技术领域
[0001] 本
发明涉及一种真菌毒素壳聚糖免疫亲和吸附剂的制备方法及用途，属于天然多糖开发应用和功能材料制备技术领域。
背景技术
[0002] 真菌毒素广泛污染粮食、油料、和食品等
植物源性产品，对人类健康存在巨大威胁，对动物和人类有致癌、致畸、致基因突变作用。在危害较为严重的真菌毒素中，以黄曲霉毒素、玉米赤霉烯
酮毒素、呕吐毒素和伏
马毒素等最具代表性。世界卫生组织(WHO)也于2002年将真菌毒素对农产品的污染列为引起食源性
疾病的重要根源。目前，农产品中真菌毒素残留检测以HPLC和HPLC-MS等仪器分析方法为主。由于农产品样品基质复杂、真菌毒素含量低，因此在进行仪器分析检测前通常需要对样品进行
净化处理。免疫亲和色谱(IAC)利用
抗原-
抗体特异性可逆结合，实现目标物的浓缩分离，具有选择性高、操作简便快速等优点，因而被公认为最理想的样品前处理方法。
[0003] 目前最常用的商品化色谱填料载体是琼脂糖凝胶，性能稳定且具有良好的
生物相容性，但在活化和再生过程中需要用到剧毒的溴化氰，价格也过于昂贵。因此，寻找开发一种性能优良且经济实用的色谱填料载体是目前许多实验室致
力研究的方向。
[0004] 壳聚糖，几丁质脱乙酰产物，自然界中仅次于
纤维素的第二大天然多糖，来源丰富，具有安全无毒、易降解、良好的生物相容性等优点。此外，壳聚糖表面含有大量的可修饰功能基团(羟基和
氨基)，可以通过酰化、羟基化、醚化、希夫氏反应、酯化、
水解等反应制备出各种衍生物。因而，壳聚糖不仅是一种天然资源，更是一种新材料在医药、化工、农业等领域有着良好的应用前景。目前制备得到的壳聚糖微球为载体的色谱填料在微球大小均一性、酸性条件下的
稳定性等方面尚存在着一些不足，限制了它的应用。为了解决这一问题，本发明通过优化改良壳聚糖微球制备方法，并将其与真菌毒素抗体结合，获得了一种pH稳定、粒径均一壳聚糖微球为载体的免疫亲和吸附剂，利用所得的免疫亲和吸附剂对农产品中的真菌毒素残留进行净化分离和分析测定。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种真菌毒素壳聚糖免疫亲和吸附剂的制备方法，用该方法制备的免疫亲和吸附剂对农产品中的真菌毒素残留进行浓缩净化。
[0006] 本发明中壳聚糖微球的制备采用膜乳化法，以壳聚糖为原料，戊二
醛饱和的
甲苯溶液为交联剂，span 80为乳化剂。理化表征分析显示，壳聚糖微球粒径大小均一，且在pH 4-10范围内稳定。将所得的壳聚糖微球与真菌毒素抗体偶联得到的免疫亲和吸附剂，并将其用于实际样品中真菌毒素残留的净化分离和分析测定。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0008] 一种pH稳定、粒径均一壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法，按照下述步骤进行：
[0009] (1)配制壳聚糖溶液和由液体
石蜡和石油醚组成的油相，将壳聚糖溶液倒入膜乳化仪进料池中，调节氮气压力以及连续相磁力搅拌转速，使壳聚糖溶液在氮气压力下缓慢通过SPG膜孔并被压入油相中，乳化结束后加入交联剂进行搅拌交联，再经过石油醚洗、
乙醇洗、水洗、还原、再水洗后得到壳聚糖微球；
[0010] (2)将步骤(1)中制备的壳聚糖微球与真菌毒素抗体进行搅拌偶联，蒸馏水和PBS洗涤后得到免疫亲和吸附剂。
[0011] 本发明步骤(1)中，所述的壳聚糖分子量100kD，壳聚糖浓度以
质量比计为1％。
[0012] 本发明步骤(1)中，所述的由液体石蜡和石油醚组成的油相中液体石蜡和石油醚的体积比为7:5，且油相中含体积质量百分比为4％的span 80。
[0013] 本发明步骤(1)中，所述的壳聚糖(水相)与液体石蜡和石油醚组成的油相体积比为1:6。
[0014] 本发明步骤(1)中，所述的交联剂为戊二醛饱和的甲苯溶液，壳聚糖(氨基)：戊二醛(醛基)摩尔比为1:0.5。
[0015] 本发明步骤(1)中，所述的搅拌速度为500rpm。
[0016] 本发明步骤(1)中，所述的氮气压力为0.02MPa。
