生物精炼系统、其方法和组合物
阅读：1011发布：2020-06-02
专利汇可以提供生物精炼系统、其方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及生产 生物 燃料 的 生物工程 方法，并且具体地涉及使用C1代谢微 生物反应器 系统将诸如甲烷或甲醇的C1底物转 化成 生物质 并且随后转化成 生物燃料 、生物塑料，等等。，下面是生物精炼系统、其方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种重组C1代谢非光合微生物，其中所述重组C1代谢非光合微生物包含编码硫酯酶、丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶、乙酰基-CoA羧化酶或其任何组合的异源多核苷酸，且其中与亲本C1代谢非光合微生物相比，所述异源多核苷酸的表达在所述重组C1代谢非光合微生物中引起增加水平的脂肪酸的积累，其中所述C1代谢非光合微生物是选自荚膜甲基球菌Bath(Methylococcus capsulatus Bath)、发孢甲基弯菌OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b)、甲基单胞菌属16a(Methylomonas sp.16a)、生孢甲基弯菌(Methylosinus sporium)、小甲基孢囊菌(Methylocystis parvu)、甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica)、白色甲基单胞菌(Methylomonas albus)、荚膜甲基细菌Y(Methylobacter capsulatus Y)、鞭毛甲基单胞菌(Methylomonas flagellata)、极端嗜酸甲烷氧化菌(Methylacidiphilum infernorum)、嗜碱甲基微菌(Methylomicrobium alcaliphilum)或其高度生长变异体的专性甲烷营养菌。
2.根据权利要求1所述的重组C1代谢非光合微生物，其中所述硫酯酶针对所述C1代谢非光合微生物进行密码子优化。
3.根据权利要求2所述的重组C1代谢非光合微生物，其中所述丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶是密码子优化的大肠杆菌fabD。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组C1代谢非光合微生物，其中所述乙酰基-CoA羧化酶是密码子优化的大肠杆菌accA、accB、accC、accD或其任何组合。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的重组C1代谢非光合微生物，其中所述重组C1代谢微生物进一步包含最小化或消除脂肪酸-CoA连接酶活性的突变。
6.根据权利要求1所述的重组C1代谢非光合微生物，其中所述甲烷营养菌选自荚膜甲基球菌Bath(Methylococcus capsulatus Bath)、甲基单胞菌属16a(Methylomonas sp.16a)或发孢甲基弯菌OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组C1代谢非光合微生物的生物质，其中所述生物质的δ13C在-40‰到-60‰的范围内。
8.根据权利要求7所述的生物质，其中所述生物质包含(a)权利要求1的所述重组C1代谢非光合微生物的培养物以及所述重组C1代谢非光合微生物生长所处的培养基；(b)从所述培养基生长并回收的所述重组C1代谢非光合微生物；或(c)从所述重组C1代谢非光合微生物的培养物回收的消耗的培养基上清液组合物。
9.根据权利要求8所述的生物质，其中油组合物是从(c)所述消耗的培养基上清液组合物中提取或浓缩。
10.制备油组合物的方法，所述方法包括：
(i)通过分批或连续培养在C1底物上生长权利要求1-6中任一项的重组C1代谢非光合微生物；和
(ii)从所述重组C1代谢非光合微生物的细胞膜提取所述油组合物或从培养物上清液回收所述油组合物，或其组合。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述油组合物包含含氢和碳原子的分子，其中所
13
述氢和碳原子是所述组合物的重量的至少50％并且其中所述油组合物的δ C在-70‰到-
30‰的范围内。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述油组合物包含超过50％w/w的类萜化合物或类异戊二烯化合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述类萜化合物是法呢烯、柠檬烯或二者。
14.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其进一步包括通过氢化处理以生产喷气燃料、柴油或其组合来精炼所述油组合物，其中所述氢化处理产生轻质烃，其选自甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、丁醇和/或异丁醇。
15.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述C1底物是天然气、甲烷或甲醇。
16.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述重组C1代谢非光合微生物在生物反应器中培养。
17.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述重组C1代谢非光合微生物在包含培养基的生物反应器中培养，所述培养基具有有限量的磷、氮、微量元素、氧或其任何组合。
生物精炼系统、其方法和组合物
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[0003] 发明背景
技术领域
[0005] 相关技术描述
[0006] 随着化石燃料矿床的消耗不断增加、温室气体的产生增加以及最近关于气候变化的关注，用生物燃料(例如，乙醇、生物柴油)替代化石燃料已经变成行业的焦点。但是，迄今产生的生物燃料具有其自身的困难和问题。第一代生物燃料来源于植物(例如，淀粉；蔗糖；以及玉米、油菜籽、大豆、棕榈和其它植物油)，但这些燃料作物与种植用于人类和动物消耗的作物相竞争。可用的农用土地的量不足以满足全球食物与燃料需求。因此，第二代生物燃料是从例如纤维素或海藻产生。但是，在生产方面的技术困难以及高的生产成本没有使第二代生物燃料更有成本效益或更易获取。
[0007] 需要从替代性原料(即，不是糖、玉米、海藻)制成的第三代或下一代生物燃料。在这点上，甲烷是最丰富的国内碳原料之一并且主要来源于天然气。甲烷的国内产量的最近上升(从2006年每天48bft3到2012年每天65bft3)已经驱使天然气的成本达到记录低点(从2006年约$14.00/MMBTU到2012年约$2.50/MMBTU)。国内天然气主要通过水力压裂(“液压破碎(fracking)”)产生，但甲烷还可以从其它来源获得，如填埋场和污物。另外，捕获甲烷来源将具有显著的环境效益，因为甲烷相对于CO2具有大23倍的温室气体贡献。
[0008] 但是，甲烷的挥发性使得运输和作为燃料直接使用成问题。出于这个原因，有很强的动力去将气体转化成液体形式以使得容易运输到使用点。当前正在推行两种主要方法：液化以得到液化天然气(LNG)和化学转化以使气体转化成液体(GTL)(Patel,7th World Congress of Chemical Engineering,Glasgow,Scotland,UK,2005)。费希尔-特罗普希(Fischer-Tropsch；F-T)工艺是当前最为普遍的GTL方法用于将来自天然气的甲烷转化成更高级的烃(Patel,2005)。注意，F-T工艺采用合成气作为输入，其通过蒸汽重整从天然气产生(合成气还可以来源于煤的气化，通过与水和氧气进行高温反应)。F-T工艺得到与当今的燃料供给一致的石油产品，但具有许多缺陷，包括低产量、较差选择性(使得下游利用变复杂)，并且需要相当大的资本支出和规模来实现经济生产(Spath和Dayton,2003年12月NREL/TP-510-34929)。F-T设备所需的极大规模(典型设备的资本成本超过$2B[Patel,
2005])还代表了由于需要大量甲烷原料供给这种设备的连续操作而引起的显著限制。因为甲烷运输在大多数情况下是极其昂贵的，所以这种设备必须与大型气源或管线共同定位。
额外的成本和比例因子是气体洗涤技术的经济学(Spath和Dayton,2003)，因为F-T催化剂对天然气中经受住合成气转化工艺的常见污染物高度敏感。
2005])还代表了由于需要大量甲烷原料供给这种设备的连续操作而引起的显著限制。因为甲烷运输在大多数情况下是极其昂贵的，所以这种设备必须与大型气源或管线共同定位。
额外的成本和比例因子是气体洗涤技术的经济学(Spath和Dayton,2003)，因为F-T催化剂对天然气中经受住合成气转化工艺的常见污染物高度敏感。
[0009] 自从1938年以来，F-T设备已经处于半连续操作中。考虑到上文所讨论的甲烷的当前可用性和价格，数家公司当前正在研究引入新的设备。然而，尽管在过去的70多年来有重大的研究和发展，但F-T技术的限制阻碍了商业的GTL工艺的广泛采用。即时获取大体积的洁净气体的需求与大规模的资本投资组合，当前将基于天然气的F-T设备限制于只有在全世界几个场所中成功操作(Spath和Dayton,2003)。GTL或LNG设备的高的最低处理需求与高的运输成本组合，使得较小的甲烷来源被称作‘闲置’气体(例如，在离岸油井生产的天然气，或来自填埋场的甲烷废气)。在当前不存在有效的小规模转化技术的情况下，所述闲置气体来源通常被通到大气中或向外展开，因为甲烷积累呈现出重大的安全风险。
[0010] 鉴于与第一代、第二代和下一代生物燃料的生产相关的限制，在本领域中明确地需要有效地并且有成本效益地生产替代性燃料而不会加重环境负担或与食物生产相竞争的新方法。本发明通过提供使用生物工程生产生物燃料和其它产品的有效的并且有成本效益的方法来解决这个问题。
[0011] 发明概述
[0012] 在一个方面，本公开提供了一种通过精炼来源于C1代谢非光合微生物的油组合物(例如，在精炼单元中)以生产燃料来制造燃料的方法。另外，本公开提供了一种通过将来自主要包含C1代谢非光合微生物的培养物的生物质转化成油组合物并且将这种油组合物精炼成燃料来制造燃料的方法。在另一个方面，本公开提供了一种生物精炼厂，其包括：处理单元，其中油组合物来源于C1代谢非光合微生物；以及精炼单元，用于精炼这种油组合物以生产燃料。在另一个方面，本公开提供了一种油组合物或生物燃料组合物，其具有包含氢和碳原子的分子，其中这些氢和碳原子是组合物的重量的至少约50％到约99％并且其中组合物的δ13C在约-35‰到约-50‰、-45‰到约-35‰、或约-50‰到约-40‰、或约-45‰到约-65‰、或约-60‰到约-70‰、或约-30‰到约-70‰的范围内。
