存在由多种微生物产生的不同类型的果糖基转移酶。在Enzyme and Microbial Technology,19,107-117,1996.中描述了不同来源的不同果糖基转移 酶的作用。
已知果聚糖蔗糖酶(Levansucrase)(果糖基转移酶类的一种代表酶)通 过重复的分开蔗糖中葡萄糖-果糖的连接并转移果糖至受体糖这一过程来催化 果聚糖(多聚果糖衍生物)的形成。因此,如果该受体糖是蔗糖自身,其建 立了高分子量果糖链。Hestrin和Avigad在Biochem.J.69(1958)pp.388-398 的工作表明具有不同程度能
力的一系列糖,作为良好的果糖受体与果聚糖生 成竞争并抑制它。取代葡萄糖被发现是较差的受体。然而,当果糖供体(即 蔗糖)与受体的比率很高,典型地在5∶1~10∶1,并且浓度很低时,显示 了取代葡萄糖也可以作为受体。因此,Kunst等在Eur.J.Biochem.42,611-620 (1974)中在使用D-葡萄糖6-
磷酸酯作为受体与蔗糖中获得成功,其使用了衍 生自Bacillus subtilis Marburg 168株系的突变体的酶。类似的专利no. GB2046757B公开了使用各种
醛糖起始原料作为受体与蔗糖或
棉子糖,其中 使用的果聚糖蔗糖酶衍生自各种微生物,包括Actinomyces viscosus和 B.subtilis(ATCC 6051株系,即the Marburg株系)。然而在本专利
申请中,醛 糖通常是非衍生的糖并且所使用的供体和受体的摩尔比是1∶5,可能为了最 小化链-形成反应。
Rathbone等(1986)在美国专利no.4617269中主张了制备6-衍生的蔗糖衍 生物的方法,其利用在蔗糖或棉子糖或
水苏糖存在时,将相应的6-衍生的葡 萄糖或半乳糖与果糖基转移酶反应,特定的限定是该方法使用的果糖基转移 酶是从细菌中分离的。
在本发明中,微生物全细胞制备被成功地用于转移来自蔗糖的果糖部分 至葡萄糖-6-酯以产生蔗糖-6-酯,所述微生物能够合成果糖基转移酶类的一种 或多种酶并且其全细胞应该是通过一简单的分离方法(包括过滤、离心等 等)可从反应混合物中分离。发现了即使用这些粗制品的转变产率也非常 高,提高了该方法的经济性和便利性。在优选的实施方式中,
酵母 Aureobasidium pullulans(de Bary)Arn.被用作生物催化剂以完成利用葡萄糖-6- 乙酸酯与蔗糖反应制备蔗糖-6-乙酸酯。然而,在本发明的方法中也可以使用 其它一些与Aureobasidium pullulans表现出相同活性和功能的微生物,其包括 但不限于Aspergillus oryzae,Aspergillus awamori,Aspergillus sydowi, Aureobasidium sp.,Aspergillus niger,Penicillium roquefortii,Streptococcus mutans,Penicillium jancezewskii,Sachharomyces,Bacillus subtilis,Erwinia等 等。
Aureobasidium pullulans的菌落特征是其在Malt Extract Agar中快速生 长,显得平滑,不久
覆盖粘的渗出物,奶油色或粉色,随后大部分变成棕色 或黑色。
在作为受体的各种单糖、糖醇、烷基醇、糖苷、寡糖等等存在时,来自 微生物Aureobasidium pullulans的酶作用于蔗糖以转移果糖基团至显示非常广 泛的受体特异性的受体分子。来自Aureobasidium pullulans的酶对分解蔗糖、 新科斯糖(neokestose)、木蔗糖(xylsucrose)、棉子糖和水苏糖是有活性 的。全细胞反应易受
银、汞、锌、
铜和
锡离子的抑制作用的影响。
所述受体分子可以是下述任意:D-阿拉伯糖,L-果糖,6-脱氧葡萄糖,6-O- 甲基半乳糖,葡萄糖-6-乙酸酯,葡萄糖-6-丙酸酯,葡萄糖-6-月桂酸酯,蜜二糖, 半乳糖,木糖葡萄糖-6-磷酸酯,葡萄糖-6-
戊二酸酯,乳糖,半乳糖-6-乙酸酯,甘 露糖,麦芽糖,1-硫代-葡萄糖,麦芽三糖(maltrotriose),麦芽五糖,D-阿拉伯糖, 麦芽六糖,异麦芽糖,L-阿拉伯糖,核糖,来苏糖,葡糖酸,L-鼠李糖,6-O-甲基葡 萄糖,甲基α-D-葡糖苷,木糖醇,丙三醇等等。Aureobasidium pullulans(de Bary) Arn.是一种微生物(酵母),其产生果糖基转移酶(SST)并在细胞内以及细 胞外均被发现。来自Aureobasidium培养物的酶在果糖转移反应中高度地