[0017] 本发明步骤(2)中，所述的
偶联剂为环
氧氯丙烷，体积浓度为20％。
[0018] 所制备的真菌毒素壳聚糖微球免疫亲和吸附剂用于食品样品中真菌毒素残留的净化分离和分析测定。
[0019] 本发明的有益效果：(1)本发明开发了一种来源丰富、安全无毒天然多糖色谱填料载体；(2)本发明制备的壳聚糖微球粒径大小均一，且具有较宽的pH稳定性；(3)本发明制备的壳聚糖微球免疫亲和吸附剂可用于实际样品中真菌毒素残留的净化分离和分析测定。
附图说明
[0020] 图1.本发明壳聚糖微球的扫描电镜图；
[0021] 图2.本发明壳聚糖微球的粒径分布图；
[0022] 图3.本发明壳聚糖微球pH稳定性图；
[0023] 图4.本发明壳聚糖微球免疫亲和柱外观图；
[0024] 图5.本发明icELISA评价方法标准曲线图；
[0025] 图6.本发明HPLC评价方法标准曲线图。
具体实施方式
[0026] 本发明下面的
实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0027] 实施例1一种真菌毒素壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备
[0028] (1)粒径均一、pH稳定壳聚糖微球的制备：
[0029] a.取0.5g壳聚糖，在50mL 2％的
醋酸溶液中溶解配成1％的壳聚糖溶液；
[0030] b.配制300mL液体石蜡和石油醚(v:v,7:5)混合而成的油相(含4％span 80)；
[0031] c.将壳聚糖溶液倒入膜乳化仪进料池中，调节氮气压力为0.02MPa，油相磁力搅拌速度为500rpm，使壳聚糖溶液在氮气压力下通过SPG膜被压入油相中；
[0032] d.加入7.5mL的交联剂交联反应1h后加入5mL1M氢氧化钠溶液，继续交联2h；
[0033] e.交联结束后经过石油醚洗、乙醇洗、水洗至中性，用5M NaBH4还原过夜最后再用蒸馏水洗至中性，
冷冻干燥后备用。
[0034] (2)免疫亲和吸附剂的制备，本实施以玉米赤霉烯酮为例：
[0035] a.称取0.5g的壳聚糖微球，用pH 8.3、0.1mol/L NaHCO3(含0.5mol/L NaCl)的偶联缓冲液洗涤2次后，沉淀重新悬浮于31mL的偶联缓冲液中，再加入1mL 11mg/mL的抗体溶液，搅拌吸附3h；
[0036] b.加入偶联剂环氧氯丙烷，使其最终体积浓度为20％，在37℃下振荡交联5h；
[0037] c.交联结束后，8000r/min离心3min取上清测定280nm和260nm处的吸光度，根据公式：Cprotein(mg/mL)＝1.45A280nm-0.74A260nm计算未偶联的抗体含量，进而计算偶联率；
[0038] d.用大量水洗至中性，再用PBS洗涤2次。
[0039] 试验一、本发明所述粒径均一、pH稳定壳聚糖微球制备条件的优化及性能表征[0040] 1、实施例1所制备的粒径均一、pH稳定壳聚糖微球条件的确定：(1)壳聚糖溶液浓度：本实验中分别称取壳聚糖(分子量为100kDa)0.05g、0.1g、0.15g，溶于10ml 2％醋
酸溶液中，制备成浓度为0.5％、1％、1.5％的壳聚糖溶液，氮气压力为0.02MPa，水相油相比为1:6，搅拌速率为500rpm；(2)氮气压力：在本实验中，壳聚糖(分子量为100kDa)溶液浓度为
1％，氮气压力选择0.01MPa、0.02MPa、0.03MPa，水相油相比为1:6，搅拌速率为500rpm；(3)水相油相比：在本实验中，壳聚糖(分子量为100kDa)溶液浓度为1％，氮气压力为0.02MPa，水相油相比选择1:6、1:8、1:10，搅拌速率为500rpm；(4)搅拌速率：本实验中壳聚糖(分子量为100kDa)溶液浓度为1％，氮气压力为0.02MPa，水相油相比为1:6，搅拌速率选择400rpm、
500rpm、600rpm。按照实验方法制备壳聚糖微球，扫描电镜显示制得的壳聚糖微球呈规则的球形(图1)，激光粒度分析仪测定微球的粒径分布与SPAN值，结果见表1。