[0013] 在某些实施方案中，本公开提供了C1代谢微生物，其为原核生物或细菌，如甲基单胞菌(Methylomonas)、甲基细菌(Methylobacter)、甲基球菌(Methylococcus)、甲基弯菌(Methylosinus)、甲基孢囊菌(Methylocystis)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲烷单胞菌(Methanomonas)、嗜甲基菌(Methylophilus)、甲基菌(Methylobacillus)、甲基杆菌(Methylobacterium)、生丝微菌(Hyphomicrobium)、黄色杆菌(Xanthobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、副球菌(Paracoccus)、诺卡氏菌(Nocardia)、节杆菌(Arthrobacter)、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)或假单胞菌(Pseudomonas)。在其它实施方案中，C1代谢细菌是甲烷营养菌或甲基营养菌。示范性的甲烷营养菌包括甲基单胞菌、甲基细菌、甲基球菌、甲基弯菌、甲基孢囊菌、甲基微菌、甲烷单胞菌或其组合。
[0014] 示范性的甲烷营养菌种类包括甲基单胞菌属(Methylomonas sp.)16a(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b(NRRL B-11,196)、生孢甲基弯菌(Methylosinus sporium)(NR RL B-11,197)、小甲基孢囊菌(Methylocystis parvus)(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica)(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(Methylomonas albus)(NRRL B-11,200)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)Bath(NCIMB 11132)、荚膜甲基细菌(Methylobacter capsulatus)Y(NRRL B-
11,201)、嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属AJ-3670(FERM P-2400)、嗜碱甲基微菌(Methylomicrobium alcaliphilum)、森林甲基胞菌(Methylocella silvestris)、极端嗜酸甲烷氧化菌(Methyla cidiphilum
infernorum)、培氏甲基菌(Methylibium petroleiphilum)、荚膜甲基球菌Bath或其高度生长变异体。
11,201)、嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属AJ-3670(FERM P-2400)、嗜碱甲基微菌(Methylomicrobium alcaliphilum)、森林甲基胞菌(Methylocella silvestris)、极端嗜酸甲烷氧化菌(Methyla cidiphilum
infernorum)、培氏甲基菌(Methylibium petroleiphilum)、荚膜甲基球菌Bath或其高度生长变异体。
[0015] 示范性的甲基营养菌种类包括扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)、白杨甲基杆菌(Methylobacterium populi)、氯甲烷甲基杆菌(Methylobacterium chloromethanicum)、结瘤甲基杆菌(Methylobacterium nodulans)或其组合。
[0016] 在其它实施方案中，本公开提供了C1代谢微生物，其为合成气代谢细菌，如梭菌(Clostridium)、穆尔氏菌(Moorella)、火球菌(Pyrococcus)、真细菌(Eubacterium)、脱硫杆菌(Desulfobacterium)、一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus)、产醋菌(Acetogenium)、醋酸杆菌(Acetobacterium)、厌氧醋菌(Acetoanaerobium)、丁酸杆菌(Butyribaceterium)、消化链球菌(Peptostreptococcus)或其任何组合。示范性的合成气代谢细菌包括产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahli)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxydivorans)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏梭菌(Clostridium woodii)、产丙醇梭菌(Clostridium neopropanologen)或其任何组合。
[0017] 在某些其它实施方案中，C1代谢微生物是真核生物，如酵母，包括假丝酵母(Candida)、耶氏酵母(Yarrowia)、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia)、球拟酵母(Torulopsis)或红酵母(Rhodotorula)。
[0018] 在其它实施方案中，C1代谢非光合微生物是重组微生物，其包含编码脂肪酸产生酶、甲醛同化酶或其组合的异源多核苷酸。在某些实施方案中，异源多核苷酸编码硫酯酶、丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶、乙酰基-CoA羧化酶或其任何组合。举例来说，硫酯酶可以是缺乏周质靶向序列的密码子优化的大肠杆菌tesA；丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶可以是密码子优化的大肠杆菌fabD；并且乙酰基-CoA羧化酶可以是密码子优化的大肠杆菌accA、accB、accC、accD或其任何组合。在某些其它实施方案中，C1代谢微生物进一步包含最小化或消除脂肪酸-CoA连接酶活性的突变。
[0020] 图1示出了根据本公开的某些实施方案，用于甲烷捕获并转化成烷烃燃料的C1代谢微生物反应器系统的示范性的概念模型。
[0021] 图2示出了根据本公开的某些实施方案，用于甲烷捕获并转化成生物柴油的C1代谢微生物反应器系统的示范性的概念模型。
[0022] 图3A和3B示出了表达TesA'(来自周质靶向序列被去除的大肠杆菌的TesA基因)的重组荚膜甲基细菌使得(A)游离脂肪酸的产生增加，以及(B)这种增加主要是由于C16:0和C18:0脂质的水平升高。
[0024] 图5A和5B示出了在使用含KOH的甲苯:甲醇进行水解和酯基转移之前(A)和之后(B)从荚膜甲基球菌(M.capsulatus)提取的油组合物的GC/MS色谱图。
[0025] 图6A和6B示出了在使用含KOH的甲苯:甲醇进行水解和酯基转移之前(A)和之后(B)从甲基单胞菌属16a提取的油组合物的GC/MS色谱图。
[0026] 图7示出了多种碳源的δ13C分布的示意图。
[0027] 发明详述
[0028] 本公开提供了用于产生生物燃料和生物塑料的组合物、方法和系统，其中C1代谢微生物经过培养以产生生物油积累达到最大的生物质。举例来说，提供了甲烷到生物燃料的发酵工艺，其为可扩展的商业化工艺。这种新的方法可以使用例如甲基营养菌或甲烷营养菌细菌作为新的宿主系统来产生生物质，用于呈例如酯化生物柴油形式的生物燃料或供氢化处理用的烷烃燃料，或用于呈聚羟基烷酸酯(polyhydroalkanoate；PHA)形式的生物塑料。此外，所关注的油组合物可以获自甲基营养菌或甲烷营养菌细菌，因为这些生物体可以在本文所描述的条件下积累大量的膜脂质，并且此外，这些微生物产生高的膜内容物。
[0029] 作为背景，来自包括天然气的多种来源的甲烷代表了丰富的国内资源。开发气转液(GTL)技术以改善甲烷作为燃料的用途的化学方法尽管投入相当大，但迄今只获得了有限的成功。相比之下，花费了极少的努力来采用现代的生物工程方法用于GTL工艺开发。若干限制，最显著的是糖原料的成本，已经阻碍了使用微生物系统进行的生物燃料的经济生产。开采不昂贵的、国内丰富的碳原料(如甲烷)代表了经济上可持续的生物燃料生产的替代物。已经使用新的生物工程工具和技术开发新的生产微生物来提供如本文所描述的工业规模的GTL生物工艺。此外，在经过提取的脂质精炼和升级之后的燃料特性展现出用于如柴油、汽油、喷气燃料或烯烃等应用的附带潜力。
[0030] 在一个方面，本公开提供了一种通过在精炼单元中精炼来源于C1代谢非光合微生物的油组合物以生产燃料来制造燃料的方法。另外，本公开提供了一种通过将来自主要包含C1代谢非光合微生物的培养物的生物质转化成油组合物并且将这种油组合物精炼成燃料来制造燃料的方法。在另一个方面，本公开提供了一种生物精炼厂，其包括：处理单元，其中油组合物来源于C1代谢非光合微生物；以及精炼单元，用于精炼这种油组合物以生产燃料。
[0031] 在另一个方面，本公开提供了一种油组合物或来源于其的生物燃料组合物，其具有包含氢和碳原子的分子，其中这些氢和碳原子是组合物的重量的至少约50％到约99％并且其中组合物的δ13C小于-30‰或在约-70‰到约-35‰的范围内，或当与燃料组分掺合以生产燃料产品时，在约-37‰到约-10‰的范围内。在一个相关的方面，本公开提供了一种生物质，其δ13C小于-30‰或在约-35‰到约-50‰、-45‰到约-35‰、或约-50‰到约-40‰、或约-45‰到约-65‰、或约-60‰到约-70‰、或约-30‰到约-70‰的范围内。
[0032] 在更详细地阐述本公开之前，提供用于本文中的某些术语的定义可以有助于理解本公开。额外的定义在本公开通篇加以阐述。
[0033] 在本说明书中，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所叙述的范围内的任何整数的值，并且适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。而且，除非另有指示，否则本文所叙述的关于任何物理特征(如聚合物子单元、大小或厚度)的任何数值范围应理解为包括在所叙述的范围内的任何整数。除非另有指示，否则如本文所用的术语“约”意味着所指示的范围、值或结构的±20％。术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限于指定的物质或步骤，或限于不会实质性地影响所要求的本发明的基本和新颖特征的那些。应了解，如本文所用的术语“一(a/an)”指的是所列举的组分中的“一者或多者”。替代物的使用(例如，“或”)应理解为意味着替代物中的一者、两者或其任何组合。如本文所用的术语“包括”、“具有”和“包含”同义地使用，这些术语和其变型打算被解释为非限制性的。
[0034] 如本文所用的“C1底物”或“C1化合物”指的是缺乏碳碳键的任何含碳分子或组合物。示范性的C1底物包括天然气、非常规天然气、合成气、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸或其盐、一氧化碳、二氧化碳、甲基化胺(例如，甲胺、二甲胺、三甲胺，等等)、甲基化硫醇、甲基卤(例如，溴甲烷、氯甲烷、碘甲烷、二氯甲烷，等等)、氰化物或其任何组合。
[0035] 如本文所用的“C1代谢微生物”或“C1代谢非光合微生物”指的是具有使用C1底物作为能量来源或作为其能量和生物质的主要来源的能力的任何微生物，并且可能使用或可能不使用其它碳底物(例如糖和复合碳水化合物)用于能量和生物质。举例来说，C1代谢微生物可以氧化C1底物，如甲烷或甲醇。C1代谢微生物包括细菌(如甲烷营养菌和甲基营养菌)和酵母。在某些实施方案中，C1代谢微生物不包括光合微生物，如海藻。在某些实施方案中，C1代谢微生物将为“专性C1代谢微生物”，这意味着其唯一的能量来源是C1底物。在其它实施方案中，C1代谢微生物(例如，甲烷营养菌)将在C1底物原料存在下进行培养(即，使用C1底物作为能量来源)。