位置 特异性。在本发明中,果糖基转移酶生成Aureobasidium培养物ATCC No. 9348被用于通过蔗糖与6-O-乙酰基葡萄糖反应进行制备蔗糖-6-乙酸酯。通过 分子分离和色谱层析技术从蔗糖-6-乙酸酯中分离产生的其它更高分子的糖。
果糖基转移酶由Aureobasidium pullulans使用适宜的培养基深层
发酵72h 产生。在本发明中,该酶并未从生物体分离,反而全细胞用于完成催化。在 本发明中,优选利用离心从液体培养基中分离微生物细胞并用
软化水冲洗。 然而,可想到的是在达到产生足够进行转果糖基反应的生物量的临界生长阶 段后,使用这些细胞和没有分离的残留的培养基自身,其作为溶解转果糖基 反应的供体以及受体的介质,以及在反应后的分离和纯化的该反应的产物被 剩下(over)。
微生物细胞团直接悬浮到含有蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯的缓冲液的反应培 养基中。用于反应的蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯的比率优选2∶0.5。搅拌下保持 该反应并且通过HPLC监测蔗糖-6-乙酸酯的生成。向该反应中加入适宜的添 加剂,包括但不限于转化酶
抑制剂,进一步包括环己烯四醇-B-环氧化物 (Conduritol-B-epoxide)、萃他丁(trestatin)等等,以避免可影响所需产物 生成的任何副反应。一旦获得蔗糖-6-乙酸酯的合适的滴定值,即停止搅拌并 且过滤反应混合物以分离微生物细胞。
然后将含有蔗糖-6-乙酸酯和其它较高分子量糖的滤液进行分子分离。在 此使用适宜的膜分离体系分离分子量大于500道尔顿。较低分子量糖被浓 缩。发现获得的蔗糖-6-乙酸酯的纯度是60%。在
硅化硅胶上用水作为移动相 进行色谱层析以进一步纯化。
上面说明的反应可以通过维持蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯比率恒定以保持反 应向前进行的方向而持续。从反应中分离的微生物细胞根据酶活性也可以再 次被利用。
也可以利用现有技术中已知的全细胞固定化的诸多方法中的一种固定微 生物细胞团。本文所使用的说明性方法是采用geri,B.,Sassi,G.,Specchia,V., Bosco,F.和Marzona,M.,Process Biochem.,1991,21,331-335。
纯化的蔗糖-6-乙酸酯用于氯化反应以制备TGS。
下面描述的是
实施例,其说明了本发明的工作而不以任何方式限制本发 明的范围。反应物、使用的反应物的比例、描述的反应条件的范围仅仅是说 明性的并且范围延伸至其类似的反应物、反应条件和类似通性的反应。通 常,对氯化蔗糖生产领域技术人员显而易见的任何等效替代被包括在本说明 书的范围内。因此,提及乙酸酯包括了可以表现出相同功能的任何等效的酰 基基团,而使用取代的葡萄糖将包括能够在类似反应条件下提供同种类似反 应的任意取代的醛糖。实施方式的许多其它改变将被本领域技术人员很容易 地预想并且它们也被包括在本
说明书的范围内。除非文中不允许,所提及的 单数也被认为包括其复数形式,即,使用用于提取的“一种
有机溶剂”包括使 用一种
有机溶剂或连续使用多种有机溶剂或作为混合物组合使用多种有机溶 剂。
实施例1、用于生物催化的Aureobasidium细胞的生长
在一个实验中,获得自ATCC No.9348的Aureobasidium菌种的纯培养 物通过从斜面接种一菌环的全部所述菌种在200ml的振荡烧瓶中生长。使用 “Maida”(印度制造的精制小麦)、
大豆粉、酵母提取物、
磷酸盐和氯化物制 备由最佳水平的
碳和氮源组成的培养物培养基。该培养物以200rpm在旋转振 荡器上生长48h。
生长良好的细胞被转移到第二阶段生长培养物并继续生长120h。120h后 获得的培养液在8000rpm离心并且细胞被分离。用缓冲液冲洗该细胞两次以 除去所有粘到细胞上的培养基组分。然后冷冻该细胞并
冷冻干燥直到再次使 用。
实施例2、利用Aureobasidium细胞将葡萄糖-6-乙酸酯转变成蔗糖-6-乙酸酯
取100g葡萄糖-6-乙酸酯和380g蔗糖用于反应。将反应物溶解在1.2L pH6.5~7.0的乙酸钠缓冲液中。保持搅拌该溶液。将250g冷冻干燥的 Aureobasidium细胞悬浮于该溶液中并且将温度稍微升高至35℃。将0.25g萃 他丁加入到反应物料中以抑制转化酶活性。