[0041] 经过单因素实验得到优化条件：壳聚糖(分子量为100kDa)溶液浓度为1％，氮气压力为0.02MPa，水相油相比为1:6，搅拌速率为500rpm，制备获得的壳聚糖微球平均粒径109μm，粒径分布度SPAN 1.55(图2)。SPAN值按照下式计算：
[0042] SPAN＝(D90-D10)/D50
[0043] 表1不同制备参数对壳聚糖微球粒径分布的影响
[0044]
[0045] 2、实施例1所制备得到的粒径均一、pH稳定的壳聚糖微球化学稳定性的确定：将0.1g壳聚糖微球分别悬浮于50mM HAc-NaAc(pH 4.0)，50mM PBS(pH 6.0)，50mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM NaHCO3-Na2CO3(pH 10.0)溶液中，4℃保存30h，扫描电镜结果显示壳聚糖微球结构没有发生明显变化(图3)。
[0046] 试验二、本发明所述壳聚糖微球玉米赤霉烯酮免疫亲和吸附剂的制备与应用[0047] 1、实施例1所制备得到的壳聚糖微球玉米赤霉烯酮免疫亲和吸附剂结合容量的测定：取0.5mL制备的免疫亲和吸附剂填充到SPE柱中得到免疫亲和柱(图4)，将7mL 0.5μg/mL的玉米赤霉烯酮标准品溶液过柱，上样液每1.0mL收集一管，用间接竞争ELISA(icELISA)测定每组份中玉米赤霉烯酮含量。根据下式计算：柱容量(即被吸附的玉米赤霉烯酮总量)＝玉米赤霉烯酮上样总量－洗下的玉米赤霉烯酮总量。结果显示，第1～6mL上样液中不含有玉米赤霉烯酮，上样第7mL时0.428μg玉米赤霉烯酮被洗下。因此，IA
C柱的最大柱容量约为：[6×0.5+0.072]×2＝6.1μg/mL凝胶。
[0048] 2、实施例1所制备得到的壳聚糖微球玉米赤霉烯酮免疫亲和吸附剂用于玉米粉样品中玉米赤霉烯酮的加标回收：对空白玉米粉进行加标使玉米赤霉烯酮最终浓度为50和100μg/kg。将玉米粉样品(4g)称入均质器中，加入1g NaCl和10mL乙腈水(80:20,v/v)高速提取2分钟。过滤萃取物并用蒸馏水以1:5的比例稀释。将总共10mL稀释的提取物通过玉米赤霉烯酮免疫亲和柱。然后用1ml甲醇洗脱玉米赤霉烯酮并收集用于HPLC检测，计算回收率。
[0049] 表2壳聚糖微球玉米赤霉烯酮免疫亲和吸附剂用于玉米粉样品中玉米赤霉烯酮的加标回收
[0050]
[0051] 试验三、本发明所述壳聚糖微球玉米赤霉烯酮免疫亲和吸附剂的性能评价方法[0052] 1、icELISA评价方法的建立：包被封闭后，先加入50μL系列浓度(50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0ng/mL)的标准品溶液，每种浓度3个平行，再加入50μL最佳稀释倍数的一抗，加入酶标二抗，显色封闭后用酶标检测仪测定各个浓度在
450nm的吸光度Ai和对照(即浓度为0ng/mL时)的吸光度A0，以Ai/A0为纵坐标，标准溶液浓度的对数值为横坐标作图。后经Origin
软件拟合，得到标准曲线的线性范围为0.05～50ng/mL。该方法标准曲线图见
说明书附图5。
[0053] 2、HPLC评价方法的建立：HPLC的色谱条件：Shim-pack VP-ODS色谱柱(250×4.6mm)；流动相：V(乙腈)：V(水)：V(甲醇)＝46:46:8；
荧光检测器检测，激发
波长为274nm，发射波长为440nm；柱温：室温；进样量：50μL；流速：1.0mL/min。
[0054] 取标准工作液(5mg/mL)，配制成系列浓度(15.625、31.25、62.5、125、250、500ng/mL)，用HPLC测定，以各浓度和其对应的峰面积进行线性拟合。该标准曲线线性关系较好，其线性回归方程为：y＝3085.3x-61878(R2＝0.9995)，线性范围为15.625～500ng/mL。该方法标准曲线图见说明书附图6。
[0055] 综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明
申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