[0036] 如本文所用的术语“甲基营养细菌”指的是能够氧化含有至少一个碳并且不含碳碳键的呈任何形式(例如，固体、液体、气体)的任何化合物的任何细菌。在某些实施方案中，甲基营养细菌可以是甲烷营养菌。举例来说，“甲烷营养细菌”指的是具有氧化作为碳和能量的来源的甲烷的能力的任何甲基营养细菌，甲烷可以是碳和能量的主要来源。示范性的甲烷营养细菌包括甲基单胞菌、甲基细菌、甲基球菌、甲基弯菌、甲基孢囊菌、甲基微菌或甲烷单胞菌。在某些实施方案中，甲基营养细菌是“专性甲基营养细菌”，其指的是限于使用C1底物用来产生能量的细菌。在某些实施方案中，甲基营养细菌是“兼性甲烷营养细菌”，其除了作为其碳和能量来源的C1底物以外天然地能够使用多碳底物，如乙酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐或乙醇。兼性甲烷营养菌包括甲基胞菌(Methylocella)、甲基孢囊菌、甲基荚膜菌(Methylocapsa)的一些种类(例如，森林甲基胞菌、沼泽甲基胞菌(Methylocella palustris)、冻原甲基胞菌(Methylocella tundrae)、道氏甲基孢囊菌(Methylocystis daltona)SB2、苔藓甲基孢囊菌(Methylocystis bryophila)和金色甲基荚膜菌(Methylocapsa aurea)KYG)，以及嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)。
[0037] 如本文所用的术语“CO利用细菌”指的是天然地具有氧化作为碳和能量的来源的一氧化碳(CO)的能力的细菌。一氧化碳可以从“合成气(synthesis gas/syngas)”利用，合成气是通过气化任何有机原料而产生的一氧化碳与氢气的混合物，这种有机原料如煤、煤油、天然气、生物质或废有机物质。CO利用细菌不包括必须经过遗传修饰用于在作为其碳源的CO上生长的细菌。
[0038] 如本文所用的“合成气”指的是包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)的混合物。合成气还可以包括CO2、甲烷，以及相对于CO和H2来说较小量的其它气体。
[0039] “生长”被定义为细胞团块的增大。这可以经由在“平衡生长”期间或在“非平衡生长”期间细胞分裂(复制)以及形成新的细胞而发生，在“非平衡生长”时细胞团块由于特定化合物或聚合物(如某些脂质)的积累而增大。在后一种情况下，生长可以表现为细胞大小由于细胞内生物聚合物的积累而增大。
[0040] 在“平衡细胞生长”期间，所有原料(电子供体和电子受体)和所有营养素都按制造细胞的所有大分子组分所需的比率存在。就是说，没有原料或营养素限制蛋白质、复合碳水化合物聚合物、脂肪或核酸的合成。相比之下，在“非平衡细胞生长”期间，制造细胞的大分子中的一者或多者所需的原料或营养素不按平衡生长所需的量或比率存在。因此，这种原料或营养素成为限制并且被称作“限制营养素”。
[0041] 一些细胞可能在非平衡条件下仍然实现净生长，但这种生长是非平衡的并且在不存在限制原料或营养素的情况下可以合成的聚合物将会积累。这些聚合物包括脂质或细胞内储存产物，如聚羟基烷酸酯(PHA)，包括聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基戊酸酯(PHV)和聚羟基己酸酯(PHHx)-糖原，或分泌的物质，如细胞外多糖。所述油组合物适用于生产生物塑料。
[0042] 示范性的平衡和非平衡生长条件可能在培养基中的氮含量方面有所不同。举例来说，氮占细胞干重的约12％，这意味着必须供给12mg/L的氮(例如，以硝酸盐或铵盐形式，连同按所需化学计量比的原料和其它营养素一起)以供100mg/L的细胞干重生长。在不希望受理论束缚下，这假定了将大气氮固定到氨中(即，经由氮固定)并不代表用于生物合成中间物或细胞成分的重要氮源。如果其它原料和营养素按生产100mg/L的细胞干重所需的量可用，但提供小于12mg/L的氮，那么可能发生非平衡细胞生长，其中不含氮的聚合物积累。如果随后提供氮，那么所储存的聚合物可以充当细胞的原料，从而允许平衡生长，其中新的细胞复制并产生。
[0043] 如本文所用，应用于细胞或微生物的术语“生长周期”指的是细胞或微生物在培养条件下所经过的代谢周期。举例来说，这个周期可以包括多种阶段，如停滞期、指数期、指数期结束和静止期。
[0044] 术语“指数生长”、“指数期生长”、“对数期”或“对数期生长”指的是微生物生长和分裂的速率。举例来说，在对数期期间，微生物以其最大速率生长，这是考虑到其遗传潜力、培养基的性质以及其生长所处的条件。微生物的生长速率在指数期期间是恒定的，并且微生物按规律的时间间隔分裂和加倍。“活跃地生长”的细胞是在对数期中生长的那些细胞。相比之下，“静止期”指的是在生长周期中培养物的细胞生长减缓或甚至停止的点。术语“生长改变环境”指的是具有抑制细胞生长或杀死细胞的能力的能量、化学品或活物。抑制剂可以包括诱变剂、药物、抗生素、UV光、极端温度、pH、代谢副产物、有机化学品、无机化学品、细菌、病毒，等等。
[0045] 如本文所用的“高度生长变异体”指的是能够与作为唯一或主要的碳和能量来源的C1底物(如甲烷或甲醇)一起生长的生物体、微生物、细菌、酵母或细胞，并且其具有比亲本、参考或野生型生物体、微生物、细菌、酵母或细胞更快的指数期生长速率-就是说，高度生长变异体与亲本细胞相比具有更快的倍增时间并且因此每克代谢的C1底物的细胞团块的生长速率和产量很高(参看例如美国专利号6,689,601)。
[0046] 如本文所用的“生物燃料”指的是至少部分来源于“生物质”的燃料。
[0047] 如本文所用的“生物质”或“生物物质”指的是具有生物起源的有机物质，其可以包括全细胞、溶解的细胞、细胞外物质等等中的一者或多者。举例来说，从经过培养的微生物(例如，细菌或酵母培养物)收集的物质被视为生物质，其可以包括细胞、细胞膜、细胞质、包涵体、分泌或排泄到培养基中的产物，或其任何组合。在某些实施方案中，生物质包含本公开的C1代谢微生物以及本公开的C1代谢微生物生长所处的培养基。在其它实施方案中，生物质包含从C1底物(例如，天然气、甲烷)上生长的培养基回收的本公开的C1代谢微生物(全的或溶解的或两者)。在其它实施方案中，生物质包含来自在C1底物上培养的C1代谢微生物的培养物的消耗的培养基上清液。这种培养物可以被视为可再生资源。
[0048] 如本文所用的“油组合物”指的是生物质(例如，细菌培养物)的脂质内容物，包括脂肪酸、脂肪酸酯、三酸甘油酯、磷脂、聚羟基烷酸酯、异戊二烯、萜烯，等等。生物质的油组合物可以通过本文所描述的方法，例如通过己烷或氯仿提取，从生物质物质的其余部分提取。另外，“油组合物”可以在培养物的任何一个或多个区域中发现，包括细胞膜、细胞质、包涵体、分泌或排泄到培养基中的物质，或其任何组合。油组合物既不是天然气也不是原油。
[0049] 如本文所用的术语“宿主”指的是细胞或微生物(例如，甲烷营养菌)，其可以用外源核酸分子进行遗传修饰以产生所关注的多肽(例如，硫酯酶[tesA]、乙酰基-CoA羧化酶[accABCD]、丙二酰基-CoA-ACP转酰酶[fabD])。在某些实施方案中，宿主细胞可以任选地已经具有或经过修饰而包括赋予与脂质生物合成有关或无关的所需特性的其它遗传修饰(例如，缺失、改变或截短的长链脂肪酸-CoA连接酶[fadD])。举例来说，宿主细胞可以具有最小化或减少脂肪酸的降解，最小化或减少宿主细胞生长抑制剂的产生，提供高度生长、污染物耐受性或特定培养条件(例如，耐酸性、杀生体抗性)、代谢额外的碳底物的能力或合成其它所需的产物或中间物的能力的遗传修饰。
[0050] 如本文所用的“重组”或“非天然”指的是具有至少一个遗传变化或已经通过引入异源核酸分子而修饰的生物体、微生物、细胞、核酸分子或载体，或指的是已经被改变以使得内源核酸分子或基因的表达可以受控制的细胞。重组还指的是来源于具有一个或多个所述修饰的细胞或是这种细胞的子代的细胞。遗传变化包括例如引入编码蛋白质或酶的可表达的核酸分子的修饰，或其它核酸分子的添加、缺失、取代或细胞遗传物质的其它功能变化。举例来说，重组细胞可以表达在原生细胞(即，未经修饰或野生型细胞)内不会以相同的形式发现的基因或其它核酸分子，或可以提供内源基因的改变的表达形式，所述基因可能以其它方式过度表达、不足表达、最低表达或根本不表达。
[0051] 用于在微生物生物体中表达外源或异源核酸的重组方法在本领域中是众所周知的。所述方法可以发现描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；以及Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)中。将要表达的示范性的外源蛋白质或酶包括硫酯酶、一种或多种乙酰基-CoA羧化酶、丙二酰基-CoA-ACP转酰酶或其任何组合。对编码酶的核酸分子或其功能片段的遗传修饰可以向从天然存在的状态改变的重组细胞赋予生物化学或代谢能力。
[0052] 如本文所用的术语“内源”或“原生”指的是通常存在于宿主细胞中的基因、蛋白质、化合物或活性。术语“同源”或“同源物”指的是来自外源(非原生)来源的分子或活性，其与宿主细胞、种类或菌株中所发现的或来源于宿主细胞、种类或菌株的分子或活性相同或类似。
[0053] 如本文所用的“异源”核酸分子、构筑体或序列指的是对于表达其的细胞而言并非原生的核酸分子或核酸分子序列的一部分，对于已经被改变或突变的宿主细胞而言原生的核酸分子或核酸分子的一部分，或在类似条件下与原生的表达水平相比具有改变的表达的核酸分子。举例来说，异源控制序列(例如，启动子、增强子)可以用于以与通常在自然界或培养物中表达的基因或核酸分子不同的方式调控基因或核酸分子的表达。在某些实施方案中，异源核酸分子可以与原生宿主细胞基因同源，但可能具有改变的表达水平或具有不同的序列，或两者。在其它实施方案中，异源或外源核酸分子可能对于宿主细胞或宿主基因组而言并非内源的，而是可以通过接合、转化、转染、电穿孔等等添加到宿主细胞中，其中所添加的分子可以合并到宿主基因组中或可以作为染色体外遗传物质(例如，质粒或其它自主复制载体)存在。
[0054] 在某些实施方案中，多于一个异源或外源核酸分子可以作为独立的核酸分子、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单一核酸分子或其任何组合而被引入到宿主细胞中，并且仍然被视为多于一个异源或外源核酸。举例来说，C1代谢微生物可以经过修饰以表达两个或更多个可能相同或不同的异源或外源核酸分子，其编码一个或多个如本文所公开的硫酯酶。在某些实施方案中，硫酯酶(TE)编码多核苷酸分子的多个拷贝被引入到宿主细胞中，其可以是相同TE或不同TE编码多核苷酸的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个拷贝。
[0055] 当两个或更多个外源核酸分子被引入到宿主C1代谢微生物中时，应了解，两个以上外源核酸分子可以作为单一核酸分子(例如，在单一载体上)引入，在独立的载体上引入，在单一位点或多个位点处合并到宿主染色体中，并且这些实施方案中的每一者仍然被视为两个或更多个外源核酸分子。因此，所提及的异源核酸分子或蛋白质活性的数目指的是编码核酸分子的数目或蛋白质活性的数目，而不是引入到宿主细胞中的独立的核酸分子的数目。
