶活力大概32U/mL。
[0015] 本发明采用的以下培养基：
[0017] 液体富集培养基：可溶性淀粉2g，蛋白胨1g，牛肉膏0.5g，NH4NO31g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，KCl0.5g，蒸馏水1000mL，自然pH值。
[0018] LB液体培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，自然PH值。LB固体培养基：在液体培养基中加1.5％的琼脂。
[0019] 通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下技术效果：
[0020] 1.本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481。
[0021] 2.将本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481生产低温淀粉酶中的应用，提供的解淀粉芽孢杆菌能够高产低温淀粉酶，发酵温度25℃，最适pH值为6，酶活力不低于32U/mL，为开发适用于特色果蔬加工所急需的低温酶制剂具有重要现实意义和作用。
附图说明
附图说明
[0022] 图1显示为WKA-4菌株的菌落形态图。
[0023] 图2显示为WKA-4菌株的细胞形态图。
[0024] 图3显示为WKA-4菌株的PCR扩增图，图中M.Maker的片段大小从上到下依次是5000.3000.2000.1000.750.500.250.100bp；N指阴性对照.P指阳性对照。
[0025] 图4显示为WKA-4菌株的系统进化发育树图。
[0026] 图5显示为温度对酶活力的影响图。
[0027] 图6显示为pH值对酶活力的影响图。
具体实施方式
[0028] 下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
[0029] 本发明中选用的试剂与培养基如下：
[0030] 阳性细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱形)北京庄盟国际生物基因科技有限公司；ZM103DNA Marker III、ZT2012×Taq PCR MasterMix(含染料)、10mg/L EB染色液北京庄盟国际生物基因科技有限公司；引物KM127f和KM21492R由华大基因公司提供。
[0031] 革兰氏染色液、1mol/L pH8.0Tris-HCl、20mg/L蛋白酶K上海百祥生物科技有限公司；10mg/mL溶菌酶、北京百泰克生物技术有限公司；50×TAE(Tris-乙酸)、1％溴酚蓝指示剂、北京索莱宝科技有限公司；0.5μg/L EB染色液。
[0032] 选用的仪器与设备：LD2X-30KA立式电热压力蒸汽灭菌锅、上海申安医疗器械厂；HR40-II A2生物安全柜、青岛海尔特种电器有限公司；DHP-9162电热恒温培养箱、上海-恒科技有限公司；XSP-2CA生物显微镜厦门Motic实业集团有限公司；AR2130/C型精密电子天平、梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；THE-82气浴恒温振荡器、常州市国立试验设备研究所；050-810Tgradient48型PCR扩增仪、德国Biometra公司；DYY-6C型电泳仪、北京六一仪器厂；JY04S型凝胶成像仪、北京君意东方电泳设备有限公司；DY87584型大龙单道手动移液器、郑州朋来仪器有限公司；MiniSpin型离心机、德国Eppendorf公司。
[0033] 本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0034] 种子培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖1g，K2HPO43g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0；液体富集培养基：可溶性淀粉2g，蛋白胨1g，牛肉膏0.5g，NH4NO31g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，KCl0.5g，蒸馏水1000mL，自然pH值；LB液体培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，自然PH值。LB固体培养基：在液体培养基中加1.5％的琼脂。
[0035] 实施例一：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481的筛选、分类及鉴定
[0036] 本发明根据新疆的地理环境的特殊性，从新疆阿勒泰地区进山口与乌鲁木齐南山、一号冰川等典型的冰川冰缘地区冻土中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，编号为WKA-4，经微生物学分类与鉴定，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
[0037] 本发明具体提供了一种解淀粉芽孢杆菌，命名为WKA-4，其能够产低温淀粉酶。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对WKA-4菌株进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定编号WKA-4菌株为芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2013年4月18日，保藏号是CGMCC.No7481。经16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明，编号WKA-4菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，以下简称WKA-4。该菌株培养温度25℃，最适培养温度25℃；优先生长于LB培养基表面，LB培养基组分可溶性淀粉10g/L，蛋白胨