通过HPLC监测蔗糖-6-乙酸酯的形成。反应时间为90h后,在反应混合 物中记录到45g蔗糖-6-乙酸酯生成。该反应进一步进行直到120h并且所加入 的用于转变的葡萄糖-6-乙酸酯的45%完成转变。
过滤反应的内含物以除去悬浮细胞然后利用
反渗透分离进行蔗糖-6-乙酸 酯的分离。RO膜分离所有较低分子量的化合物(例如葡萄糖和果糖)而较高 分子量的化合物被留下。然后被留下的化合物再一次用1∶5倍的水稀释并以 500道尔顿分子量截流进行纳米过滤,并且收集渗出物,其主要是蔗糖-6-乙 酸酯和其它分子量在350~400道尔顿的化合物。这些化合物再次进行RO过 滤以浓缩它们至浓度大于20%。在此蔗糖-6-乙酸酯的纯度是大约85%并且然 后上样到硅化的硅胶柱上。
使用的移动相是pH9.0~9.5的乙酸盐缓冲液并且纯的蔗糖-6-乙酸酯流分 被分离并进行进一步浓缩和除水。彻底除水后,蔗糖-6-乙酸酯被加入到DMF 中并用于进行氯化。
分离的蔗糖-6-乙酸酯是90%纯度的,被用于制备TGS。
实施例3、利用固定在Eudragit RL 100(
丙烯酸树脂的共聚物)上的 Aureobasidium细胞将葡萄糖-6-乙酸酯转变成蔗糖-6-乙酸酯
利用下述方法将Aureobasidium细胞固定在Eudragit RL100。
通过混和将350g经离心后分离的Aureobasidium细胞包埋到350g藻酸钠 中并压成珠。然后将这些珠涂覆一种聚丙烯酸树脂共聚物,Eudragit RL 100。
取100g葡萄糖-6-乙酸酯和380g蔗糖用于反应。将反应物溶解在1.2L pH6.5~7.0的乙酸钠缓冲液中。保持搅拌该溶液。将175g在Eudragit RL100 上固定化的Aureobasidium细胞加入到该溶液中并且将温度稍微升高至 45℃。
通过HPLC监测蔗糖-6-乙酸酯的形成。反应时间为75h后,在反应混合 物中记录到52g蔗糖-6-乙酸酯生成。该反应进一步进行直到100h并且62g蔗 糖-6-乙酸酯完成转变,这占起始蔗糖的32%。
过滤反应的内含物以除去悬浮细胞然后利用反渗透分离进行蔗糖-6-乙酸 酯的分离。RO膜分离所有较低分子量的化合物(例如葡萄糖和果糖)而较高 分子量的化合物被留下。被留下的化合物然后再一次用1∶5倍的水稀释并以 500道尔顿分子量截流进行纳米过滤,并且收集渗出物,其主要是蔗糖-6-乙 酸酯和其它分子量在350~400道尔顿的化合物。这些化合物再次进行RO过 滤以浓缩它们至浓度大于20%。在此蔗糖-6-乙酸酯的纯度是大约85%并且然 后上样到硅化的硅胶柱上。
使用的移动相是pH9.0~9.5的乙酸盐缓冲液并且纯的蔗糖-6-乙酸酯流分 被分离并进行进一步浓缩和除水。彻底除去水以后,蔗糖-6-乙酸酯被加入到 DMF中并用于进行氯化。该分离的92%纯度的蔗糖-6-乙酸酯用于制备 TGS。
实施例4、用Vilsmeier试剂氯化蔗糖-6-乙酸酯以产生TGS
在3L反应烧瓶中,放置275ml二甲基甲酰胺并冷却到0~5℃。然后在 搅拌下缓慢加入158g五氯化磷以形成Vilsmeier试剂,保持该反应物料的温 度低于30℃。该物料进一步冷却至低于0℃并且在0~5℃缓慢加入实施例1 制备的蔗糖-6-乙酸酯。然后加热反应物料至80℃并保持1h,进一步加热至 100℃并保持6h以及最终至110~115℃并保持2~3h。通过HPLC分析监测 反应
进程。
然后,将反应混合物冷却到-5~-8℃并且缓慢加入20%氢氧化钠溶液以 便将物料的pH升到5.5~6.5。进行这步以保持产物为乙酸酯形式,这有利于 所需产物分配到有机溶剂中。利用此方法获得的产率是42.3%的蔗糖-6-乙酸 酯输入。
实施例5、利用固定在Eudragit RL 100(丙烯酸树脂的共聚物)上的 Aureobasidium细胞将葡萄糖-6-苯
甲酸酯转变成蔗糖-6-
苯甲酸酯
在pH6.5的乙酸钠缓冲液中制备3%的葡萄糖-6-苯甲酸酯溶液 (600ml)。使用
蠕动泵将这一溶液泵到填充了12g含有Aureobasidium细胞 的Eudragit RL 100的柱中(2cm直径×8cm高)。从柱中的出口循环到供料 烧瓶。保持5ml/min的流速。将60g蔗糖加入供料烧瓶并且溶解以及保持恒 定的搅拌。
反应持续36h,周期性分析葡萄糖-6-苯甲酸酯到蔗糖-6-苯甲酸酯的转变 以及其它杂质的生成。在36h最后,形成1.2g蔗糖-6-苯甲酸酯并且停止该反 应。在溶液中的葡萄糖-6-乙酸酯估计量被发现小于1%并且通过加入新鲜的 葡萄糖-6-乙酸酯其可以达到3%。将pH也调节到6.5并且继续反应。这再次 导致在72h最后转变高达3.6g的蔗糖-6-苯甲酸酯。