[0056] 两个或更多个核酸序列之间的“一致性百分比”是序列所共有的相同位置的数目的函数(即，一致性％＝相同位置的数目/位置的总数×100)，这将间隙的数目以及需要引入以优化两个或更多个序列的比对的每个间隙的长度考虑在内。序列的比较以及两个或更多个序列之间的一致性百分比的确定可以使用数学算法来实现，如处于默认参数下的BLAST和Gapped BLAST程序(例如，Altschul等,J.Mol.Biol.215:403,1990；还参看BLASTN，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。
[0057] “保守取代”在本领域中被公认为一个氨基酸取代具有类似特性的另一个氨基酸。示范性的保守取代在本领域中是众所周知的(参看例如WO 97/09433,第10页；Lehninger,Biochemistry,第2版；Worth Publishers,Inc.NY:NY(1975),第71-77页；Lewin,Genes IV,Oxford University Press,NY and Cell Press,Cambridge,MA(1990),第8页)。
[0058] 如本文所用的“过度表达”当涉及基因或蛋白质时，意味着基因或蛋白质的表达或活性的增加。增加的表达或活性包括基因或蛋白质的表达或活性增加到高于野生型(未经遗传工程改造)对照或参考微生物的水平。如果在基因或蛋白质通常不会表达或没有活性的微生物中存在表达或活性，那么这种基因或蛋白质就过度表达。如果表达或活性在重组微生物中相比在野生型对照或参考微生物中有所延长或存在更长时间，那么基因或蛋白质就过度表达。
[0059] 如本文所用的“抑制”或“受抑制”指的是靶基因的表达或靶分子(例如，长链脂肪酸-CoA连接酶)的活性相对于对照、内源或参考分子直接或间接地改变、降低、下调、消除或缺失，其中这种改变、降低、下调或消除在统计上、生物学上、工业上或临床上是显著的。
[0060] 如本文所用的“生物精炼厂”指的是将生物质转化工艺和装置一体化以从生物质生产燃料的工厂。
[0061] 如本文所用的“精炼厂”指的是炼油厂或其各个方面，在此可以处理油组合物(例如，生物质、生物燃料或化石燃料，如原油、煤或天然气)。在所述精炼厂中进行的示范性的工艺包括裂化、酯基转移、重整、蒸馏、加氢处理、异构化或其任何组合。
[0062] 生物燃料生产系统
[0063] 本公开的用于产生生物燃料的系统可以包括独立单元(例如，彼此接近或相邻，或并不如此)、一体化单元，或系统本身可以互连并且部分或完全一体化。本公开的系统可以使用来自在一体化生物精炼厂中生长的微生物的生物质来产生燃料组合物和燃料产品，特别是生物燃料。在某些实施方案中，生物精炼厂使用单一生物质或混合生物质来产生燃料(例如，柴油燃料、喷气燃料、汽油)，如C1代谢微生物(例如，甲烷营养菌，如发孢甲基弯菌OB3b、荚膜甲基球菌Bath、甲基单胞菌属16a、甲烷甲基单胞菌、嗜碱甲基微菌或其高度生长变异体)作为生物质。
[0064] 图1中图解了示范性的生物精炼系统。这种系统可以执行以下步骤中的一者或多者：培养所关注的微生物菌株(例如，甲烷营养菌、甲基营养菌或酵母)，这种菌株可以具有一种或多种改善的特性(例如，重组、较高生长速率、在高pH下生长的能力、改善的营养素利用率、温度稳定性、增加的生物质产量)；从微生物回收产品，如油组合物(例如，脂肪酸、三酸甘油酯、磷脂、异戊二烯、萜烯、PHA或其任何组合)；以及精炼油组合物以生产塑料前体或一种或多种燃料，如喷气燃料、柴油燃料、汽油或其组合。不同的生物燃料组合物和产品可以由这种系统同时或连续地生产。举例来说，这种系统可以包括氢化处理设备或单元，其可以将油组合物转化成喷气燃料和柴油。这种系统还可以包括石油精炼厂，其可以将原油和来自氢化处理设备的产品转化成汽油。举例来说，喷气燃料和柴油燃料的生产可以得到额外的产品，如石脑油和轻质烃(包括丙烷)，其接着用于产生汽油。示范性的轻质烃包括甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、丁醇和异丁醇。在另一个实例中，汽油的生产可以得到额外的产品，如柴油，其可以用于生产喷气燃料。
[0065] 图2中图解了替代性的示范性的生物精炼系统。这种系统可以执行以下步骤中的一者或多者：培养所关注的微生物菌株(例如，甲烷营养菌、甲基营养菌或酵母)，这种菌株可以具有一种或多种改善的特性(例如，重组、较高生长速率、在高pH下生长的能力、改善的营养素利用率、温度稳定性、增加的生物质产量)；从微生物回收产品，如油组合物(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、三酸甘油酯、磷脂、异戊二烯、萜烯、PHA或其任何组合)；以及对油组合物进行改性以生产生物柴油组合物。举例来说，这种系统可以包括酯化设备或单元，其可以通过使油组合物与醇反应将油组合物转化成生物柴油。示范性的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或更长链的脂肪醇。
[0066] 在一些实施方案中，本文所公开的系统使用细菌(如甲基营养菌或甲烷营养菌)或酵母作为微生物。细菌或酵母可以从培养基中收集并分离(如果没有生长成例如生物膜的话)，得到细菌或酵母泥。细菌或酵母生物质可以任选地在从生物质获得油组合物之前加以干燥。在某些实施方案中，细菌或酵母生物质保持一定程度的湿润并且不需要在得到、分离或提取油组合物之前完全干燥。细菌或酵母油组合物可以从生物质中提取并且从细菌或酵母固体或泥浆中分离。
[0067] 油组合物的提取可以使用多种不同的方法或溶剂(例如，极性溶剂、非极性溶剂、中性溶剂、酸性溶剂、碱性溶剂、己烷或其组合)，如己烷或酸性甲醇或氯仿/甲醇混合物，在例如本文更详细地描述的那些的工艺或本领域中已知的其它提取方法中实现。
[0068] 在某些实施方案中，使用与有机溶剂(例如，己烷)和调节剂的高剪切接触，从生物质中分离所收集的生物质内所含的C1代谢微生物(例如，甲烷营养菌)油组合物。作为背景，油溶解于己烷或其它类似的溶剂中，形成混合油的溶液，而水和细胞固体不会溶解并且可以与混合油分离。水与己烷的不混溶性用于产生所需的分离。在某些实施方案中，在高剪切混合之后，将油组合物/己烷/水混合物送到倾析器中，在此其分离成两种不同的液体：较轻的己烷和油组合物相(混合油)，以及较重的水和消耗的固体相。在其它实施方案中，将来自倾析器的混合油馈送到蒸馏过程中，在此油组合物与溶剂分离，这允许回收和再使用溶剂，并且将油纯化到其准备用于下游处理的点。蒸馏例如利用了溶剂和油的沸点的差异来分离这两种组分。
[0069] 在某些实施方案中，精炼本公开的油组合物。精炼可以包括裂化、酯基转移、重整、蒸馏、加氢处理、异构化或其组合。任选地，精炼可以涉及到去除污染物。举例来说，可以通过氢化处理(例如，加氢脱氮(HDN)、加氢脱氧(HDO)、加氢脱硫(HDS)、加氢脱金属(HDM))来去除杂原子和金属。氢化处理还可以是烯烃饱和、蒸馏物氢化处理、真空气油氢化处理、固定床残余物氢化处理或其组合。油组合物的氢化处理可以生产喷气燃料或柴油。还可以通过裂化，如催化裂化来精炼油组合物以生产汽油。代表性的裂化工艺可以包括催化裂化、流体催化裂化、蒸汽裂化、加氢裂化、热裂化、热催化裂化或其组合。通过氢化处理和裂化进行精炼可以同时发现(两个过程都发生)或交替发生(一个或另一个发生)。精炼过程还可以在彼此之后进行，例如，通过氢化处理生产的产品然后可以通过裂化来处理。来自一个精炼过程的产品(例如，H2)还可以通过另一个精炼过程来进一步使用。精炼过程可以是系统的独立单元，或在同一个单元中。此外，细菌或酵母固体或泥浆可以用于生产燃料、动物饲料或能量，例如从固体或泥浆的消化而释放的甲烷。
[0070] 在某些实施方案中，本公开提供了一种生物精炼厂，其包括(a)处理单元，其中油组合物来源于C1代谢非光合微生物；以及(b)精炼单元，用于精炼这种油组合物以生产燃料。在其它实施方案中，生物精炼厂可以进一步包括控制培养单元，用于在包含C1底物的原料存在下培养C1代谢非光合微生物，其中经过培养的细菌产生油组合物。
[0071] 示范性的控制培养单元包括发酵罐、生物反应器、中空纤维细胞、填充床生物反应器，等等。在其它实施方案中，培养物可以按液相发酵或固相发酵的形式生长。举例来说，细菌，如甲基营养菌或甲烷营养菌，可以在含有平衡培养基或非平衡培养基的生物反应器中培养，这种非平衡培养基具有有限量的磷、氮、微量元素、氧或其任何组合，以使得所关注的某些脂质或其它聚合物(例如，PHA)在细胞中积累。
[0072] 在某些实施方案中，培养物包括细菌群落，包括多种甲基营养菌或甲烷营养菌，其产生最高水平的所关注的油组合物(即，脂质与生物质的w/w比率很高)。可以使用一定范围的生物反应器配置，包括序批式膜生物反应器和连续多级分散生长配置。在某些实施方案中，操作生物反应器以选择有效地从甲烷产生所关注的油组合物的细菌，例如，生物反应器条件可以对立于不会从甲烷产生所关注的油组合物或低效地产生这种组合物的细菌进行选择。
[0073] 在其它实施方案中，本公开提供了一种控制培养单元，其中C1底物(例如，甲烷或合成气)在气相中被递送到固相发酵中的微生物生物膜。在其它实施方案中，在固相发酵中建立平衡或非平衡生长条件。在其它实施方案中，甲基营养菌或甲烷营养菌在平衡生长条件下生长，从液相中收集并分离，并且转移到固相发酵室中，在此C1底物在非平衡条件(例如，不包括氮)下递送并且细菌消耗底物以产生所关注的油组合物。
[0074] 在某些实施方案中，本公开提供了一种生物精炼厂，其包括(a)控制培养单元，用于在包含C1底物的原料存在下培养C1代谢非光合微生物，其中经过培养的细菌产生油组合物；(b)处理单元，其中从C1代谢非光合微生物中得到或提取油组合物；以及(c)精炼单元，用于精炼这种油组合物以生产燃料。在其它实施方案中，用于生物精炼厂的原料C1底物是甲烷、甲醇、甲醛、甲酸或其盐、一氧化碳、二氧化碳、合成气、甲胺、甲基硫醇或甲基卤。
[0075] 在其它生物精炼厂的实施方案中，C1代谢非光合微生物是甲烷营养菌或甲基营养菌，原料C1底物是天然气或甲烷，并且细菌在好氧条件下培养。在其它实施方案中，甲烷营养菌是发孢甲基弯菌OB3b、荚膜甲基球菌Bath、甲基单胞菌属16a、甲烷甲基单胞菌、嗜碱甲基微菌、其任何组合或其高度生长变异体，并且甲基营养菌是扭脱甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、白杨甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、结瘤甲基杆菌、其任何组合或其高度生长变异体。在某些其它实施方案中，C1代谢非光合微生物是专性C1代谢非光合微生物，如专性甲烷营养菌或甲基营养菌。
[0076] 在其它实施方案中，C1代谢非光合微生物是包含编码脂肪酸产生酶、甲醛同化酶或其组合的异源多核苷酸的重组微生物。举例来说，可以用作生产燃料或其它高价值的化学品的前体的游离脂肪酸(FFA)的生物合成可以通过将硫酯酶(TE)基因引入到本公开的C1代谢非光合微生物(例如，发孢甲基弯菌OB3b、荚膜甲基球菌Bath、甲基单胞菌属16a、甲烷甲基单胞菌)中来增强。FFA的生物合成还可以通过任选地引入多于一个TE基因、丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶(FabD，也被称作MCT)基因、一个或多个来自乙酰基-CoA羧化酶操纵子(AccABCD)的基因或其任何组合来增强。在某些实施方案中，FFA的生产可以通过过度表达丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶(FabD，也被称作MCT)来改善，因为脂肪酸生物合成的第一个关键步骤是用三磷酸腺苷(ATP)依赖性乙酰基-CoA羧化酶将乙酰基-CoA转化成丙二酰基-CoA，接下来经由FabD酶将丙二酰基-CoA转化成丙二酰基-ACP。