10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，琼脂15g/L，蒸馏水1L。菌株在LB培养基上菌落直径大小为2.2-4.5mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、不光滑、不规则；菌落不透明，呈乳白色，浑浊；具有一定粘稠性；表面褶皱，有扩散；盐浓度3％，自然pH值，革兰氏阳性菌。参见附图1、2、3、4所示。
10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，琼脂15g/L，蒸馏水1L。菌株在LB培养基上菌落直径大小为2.2-4.5mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、不光滑、不规则；菌落不透明，呈乳白色，浑浊；具有一定粘稠性；表面褶皱，有扩散；盐浓度3％，自然pH值，革兰氏阳性菌。参见附图1、2、3、4所示。
[0038] 菌种的分离与纯化
[0039] 样品的富集培养：在50mL蒸馏水中放入少许玻璃珠，121℃灭菌20min，冷却后，在无菌条件下将称好的5g冻土样品加入到冷却无菌水中制成1％的土壤悬浮液，每隔20min振荡一次，振荡数次充分摇匀后，在无菌操作台中静置半小时，待用。
[0040] 准备50mL液体富集培养基，121℃灭菌20min后冷却，在无菌条件下吸取1mL土壤悬浮液，加入到液体富集培养基中，封口后放入控温摇床培养箱内，20℃，200r/min培养24h，备用。
[0041] 初筛：在超净工作台上，用移液枪吸取富集培养液0.5mL，加入到装有4.5mL无菌水的小试管中，从第一支小试管吸取0.5mL稀释液到第二支试管，用同样的方法，制的不同-2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9的稀释液(10 .10 .10 .10 .10 .10 .10 .10 )，移入凝固的初筛培养皿中，用涂布棒涂匀，将涂匀后的培养基平皿放在25℃的生化培养箱内恒温培养，观察有无透明圈的出现并记录菌落特征，挑取产透明圈的不同形态的单个菌落，进行简单染色，在显微镜油镜下观察细胞形态，并对疑似的菌种进行编号。
[0042] 菌种的纯化：将疑似产透明圈的菌株，接种于LB平板分离培养基中进行纯化，纯化3～4次，镜检，获得较纯菌株后，接种于LB斜面培养基中，置于25℃培养箱恒温培养24～48h，4℃保存备用。
[0043] 第1次活化：将需活化的菌株接种到LB液体培养基中，20～25℃进行培养24h。
[0044] 第2次活化：将第1次活化的菌株培养液按10％的接菌量接菌到种子培养基中，20～25℃进行培养20～24h。
[0045] 第3次活化：将第2次活化好的培养菌液再次同样的接菌量接种到种子培养基中，20～25℃进行培养16～18h。
[0046] 三次活化的菌株形态结构：菌株经LB培养基和种子培养基培养后，其菌株的活力很强，生长代谢旺盛。将其经3次活化得到的菌株在10×100倍的油镜下观察，结果参见附图1、2所示。活化的菌株无荚膜、周生鞭毛，能运动，革兰氏染色阳性。与解淀粉芽孢杆菌的定义完全符合。
[0047] 菌株的鉴定：
[0048] 将活化好的菌株经传统的生理生化鉴定和16SrDNA分子生物学鉴定。
[0049] 菌株的16S rDNA琼脂糖凝胶电泳结果：
[0050] 经过通用试剂盒的提取和凝胶电泳检测PCR扩增体系，结果表明冻土中筛选的3株菌均适合上述PCR扩增程序。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和EB染色后用Fluorchem Xplor凝胶成像分析系统拍摄，结果参见附图3所示。冻土中芽孢杆菌菌株均能在上述构建的PCR程序扩增成功；对照组无干扰条带，样品中无其他16S rDNA条带；扩增产物片段均在
800～2000bp之间，可初步判断为16S rDNA。
800～2000bp之间，可初步判断为16S rDNA。
[0051] 基于16S rDNA序列扩增和PCR产物测序，获得rDNA序列经GenBank\Blast同源序列比对分析，其与现有技术所报道的已知解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens同源性较高，相似度：98.99％；从GenBank中获取解淀粉芽孢杆菌标准菌株16S rRNA基因序列，进行同源进化分析，构建系统进化树，结果参见附图4；结果显示，菌种编号为WKA-4的菌株隶属于芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，与Bacillus amyloliquefaciens亲源关系最近，同源相似性为98.99％，确定菌株WKA-4为解淀粉芽孢杆菌，结合上述提供的菌种编号为WKA-4的菌落形态、生理生化特性，生物学分类名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
[0052] 实施例二：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481的分子水平分析及分类
[0053] 1.菌种的16SrDNA分析
[0054] 1.1菌种基因组DNA的提取：
[0056] 1.216SrDNA PCR扩增：
[0057] 将上述制备的基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用50μL反应体系，用一对与ITS序列互补的引物KM127f和KM21492R对16S-ITS区域菌种DNA进行扩增。PCR扩增体系：6μL菌种DNA，引物KM1和KM2各1μL，2×混合液25μL，ddH2O17μL。
[0058] PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，从变性到延伸35个循环；72℃延伸10min。4℃暂时保存，-20℃保存备用。
[0059] 1.3凝胶电泳检测目的序列16S rDNA
[0061] 加样：将制备好的琼脂糖胶放入1×TAE电泳缓冲液中，第一胶孔中加入Marker5.0μL，其余样孔分别加入5.0μL的PCR扩增产物。加好样液后，盖好电泳槽盖。
[0063] 摄像：电泳完成后，将琼脂糖胶放于0.5μg/L EB染色液中染色30min，然后用蒸馏水冲净琼脂糖胶上的EB液，放于凝胶摄像仪中进行拍摄。
[0064] 1.4扩增产物测序和序列分析
[0065] PCR扩增产物进行测序，测得的序列与NCBI数据库中一致序列进行Blast比对及相似性分析。
[0066] 1.5系统发育分析