[0077] 在其它实施方案中，C1代谢非光合微生物是包含最小化或减少脂肪酸降解的遗传修饰的重组微生物。举例来说，C1代谢非光合微生物是包含截短或敲除由一个或多个内源fadD基因编码的长链脂肪酸-CoA连接酶活性的一个或多个突变的重组微生物。
[0078] 编码野生型FadD蛋白质的核酸序列是用于设计突变型fadD基因的参考标准起点。举例来说，由发孢甲基弯菌OB3b、荚膜甲基球菌Bath、甲烷甲基单胞菌(M.methanica)、扭脱甲基杆菌(M.extorquens)和杨氏梭菌(C.ljungdahlii)编码的野生型FadD蛋白质序列分别以GenBank入藏号EFH00931.1、YP_114021.1、YP_004512148.1、YP_002964871.1和YP_
003782065.1提供。在某些实施方案中，对编码上述蛋白质中的任一者的fadD基因的核酸分子个别地进行修饰以使fadD突变。在本文的实施例2中，合成来自多种C1代谢微生物的fadD基因以将数个终止突变和读框移位并入到来自发孢甲基弯菌OB3b(SEQ ID NO.:1)、甲烷甲基单胞菌(SEQ ID NO.:35)、扭脱甲基杆菌(SEQ ID NO.:52)和杨氏梭菌(SEQ ID NO.:85)的基因的5'区域中。对于荚膜甲基球菌fadD基因来说，合成包含内部缺失的核酸分子以便可以连接基因的剩余5'和3'末端以维持原始的阅读框架(SEQ ID NO.:18)。
003782065.1提供。在某些实施方案中，对编码上述蛋白质中的任一者的fadD基因的核酸分子个别地进行修饰以使fadD突变。在本文的实施例2中，合成来自多种C1代谢微生物的fadD基因以将数个终止突变和读框移位并入到来自发孢甲基弯菌OB3b(SEQ ID NO.:1)、甲烷甲基单胞菌(SEQ ID NO.:35)、扭脱甲基杆菌(SEQ ID NO.:52)和杨氏梭菌(SEQ ID NO.:85)的基因的5'区域中。对于荚膜甲基球菌fadD基因来说，合成包含内部缺失的核酸分子以便可以连接基因的剩余5'和3'末端以维持原始的阅读框架(SEQ ID NO.:18)。
[0079] 对于fadD基因序列未知的某些C1代谢微生物(例如，产乙醇梭菌)来说，可以对基因组进行测序，并且经由tblastn搜索(具有大肠杆菌FadD的蛋白质序列的经过翻译的核苷酸基因序列的搜索)来鉴别大肠杆菌的fadD同源物。举例来说，合成产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)fadD基因的核酸分子以将数个终止突变和读框移位并入到基因的5'区域中。
[0080] 在某些实施方案中，将突变型fadD核酸分子克隆到质粒表达载体(并且任选地缺乏C1代谢微生物复制起点并编码抗生素抗性)中用于使用本文所描述的方法接合、电穿孔或转化到C1代谢微生物中。在某些实施方案中，fadD突变体通过同源重组而并入到宿主细胞基因组中并且得到缺乏或具有最小的长链脂肪酸-CoA连接酶活性的重组细胞。
[0081] 在某些实施方案中，引入到本公开的C1代谢微生物中的TE、MCT和Acc基因中的任一者或全部可以被过度表达，并且C1代谢微生物可以任选地具有最小化或消除脂肪酸-CoA连接酶活性的突变(例如，fadD敲除)。
[0082] 在某些实施方案中，生物精炼厂的处理单元能够通过湿法提取、超临界流体提取、干法提取、热提取(例如，蒸汽汽提、水热液化、加压蒸煮)、酶法水解(例如，细胞壁的酶法水解)、脉冲电场提取、微泡、中空纤维提取等等来得到油组合物。在其它实施方案中，湿法提取包括使用极性溶剂、非极性溶剂、中性溶剂、酸性溶剂、碱性溶剂、己烷或其组合。在某些实施方案中，油组合物从C1代谢非光合微生物的细胞膜得到或提取，或可以从培养物上清液回收(如果被分泌或排泄的话)，或其组合。在其它实施方案中，生物精炼厂进一步包括第二处理单元，其中第二处理单元是用于处理来自经过精炼的油组合物的残余物质的废物处理单元，这个废物处理单元包括厌氧消化器、好氧消化器或两者。在其它实施方案中，生物精炼厂进一步包括管道，用于递送来自废物处理单元的至少一种产物以供培养或维持C1代谢非光合微生物。
[0083] 在其它实施方案中，生物精炼厂的处理单元进一步包括控制培养单元，其中控制培养单元是固相发酵单元，在这个固相发酵单元中培养和处理(例如，提取)可以在同一个单元或甚至同一个室中发生。在某些实施方案中，生物精炼厂的组合培养/处理单元包括超临界流体提取，例如使用包含CO2、甲醇或H2O的超临界流体。
[0084] 在某些方面，前述生物精炼厂中的任一者是一体化的。
[0085] C1代谢微生物
[0086] 本公开的C1代谢微生物可以是天然的，经过菌株改适(例如，进行发酵以选择与亲本菌株相比具有改善的生长速率和增加的总生物质产量的菌株)，或经过重组修饰以产生所关注的脂质(例如，经过遗传改变以表达脂肪酸产生酶、甲醛同化酶或其组合)或具有增加的生长速率或两者。在某些实施方案中，C1代谢微生物不是C1代谢非光合微生物，如海藻或植物。
[0087] 在某些实施方案中，本公开提供了C1代谢微生物，其为原核生物或细菌，如甲基单胞菌、甲基细菌、甲基球菌、甲基弯菌、甲基孢囊菌、甲基微菌、甲烷单胞菌、嗜甲基菌、甲基菌、甲基杆菌、生丝微菌、黄色杆菌、芽孢杆菌、副球菌、诺卡氏菌、节杆菌、红假单胞菌或假单胞菌。
[0088] 在其它实施方案中，C1代谢细菌是甲烷营养菌或甲基营养菌。示范性的甲烷营养菌包括甲基单胞菌、甲基细菌、甲基球菌、甲基弯菌、甲基孢囊菌、甲基微菌、甲烷单胞菌、甲基胞菌或其组合。示范性的甲基营养菌包括扭脱甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、白杨甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、结瘤甲基杆菌或其组合。
[0089] 在某些实施方案中，甲烷营养细菌经过遗传工程改造而具有将C1底物原料转化成油组合物的能力。甲烷营养细菌具有氧化作为碳和能量来源的甲烷的能力。甲烷营养细菌基于其碳同化途径和内部膜结构而被分为三个组：I型(γ变形菌)、II型(α变形菌)和X型(γ变形菌)。I型甲烷营养菌使用单磷酸核酮糖(RuMP)途径用于碳同化，而II型甲烷营养菌使用丝氨酸途径。X型甲烷营养菌使用RuMP途径，而且表达低水平的丝氨酸途径的酶。甲烷营养细菌包括专性甲烷营养菌，其只可以利用C1底物用于碳和能量来源；以及兼性甲烷营养菌，其天然地具有利用一些多碳底物作为碳和能量来源的能力。
[0090] 示范性的兼性甲烷营养菌包括甲基胞菌、甲基孢囊菌和甲基荚膜菌的一些种类(例如，森林甲基胞菌、沼泽甲基胞菌、冻原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、苔藓甲基孢囊菌和金色甲基荚膜菌KYG)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、培氏甲基菌或其高度生长变异体。示范性的专性甲烷营养细菌包括荚膜甲基球菌Bath(NCIMB 11132)、甲基单胞菌属16a(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯菌OB3b(NRRL B-11,196)、生孢甲基弯菌(NRRL B-11,
197)、小甲基孢囊菌(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(NRRL B-11,200)、荚膜甲基细菌Y(NRRL B-11,201)、鞭毛甲基单胞菌属(Methylomonas flagellata sp.)AJ-3670(FERM P-2400)、极端嗜酸甲烷氧化菌和嗜碱甲基微菌或其高度生长变异体。
197)、小甲基孢囊菌(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(NRRL B-11,200)、荚膜甲基细菌Y(NRRL B-11,201)、鞭毛甲基单胞菌属(Methylomonas flagellata sp.)AJ-3670(FERM P-2400)、极端嗜酸甲烷氧化菌和嗜碱甲基微菌或其高度生长变异体。
[0091] 在其它实施方案中，本公开提供了C1代谢微生物，其为合成气代谢细菌，如梭菌、穆尔氏菌、火球菌、真细菌、脱硫杆菌、一氧化碳嗜热菌、产醋菌、醋酸杆菌、厌氧醋菌、丁酸杆菌、消化链球菌或其任何组合。示范性的合成气代谢细菌包括产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏梭菌、产丙醇梭菌或其任何组合。
[0092] 在某些其它实施方案中，C1代谢微生物是真核生物，如酵母，包括假丝酵母、耶氏酵母、汉逊酵母、毕赤酵母、球拟酵母或红酵母。
[0093] 在某些其它实施方案中，C1代谢非光合微生物是专性C1代谢非光合微生物，如专性甲烷营养菌或甲基营养菌。在其它实施方案中，C1代谢非光合微生物是包含编码脂肪酸产生酶、甲醛同化酶或其组合的异源多核苷酸的重组微生物。在某些实施方案中，引入到本公开的C1代谢微生物中的TE、MCT和Acc基因中的任一者或全部可以被过度表达，并且C1代谢微生物可以任选地具有最小化或消除脂肪酸-CoA连接酶活性的突变(例如，fadD敲除)。
[0094] 本公开的微生物中的每一者可以生长成分离的培养物，其中异源生物体可以帮助生长，或这些细菌中的一者或多者可以组合产生混合培养物。在其它实施方案中，本公开的C1代谢非光合微生物是专性C1代谢非光合微生物。
[0095] 前述C1代谢微生物中的任一者可以用作亲本或参考宿主细胞来制造本公开的重组C1代谢微生物。
[0096] 密码子优化
[0097] 重组蛋白质的表达在其原始宿主外可能很困难。举例来说，跨越不同种类的细菌已经观测到密码子使用偏性的变化(Sharp等,Nucl.Acids.Res.33:1141,2005)。重组蛋白质甚至在其原生宿主内的过度表达可能也很困难。在某些实施方案中，可以对将要引入到如本文所描述的宿主中的核酸分子(例如，编码硫酯酶、fabD、accABCD的核酸)在引入到宿主中之前进行密码子优化，以确保蛋白质表达是有效的或增强的。密码子优化指的是在转化之前改变核酸的基因或编码区中的密码子以反映宿主的典型密码子使用，而不会改变由非天然DNA分子编码的多肽。用于异源宿主中的最优基因表达的密码子优化方法先前已有描述(参看例如Welch等,PLoS One 4:e7002,2009；Gustafsson等,Trends Biotechnol.22:346,2004；Wu等,Nucl.Acids Res.35:D76,2007；Villalobos等,BMC Bioinformatics 7:
285,2006；美国专利公布号2011/0111413和2008/0292918；这些方法的公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
285,2006；美国专利公布号2011/0111413和2008/0292918；这些方法的公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
[0098] 类似地，编码多肽变异体的本公开的外源核酸分子可以使用上文所述的参考文献(美国专利号8,005,620；Gustafsson等；Welch等；Villalobos等；Minshull等)中所描述的基于系统发育的方法来设计。通过这些方法产生的每个变异型多肽将保留至少50％的活性(优选100％或更高的活性)，并且具有与参考或亲本野生型多肽序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致或100％一致的多肽序列。在某些实施方案中，变异型多肽在预定位置处相对于参考或亲本野生型酶将包括至少一个氨基酸取代(例如，1、2、3、5、6、7、8、9或10个或更多个或至多20、25或30个取代)，条件是变异体保留所关注的活性(例如，硫酯酶活性或脂肪酸产生)。
[0099] 在某些实施方案中，对大肠杆菌、樟树(Cinnamomum camphorum)、加州月桂(Umbellularia californica)、化脓性链球菌(Streptoccus pyogenes)、蓖麻(Ricinius communis)或麻疯树(Jatropha curcus)硫酯酶进行密码子优化用于在本公开的C1代谢微生物(例如，甲烷营养菌、甲基营养菌、梭菌)中表达。在其它实施方案中，将密码子优化的硫酯酶序列中的任何一者或多者引入(例如，转化、接合、电穿孔)到本公开的C1代谢微生物中。示范性的密码子优化的硫酯酶序列如下所列：(1)对于发孢甲基弯菌OB3b，SEQ ID NO.:3-13；(2)对于荚膜甲基球菌Bath，SEQ ID NO.:20-30；(3)对于甲烷甲基单胞菌，SEQ ID NO.:37-47；(4)对于扭脱甲基杆菌，SEQ ID NO.:54-64；(5)对于产乙醇梭菌，SEQ ID NO.:
70-80；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:87-97。
70-80；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:87-97。
[0100] 在某些实施方案中，对大肠杆菌丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶(fabD)序列进行密码子优化用于在本公开的C1代谢微生物(例如，甲烷营养菌、甲基营养菌、梭菌)中表达。在其它实施方案中，将密码子优化的fabD序列中的任何一者或多者引入(例如，转化、接合、电穿孔)到本公开的C1代谢微生物中。示范性的密码子优化的fabD序列如下所列：(1)对于发孢甲基弯菌OB3b，SEQ ID NO.:2；(2)对于荚膜甲基球菌Bath，SEQ ID NO.:19；(3)对于甲烷甲基单胞菌，SEQ ID NO.:36；(4)对于扭脱甲基杆菌，SEQ ID NO.:53；(5)对于产乙醇梭菌，SEQ ID NO.:69；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:86。
[0101] 在某些实施方案中，对一个或多个乙酰基-CoA羧化酶序列(例如，来自大肠杆菌的accA、accB、accC和accD)进行密码子优化用于在本公开的C1代谢微生物(例如，甲烷营养菌、甲基营养菌、梭菌)中表达。在其它实施方案中，将密码子优化的Acc序列中的任何一者或多者引入(例如，转化、接合、电穿孔)到本公开的C1代谢微生物中。在其它实施方案中，引入密码子优化的accA或引入密码子优化的accABCD。示范性的密码子优化的accA、accB、accC和accD序列分别如下所列：(1)对于发孢甲基弯菌OB3b，SEQ ID NO.:14-17；(2)对于荚膜甲基球菌Bath，SEQ ID NO.:31-34；(3)对于甲烷甲基单胞菌，SEQ ID NO.:48-51；(4)对于扭脱甲基杆菌，SEQ ID NO.:65-68；(5)对于产乙醇梭菌，SEQ ID NO.:81-84；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:98-101。
[0102] 转化方法
[0103] 使用本领域中已知的多种方法中的任一者，可以对本文所描述的重组C1代谢微生物或甲烷营养细菌中的任一者进行转化以包含至少一个外源核酸来提供具有新的或增强的活性(例如，酶活性)的宿主，或可以进行遗传修饰以去除或实质上降低内源基因功能。
[0104] 转化指的是将核酸分子(例如，外源或异源核酸分子)引入到宿主细胞中。经过转化的宿主细胞可以带有在染色体外或合并到染色体中的外源或异源核酸分子。合并到宿主细胞基因组和自主复制载体中一般得到经过转化的核酸分子的遗传上稳定的遗传。含有经过转化的核酸分子的宿主细胞被称作“非天然存在的”或“经过遗传工程改造的”或“重组的”或“经过转化的”或“转基因的”细胞(例如，细菌)。
[0105] 适用于异源核酸在C1代谢微生物(例如，甲烷营养细菌)中的表达的表达系统和表达载体是已知的。
[0106] C1代谢细菌的电穿孔描述于本文中，并且先前已经描述于例如Toyama等,FEMS Microbiol.Lett.166:1,1998；Kim和Wood,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:105,1997；Yoshida等,Biotechnol.Lett.23:787,2001；以及美国专利申请公布号2008/0026005中。
[0107] 细菌接合，指的是涉及到供体与受体细胞的直接接触的特定类型的转化，被更频繁地用于将核酸分子转移到C1代谢细菌中。细菌接合涉及到将“供体”与“受体”细胞彼此紧密接触地混合在一起。接合通过在供体与受体细菌之间形成细胞质连接而发生，同时新合成的供体核酸分子单向转移到受体细胞中。接合反应中的受体是经由从供体细菌水平转移而可以接受核酸的任何细胞。接合反应中的供体是含有接合质粒、接合转座子或移动的质粒的细菌。供体质粒的物理转移可以经由自主转移质粒或在“辅助”质粒的帮助下发生。涉及到C1代谢细菌的接合描述于本文中，并且先前已经描述于Stolyar等,Mikrobiologiya 64:686,1995；Motoyama等,Appl.Micro.Biotech.42:67,1994；Lloyd等,
Arch.Microbiol.171:364,1999；PCT公布号WO02/18617；以及Ali等,Microbiol.152:2931,
2006中。
Arch.Microbiol.171:364,1999；PCT公布号WO02/18617；以及Ali等,Microbiol.152:2931,
2006中。
[0108] 异源核酸在C1代谢细菌中的表达在本领域中是已知的(参看例如美国专利号6,818,424、美国专利申请公布号2003/0003528)。甲基营养细菌的基于Mu转座子的转化已有描述(Akhverdyan等,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:857,2011)。用于异源基因的单一和多拷贝表达而没有甲基杆菌中宿主基因的插入失活的mini-Tn7转座子系统已有描述(美国专利申请公布号2008/0026005)。
[0109] 可以使用使C1代谢细菌中的内源基因功能失活、敲除或缺失的多种方法。使用自杀载体进行等位基因交换以在缓慢生长的C1代谢细菌中构筑缺失/插入突变体也已经描述于本文中以及例如Toyama和Lidstrom,Microbiol.144:183,1998；Stolyar等,Microbiol.145:1235,1999；Ali等,Microbiol.152:2931,2006；Van Dien等,
Microbiol.149:601,2003中。
Microbiol.149:601,2003中。
[0110] 可以利用用于高度表达外源核酸分子的适合的同源或异源启动子。举例来说，美国专利号7,098,005描述了使用在甲烷或甲醇存在下高度表达的启动子用于在C1代谢细菌中进行异源基因表达。可以使用的额外启动子包括脱氧木酮糖磷酸合酶甲醇脱氢酶操纵子启动子(Springer等,FEMS Microbiol.Lett.160:119,1998)；用于PHA合成的启动子(Foellner等,Appl.Microbiol.Biotechnol.40:284,1993)；丙酮酸脱羧酶启动子(Tokuhiro等,Appl.Biochem.Biotechnol.131:795,2006)；或从甲基营养菌中的原生质粒鉴别的启动子(EP 296484)。非原生启动子包括lac操纵子Plac启动子(Toyama等,Microbiol.143:595,1997)或杂合启动子，如Ptrc(Brosius等,Gene 27:161,1984)。
[0111] 在某些实施方案中，启动子或密码子优化用于编码一种或多种乳酸产生酶的外源多核苷酸在宿主甲烷营养细菌中的高组成性表达。还可以利用外源核酸在宿主甲烷营养细菌中的调控性表达。在某些实施方案中，可能需要编码一种或多种硫酯酶、乙酰基-CoA羧化酶或丙二酰基-CoA-ACP转酰酶的外源核酸的调控性表达来优化由非天然存在的甲烷营养细菌产生脂质。举例来说，可以使用如描述于例如美国专利申请号US 2010/0221813中的在甲基营养细菌和甲烷营养细菌中的重组蛋白质表达的可诱导/可调控系统。
[0112] 重组C1代谢微生物
[0113] 如本文所述，本文所描述的重组C1代谢微生物(例如，甲烷营养细菌)中的任一者可以用作亲本或参考宿主细胞来制造重组C1代谢微生物。在某些实施方案中，本公开提供了重组C1代谢非光合微生物，其中这种微生物包含与脂肪酸生物合成有关的异源核酸序列并且其中异源核酸序列的表达使得与亲本或参考C1代谢非光合微生物相比积累增加的水平的脂肪酸或脂肪酸在重组C1代谢微生物中过度表达。
[0114] 在某些实施方案中，重组C1代谢非光合微生物包含编码脂肪酸产生酶、甲醛同化酶或其任何组合的异源多核苷酸。在其它实施方案中，异源多核苷酸编码硫酯酶、丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶、乙酰基-CoA羧化酶或其任何组合。举例来说，硫酯酶可以是大肠杆菌、樟树、加州月桂、化脓性链球菌、蓖麻或麻疯树硫酯酶。示范性的fabD、accA、accB、accC和accD基因可以来自大肠杆菌或任何其它所选生物体。
[0115] 在其它实施方案中，重组C1代谢非光合微生物包含针对在C1代谢非光合微生物中有效表达进行密码子优化的异源核酸序列。在某些实施方案中，硫酯酶、fabD、accA、accB、accC和accD中的任何一者或多者针对C1代谢非光合微生物进行密码子优化。在一个实施方案中，密码子优化的硫酯酶是缺乏周质靶向序列的大肠杆菌tesA。
[0116] 在其它实施方案中，前述重组C1代谢非光合微生物中的任一者进一步包含最小化或消除脂肪酸-CoA连接酶活性的突变。
[0117] 用于制造本公开的重组C1代谢非光合微生物的示范性的生物体包括细菌或酵母。在某些实施方案中，用于制造本公开的重组C1代谢细菌的亲本或参考C1代谢细菌是甲烷营养菌或甲基营养菌，如甲基单胞菌属16a(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯菌OB3b(NRRL B-11,