[0068] 如表1所示，通过16S rDNA序列同源性比较A-2，A-3，WKA-4菌株与GeneBank数据库中分值最高的前10株菌的16S rDNA序列相似性均达到99％，
[0069] 表1解淀粉芽孢杆菌菌株的16S rDNA分析结果
[0070]
[0071] 而且分值 最高的全部 为解淀粉 芽胞杆菌。 最相近的是Bacillusamyloliquefaciens strain NBRC1553516S ribosomal RNA，partial sequence，序列号为NR_04145，编号为WKA-4同源性在99％。由于16S rDNA的同源性在97％以上就可以认为是同一个种。所以此三株菌株都均为解淀粉芽孢杆菌。
[0072] 2.菌株的16S rDNA片段测序结果及入库比对结果
[0073] 将扩增成功的优势菌株的PCR产物双向测序，通过NCBI数据库比对，选取序列最为接近的部分菌种。测序结果采用MegAllign Fasta软件绘制系统进化树。如图3、4所示，菌株A-2，A-3，WKA-4与Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC1553516S ribosomal RNA，partial sequence(NR_04145)相似率为99％，且在同一个分支中。菌株A-2，A-3，WKA-4在LB培养基上的菌落颜色均为白色，故鉴定结果为解淀粉芽孢杆菌。
[0074] 实施例三：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.7481的发酵工艺
[0075] 1、种子培养
[0076] (1)将解淀粉芽孢杆菌的孢子接种于LB斜面培养基，25℃恒温培养24h，到培养基澄清变为浑浊，培养基液面出现少许泡沫，即得到斜面菌种。
[0077] (2)在500ml玻璃瓶中装入100ml种子培养基。
[0078] (3)从步骤(1)的斜面挖块接种至步骤(2)的培养基，25℃、180rpm培养24-36h，得到种子液。
[0079] (4)斜面培养基和种子培养基都选用LB培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，自然PH值。
[0080] 2、发酵培养
[0081] (1)在500ml的三角瓶中装100ml发酵培养基。
[0082] (2)在步骤(1)的培养基中接种5ml步骤1得到的种子液，25℃、180rpm培养24-36h，收获发酵液。
[0083] (3)发酵培养基选用LB培养基：可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，自然PH值。
[0084] 实施例四：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481产低温淀粉酶试验
[0085] 酶学实验选择淀粉酶分解实验：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481可分解淀粉。选用培养基：。培养条件：pH，温度℃，培养时间：天；菌株生长条件。pH、温度耐受实验。
[0086] 1.低温淀粉酶酶学特性的分析
[0087] 1.1粗酶液的制备
[0088] 将发酵液在4℃，5000r/min离心7min，取上清液作为粗酶液。
[0089] 1.2低温淀粉酶酶活力的测定
[0090] 在20mL试管中依次加入2.5mL1％可溶性淀粉溶液，2mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH＝6.0)，30℃预热5min，加入0.5mL酶液，40℃保温5min，加5mL浓度为0.1mol/L的稀硫酸终止反应。取0.5mL反应液加5mL浓度为0.4mmol/L的I2-KI溶液显色，测OD620nm值。利用公式(1)计算低温淀粉酶酶活力。
[0091] A＝50×D×(R0-R)/R0 (1)
[0092] 式中：A为酶活力(酶活力单位为5min水解1mg淀粉所需酶量，单位：U/mL)；D为稀释倍数；R0为底物加碘液的OD值；R为反应液加碘液的OD值；50为换算系数。
[0093] 1.3最适pH值的测定
[0094] 将酶液分别在pH值为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中进行反应，测定低温淀粉酶的最适pH值。
[0095] 1.4最适温度的测定
[0096] 将酶液分别在温度为0(冰浴)、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55℃的水浴中保温处理5min，测定低温淀粉酶的最适温度。
[0097] 1.5低温淀粉酶的最适pH值的测定
[0098] 在酶活测定反应体系中，分别在5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55℃下测定酶活力。不同发酵温度对酶活力的影响参见附图5。
[0099] 由附图5可知，温度在0℃～30℃这个过程，酶的最适发酵温度为30℃。酶活力随温度的升高逐渐增强并在30℃时酶活力达到最强，具有低温酶的特性。在30℃以后随温度的升高酶活力由逐渐地减弱。在低温条件下，相对嗜温型酶而言，来自低温微生物的酶反应所需时间更短，这是低温淀粉酶的应用优势。
[0100] 1.6低温淀粉酶的最适温度的测定
[0101] 在酶活测定反应体系中，分别以pH值为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5测定酶活力。不同初始pH对酶活力的影响参见附图6。
[0102] 由附图6可知，在pH4～5这个范围内时，pH对酶活力影响较小；随着pH继续升高酶活力逐渐开始增强，在pH为6时酶活力达到最强，说明此酶适宜于接近中性偏酸的反应环境。但pH6.5～7.5时酶活力呈缓慢下降趋势，说明此酶耐碱性较差。
[0103] 经上述试验 研究得出：本发明提供的 解淀粉芽孢杆 菌(Bacillusamyloliquefaciens)WKA-4CGMCC No.7481生产低温淀粉酶中的应用，提供的解淀粉芽孢杆菌能够高产低温淀粉酶，发酵温度25℃，最适pH值为6，酶活力不低于32U/mL，为开发适用于特色果蔬加工所急需的低温酶制剂具有重要现实意义和作用。
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