196)、生孢甲基弯菌(NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(NRRL B-11,200)、荚膜甲基细菌Y(NRRL B-11,201)、荚膜甲基球菌Bath(NCIMB 11132)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属AJ-3670(FERM P-2400)、嗜碱甲基微菌、森林甲基胞菌、极端嗜酸甲烷氧化菌、培氏甲基菌、扭脱甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、白杨甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、结瘤甲基杆菌或其任何组合。
196)、生孢甲基弯菌(NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(NRRL B-11,200)、荚膜甲基细菌Y(NRRL B-11,201)、荚膜甲基球菌Bath(NCIMB 11132)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属AJ-3670(FERM P-2400)、嗜碱甲基微菌、森林甲基胞菌、极端嗜酸甲烷氧化菌、培氏甲基菌、扭脱甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、白杨甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、结瘤甲基杆菌或其任何组合。
[0118] 在其它实施方案中，用于制造本公开的重组C1代谢细菌的亲本或参考C1代谢细菌是合成气代谢细菌，如产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏梭菌、产丙醇梭菌或其组合。
[0119] 培养方法和制造油组合物的方法
[0120] 多种培养方法可以用于本文所描述的微生物、细菌和酵母。举例来说，C1代谢微生物(如甲烷营养菌或甲基营养菌细菌)可以通过分批培养或连续培养方法而生长。在某些实施方案中，培养物在控制培养单元中生长，如发酵罐、生物反应器、中空纤维细胞，等等。一般来说，处于对数期的细胞在一些系统中通常负责大量生产所关注的产物或中间物，而可以在其它系统中获得静止期或后指数期生产。
[0121] 经典分批培养方法是封闭系统，其中当开始培养时设定培养基组成并且在培养过程中不改变。就是说，在培养过程开始时用一种或多种所选的微生物接种培养基，然后使其生长而不向系统中添加任何物质。如本文所用的“分批”培养是关于不改变初始添加的特定碳源的量，而可以在培养期间监测并改变如pH和氧浓度等因素的控制。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成不断地变化直到终止培养的时间。在分批培养物内，细胞(例如细菌，如甲基营养菌)一般将从静态停滞期移动到高度生长对数期再移动到静止期，在静止期生长速率降低或停止(并且如果条件不改变的话，将最终导致细胞死亡)。
[0122] 补料分批系统是标准分批系统的变化，其中所关注的碳底物随着培养的进行以增量方式添加。当细胞代谢可能受分解物阻遏而抑制时并且当需要在培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是适用的。因为难以测量补料分批系统中的实际底物浓度，所以基于如pH、溶解氧和废气分压等可测量因素的变化来进行估算。分批和补料分批培养方法在本领域中是常用并已知的(参看例如Thomas D.Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA；Deshpande,Appl.Biochem.Biotechnol.36:227,1992)。
[0123] 连续培养在以下意义上是“开放”系统：将确定成分培养基连续添加到生物反应器中，而同时移出等量的已用(“条件”)培养基以供处理。连续培养一般将细胞维持在恒定高的液相密度下，在此细胞主要处于对数生长期。或者，可以使用固定化细胞(例如，生物膜)实施连续培养，其中连续添加碳和营养素，并且从细胞团块连续移出有价值的产物、副产物和废产物。细胞固定化可以使用大范围的固体支撑物来实现，这些固体支撑物由天然材料、合成材料或其组合所组成。
[0124] 连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一个或多个因素。举例来说，一种方法可以维持固定比率的限制性营养素(例如，碳源、氮)并且允许所有其它参数随时间而变化。在其它实施方案中，可以连续地改变影响生长的若干因素，同时使如由培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续培养系统的目标在于维持稳态生长条件，同时平衡由于对抗细胞生长速率抽出培养基而引起的细胞损失。调节连续培养过程的营养素和生长因素的方法以及最大化产物形成速率的技术在本领域中是众所周知的(参看Brock,1992)。
[0125] 在某些实施方案中，培养基包括碳底物作为C1代谢微生物的能量来源。适合的底物包括C1底物，如甲烷、甲醇、甲醛、甲酸(甲酸盐)、一氧化碳、二氧化碳、甲基化胺(甲胺、二甲胺、三甲胺，等等)、甲基化硫醇或甲基卤(溴甲烷、氯甲烷、碘甲烷、二氯甲烷，等等)。在某些实施方案中，培养基可以包含单一的C1底物作为C1代谢微生物的唯一碳源，或可以包含两种或更多种C1底物的混合物(混合的C1底物组合物)作为C1代谢微生物的多个碳源。
[0126] 另外，已知一些C1代谢生物体利用非C1底物，如糖、葡糖胺或多种氨基酸用于代谢活动。举例来说，一些假丝酵母种类可以代谢丙氨酸或油酸(Sulter等 ,Arch.Microbiol.153:485,1990)。扭脱甲基杆菌AM1能够在有限数目的C2、C3和C4底物上生长(Van Dien等,Microbiol.149:601,2003)。或者，C1代谢微生物可以是具有利用替代性碳底物的能力的重组变异体。因此，预期培养基中的碳源可以包含碳底物与单一和多碳化合物的混合物，这取决于所选的C1代谢微生物。
[0127] 在某些实施方案中，本公开提供了一种制造燃料的方法，其包括将来自主要包含C1代谢非光合微生物的培养物的生物质转化成油组合物以及将这种油组合物精炼成燃料。在某些实施方案中，C1代谢非光合微生物是专性C1代谢非光合微生物，如专性甲烷营养菌或甲基营养菌。在其它实施方案中，C1代谢非光合微生物是包含编码脂肪酸产生酶、甲醛同化酶或其组合的异源多核苷酸的重组微生物。在某些实施方案中，引入到本公开的C1代谢微生物中的TE、MCT和Acc基因中的任一者或全部可以被过度表达，并且C1代谢微生物可以任选地具有最小化或消除脂肪酸-CoA连接酶活性的突变(例如，fadD敲除)。在其它实施方案中，油组合物从C1代谢非光合微生物(例如，甲基营养菌、甲烷营养菌、酵母)的细胞膜得到或提取，或可以从培养物上清液回收(如果被分泌或排泄的话)，或其组合。
[0128] 在其它实施方案中，将生物质转化成油组合物的步骤包括提取油组合物，例如通过湿法提取、超临界流体提取、干法提取、热提取(例如，蒸汽汽提、水热液化、加压蒸煮)、酶法水解(例如，细胞壁的酶法水解)、脉冲电场提取、微泡、中空纤维提取，等等。示范性的提取方法在本领域中是已知的，例如Folch的氯仿:甲醇(2:1v/v)(CM溶液)方法(参看Folch等,J.Biol.Chem.226:497,1957)，或其经过修改的方法(参看实施例3)；Hara和Radin的己烷:异丙醇(HIP)提取方法(参看Hara和Radin,Anal.Biochem.90:420,1978)；Bligh和Dyer的氯仿:甲醇:水方法(参看Bligh和Dyer,Canadian J.Biochem.Physiol.37:911,1959)；等等。其它示范性的提取方法包括固相提取柱(Pinkart等,J.Microbiol.Meth.34:9,1998)、单步反应提取(Nelson,All Graduate Theses and Dissertations.Paper 642,digitalcommons.usu.edu/etd/642)、α-羟基磺酸提取(美国专利公布号2013/0144078)、高温高压提取(美国专利公布号2012/0110898)，或加速溶剂提取(ASE)、索氏提取(soxhlet)、超声波提取和振荡提取方法(参看Liu等,J.Earth Sci.21:300,2010)。这些提取方法中的每一者以全文引用的方式并入本文中，并且可以用于本文所描述的前述方法或生物精炼系统中的任一者中。
[0129] 在某些实施方案中，本公开提供了一种通过精炼油组合物(例如，在精炼单元中)以生产燃料来制造燃料的方法，其中这种油组合物来源于C1代谢非光合微生物，如甲基营养菌或甲烷营养菌。在其它实施方案中，这种方法进一步包括提取油组合物或使用处理单元用于从C1代谢非光合微生物中提取油组合物。在其它实施方案中，这种方法包括(a)在控制培养单元中在包含C1底物的原料存在下培养C1代谢细菌，其中经过培养的细菌产生油组合物；(b)从经过培养的细菌中提取油组合物或在处理单元中提取油组合物；以及(c)精炼经过提取的油组合物或在精炼单元中精炼油组合物以生产燃料。在某些实施方案中，原料C1底物是甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二氧化碳、甲胺、甲基硫醇或甲基卤。
[0130] 在制造燃料或生物燃料的前述方法中的任一者中，C1代谢非光合微生物是甲烷营养菌、甲基营养菌或梭菌，原料C1底物是天然气、合成气或甲烷，并且在好氧或厌氧条件下培养细菌。在其它实施方案中，甲烷营养菌是发孢甲基弯菌OB3b、荚膜甲基球菌Bath、甲基单胞菌属16a、甲烷甲基单胞菌、嗜碱甲基微菌、其任何组合或其高度生长变异体；甲基营养菌是扭脱甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、白杨甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、结瘤甲基杆菌、其任何组合或其高度生长变异体；并且梭菌是产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、伍氏梭菌、产丙醇梭菌或其任何组合或其高度生长变异体。在某些其它实施方案中，C1代谢非光合微生物是专性C1代谢非光合微生物，如专性甲烷营养菌、甲基营养菌或梭菌。
[0131] 在制造燃料或生物燃料的前述方法中的任一者中，C1代谢非光合微生物是甲烷营养菌，原料C1底物是天然气或甲烷，并且在好氧条件下培养细菌。在其它实施方案中，C1代谢非光合微生物是甲烷营养菌，C1底物是天然气或甲烷，并且使用有限量的磷、氮、微量元素、氧或其任何组合培养细菌。
[0132] 燃料组合物和燃料产品
[0133] 作为背景，稳定同位素测量和质量平衡方法广泛地用于评估甲烷的全球源与汇(参看Whiticar和Faber,Org.Geochem.10:759,1986；Whiticar,Org.Geochem.16:531,1990)。为了使用残余甲烷的δ13C值来确定氧化的量，有必要了解由甲烷的微生物氧化引起的同位素分级的程度。举例来说，好氧甲烷营养菌可以经由一种特定的酶，即甲烷单加氧酶(MMO)来代谢甲烷。甲烷营养菌将甲烷转化成甲醇并且随后转化成甲醛。甲醛可以被进一步氧化成CO2以向细胞以还原当量(NADH)的形式提供能量，或经由RuMP或丝氨酸周期而并入到生物质中(Hanson和Hanson,Microbiol.Rev.60:439,1996)，这直接类似于光合生物体中的碳同化途径。更具体地说，I型甲烷营养菌使用RuMP途径用于生物质合成并且完全从CH4产生生物质，而II型甲烷营养菌使用丝氨酸途径，其同化50-70％的来自CH4的细胞碳和30-
50％的来自CO2的细胞碳(Hanson和Hanson,1996)。测量碳同位素组成的方法提供于例如Templeton等(Geochim.Cosmochim.Acta 70:1739,2006)中，这些方法特此以全文引用的方式并入。来自生物质的油组合物的13C/12C稳定碳比率(以“δ”值‰提供，δ13C)可以视所用的C1底物的来源和纯度而变化(参看例如图7)。
50％的来自CO2的细胞碳(Hanson和Hanson,1996)。测量碳同位素组成的方法提供于例如Templeton等(Geochim.Cosmochim.Acta 70:1739,2006)中，这些方法特此以全文引用的方式并入。来自生物质的油组合物的13C/12C稳定碳比率(以“δ”值‰提供，δ13C)可以视所用的C1底物的来源和纯度而变化(参看例如图7)。
[0134] 使用C1代谢非光合微生物和本文所描述的方法生产的油组合物以及从其得到的生物燃料组合物可以与从石油化学品或从光合微生物或植物通过碳指纹生产的油和燃料相区分。在某些实施方案中，生物质、油组合物或来源于生物质或油组合物的生物燃料的δ13C小于-30‰、小于-31‰、小于-32‰、小于-33‰、小于-34‰、小于-35‰、小于-36‰、小于-
37‰、小于-38‰、小于-39‰、小于-40‰、小于-41‰、小于-42‰、小于-43‰、小于-44‰、小于-45‰、小于-46‰、小于-47‰、小于-48‰、小于-49‰、小于-50‰、小于-51‰、小于-
52‰、小于-53‰、小于-54‰、小于-55‰、小于-56‰、小于-57‰、小于-58‰、小于-59‰、小于-60‰、小于-61‰、小于-62‰、小于-63‰、小于-64‰、小于-65‰、小于-66‰、小于-
67‰、小于-68‰、小于-69‰或小于-70‰。
37‰、小于-38‰、小于-39‰、小于-40‰、小于-41‰、小于-42‰、小于-43‰、小于-44‰、小于-45‰、小于-46‰、小于-47‰、小于-48‰、小于-49‰、小于-50‰、小于-51‰、小于-
52‰、小于-53‰、小于-54‰、小于-55‰、小于-56‰、小于-57‰、小于-58‰、小于-59‰、小于-60‰、小于-61‰、小于-62‰、小于-63‰、小于-64‰、小于-65‰、小于-66‰、小于-
67‰、小于-68‰、小于-69‰或小于-70‰。
[0135] 在某些实施方案中，C1代谢微生物生物质包含油组合物，其中这种生物质的δ13C为约-35‰到约-50‰、-45‰到约-35‰、或约-50‰到约-40‰、或约-45‰到约-65‰、或约-60‰到约-70‰、或约-30‰到约-70‰。在其它实施方案中，生物质油组合物包含至少50％的脂肪酸或包含至少50％的游离脂肪酸。在其它实施方案中，生物质油组合物包含二酰甘油与三酰甘油的混合物。在其它实施方案中，生物质油组合物包含大多数(超过50％w/w)具有在C14到C18或C16到C18范围内的碳链长度的脂肪酸，或大多数具有小于C16的碳链长度的脂肪酸。在其它实施方案中，生物质油组合物包含超过50％w/w的类萜或类异戊二烯化合物，其中这种类萜可以是法呢烯(farnesene)或柠檬烯(limonene)。
[0136] 在其它实施方案中，C1代谢非光合微生物生物质的δ13C小于约-30‰，或在约-40‰到约-60‰的范围内。在某些实施方案中，生物质包含重组C1代谢非光合微生物以及消耗的培养基，或生物质包含来自重组C1代谢非光合微生物的培养物的消耗的培养基上清液组合物，其中生物质的δ13C小于约-30‰。在某些其它实施方案中，油组合物从生物质中提取或浓缩，这种生物质可以包含重组C1代谢非光合微生物以及来自培养物的消耗的培养基，或来自重组C1代谢非光合微生物的培养物的消耗的培养基上清液组合物。
[0137] 在某些实施方案中，生物质是包含编码脂肪酸产生酶、甲醛同化酶或其任何组合的异源多核苷酸的重组C1代谢非光合微生物。在其它实施方案中，异源多核苷酸编码硫酯酶、丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶、乙酰基-CoA羧化酶或其任何组合。举例来说，硫酯酶可以是大肠杆菌、樟树、加州月桂、化脓性链球菌、蓖麻或麻疯树硫酯酶。示范性的fabD、accA、accB、accC和accD基因可以来自大肠杆菌或任何其它所选生物体。
[0138] 在其它实施方案中，生物质是包含针对在C1代谢非光合微生物中有效表达进行密码子优化的异源核酸序列的重组C1代谢非光合微生物。在某些实施方案中，硫酯酶、fabD、accA、accB、accC和accD中的任何一者或多者针对C1代谢非光合微生物进行密码子优化。在一个实施方案中，密码子优化的硫酯酶是缺乏周质靶向序列的大肠杆菌tesA。
[0139] 在其它实施方案中，前述生物质中的任一者是进一步包含最小化或消除脂肪酸-CoA连接酶活性的突变的重组C1代谢非光合微生物。
[0140] 用于产生生物质的示范性的生物体是本公开的重组C1代谢非光合微生物，包括细菌或酵母。在某些实施方案中，生物质是来自甲烷营养菌或甲基营养菌的C1代谢细菌，如甲基单胞菌属16a(ATCC PTA 2402)、发孢甲基弯菌OB3b(NRRL B-11,196)、生孢甲基弯菌(NRRL B-11,197)、小甲基孢囊菌(NRRL B-11,198)、甲烷甲基单胞菌(NRRL B-11,199)、白色甲基单胞菌(NRRL B-11,200)、荚膜甲基细菌Y(NRRL B-11,201)、荚膜甲基球菌Bath(NCIMB 11132)、嗜有机甲基杆菌(ATCC 27,886)、甲基单胞菌属AJ-3670(FERM P-2400)、嗜碱甲基微菌、森林甲基胞菌、极端嗜酸甲烷氧化菌、培氏甲基菌、扭脱甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、白杨甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、结瘤甲基杆菌或其任何组合。
[0141] 在其它实施方案中，生物质是来自本公开的重组C1代谢细菌的C1代谢细菌，其为合成气代谢细菌，如产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏梭菌、产丙醇梭菌或其组合。
[0142] 在某些实施方案中，油组合物的δ13C为约-35‰到约-50‰、-45‰到约-35‰、或约-50‰到约-40‰、或约-45‰到约-65‰、或约-60‰到约-70‰、或约-30‰到约-70‰。在其它实施方案中，油组合物包含至少50％w/w的脂肪酸或包含至少50％w/w的游离脂肪酸。在其它实施方案中，油组合物包含二酰甘油与三酰甘油的混合物。在其它实施方案中，油组合物包含大多数具有在C14到C18或C16到C18范围内的碳链长度的脂肪酸，或大多数具有小于C16的碳链长度的脂肪酸。在其它实施方案中，油组合物包含超过50％w/w的类萜或类异戊二烯化合物，其中类萜化合物可以是法呢烯、柠檬烯或两者。
[0143] 在某些实施方案中，来源于生物质或油组合物的生物燃料的δ13C为约-35‰到约-50‰、-45‰到约-35‰、或约-50‰到约-40‰、或约-45‰到约-65‰、或约-60‰到约-70‰、或约-30‰到约-70‰。在某些其它实施方案中，来源于油组合物的生物燃料的δ13C为约-
35‰到约-50‰、-45‰到约-35‰、或约-50‰到约-40‰、或约-45‰到约-65‰、或约-60‰到约-70‰、或约-30‰到约-70‰。
35‰到约-50‰、-45‰到约-35‰、或约-50‰到约-40‰、或约-45‰到约-65‰、或约-60‰到约-70‰、或约-30‰到约-70‰。
[0144] 在其它实施方案中，生物燃料包含至少50％w/w的脂肪酸甲酯(FAME)。在相关实施方案中，生物燃料包含至少50％的FAME，其中大多数FAME具有C14-C18、C16-C18或小于C16的碳链长度。在其它实施方案中，生物燃料包含至少50％w/w的脂肪酸乙酯(FAEE)。在相关实施方案中，生物燃料包含至少50％的FAEE，其中大多数FAEE具有C14-C18、C16-C18或小于C16的碳链长度。在其它实施方案中，生物燃料包含至少50％w/w的氢化类萜，如法呢烷(farnesane)或柠檬烷(limonane)。在某些实施方案中，大多数氢化类萜由法呢烷、柠檬烷或两者组成。在某些实施方案中，生物燃料包含氢化生物质。在某些实施方案中，大多数氢化生物质包含线性和支链烷烃的混合物。在某些实施方案中，生物燃料包含大多数具有在C14到C18或C16到C18范围内的碳链长度的脂肪酸，或大多数具有小于C16的碳链长度的脂肪酸。在其它实施方案中，生物燃料包含超过50％w/w的类萜或类异戊二烯化合物，其中这种类萜可以是法呢烯或柠檬烯。
[0145] 在某些实施方案中，C1代谢微生物的油组合物(其可以任选地从C1代谢微生物生物质中提取或分离)包含组合物的重量的至少约50％到约80％的氢和碳原子，并且其中组合物的δ13C小于约-35‰、或小于约-36‰、或小于约-37‰、或小于约-38‰、或小于约-39‰、或小于约-40‰。在某些实施方案中，油或从其得到的生物燃料组合物包含具有氢和碳原子的分子，其中这些氢和碳原子是组合物的重量的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％、或至少90％、或至少95％，并且其中组合物的δ13C在约-30‰到约-70‰的范围内，或其中生物质的δ13C随着细胞密度增大而降低约-5‰到约-20‰，或其中当在存在或不存在铜的情况下培养时生物质的δ13C比同时产生的CO2平均高5‰到15‰。
[0146] 在其它实施方案中，本公开的C1代谢微生物的油组合物(其可以任选地从C1代谢微生物生物质中提取或分离)包含组合物的重量的至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氢和碳原子。在某些实施方案中，油组合物或从其得到的生物燃料组合物包含具有氢和碳原子的分子，其中这些氢和碳原子是组合物的重量的至少约90％并且其中组合物的δ13C在约-40‰到约-55‰的范围内。
[0147] 如本文所描述并且在本领域中已知的燃料组分可以是化石燃料或用于产生燃料产品的混合掺合物。举例来说，用于燃料或生物燃料掺合的混合物可以是烃混合物，其适合于与另一种烃混合物掺合以产生燃料或生物燃料产品。举例来说，轻质烷烃的混合物可能不具有适合于燃料类型的某一辛烷值；然而，其可以与高辛烷值混合物掺合以产生燃料产品。在某些实施方案中，本公开的生物质、油组合物或从其得到的生物燃料在精炼之后是燃料或生物燃料组分。
[0148] 在某些实施方案中，生物燃料组合物包含具有氢和碳原子的分子，其中这些氢和碳原子是组合物的重量的至少80％并且其中组合物的δ13C分布在约-37％到约-10％的范围内，或其中生物质中的δ13C分布随着细胞密度增大而从-22％增加到-9％，或其中当在存在13
或不存在铜的情况下培养时生物质的δ C组成比同时产生的CO2平均高5％到15％。
或不存在铜的情况下培养时生物质的δ C组成比同时产生的CO2平均高5％到15％。
[0149] 如本文所描述的生物燃料产品是通过掺合本公开的油组合物或从其得到的生物燃料组合物与燃料或生物燃料组分而产生的产品。在一些情况下，生物燃料产品的δ13C分布大于-60‰、或大于-50‰、或大于-40‰、或大于-30‰，条件是掺合物的油组合物或从其得到的生物燃料组合物部分不来源于光合微生物或植物。在某些实施方案中，用于掺合的燃料组分是石油基组合物或燃料添加剂(例如，加氧剂，如甲醇、乙醇、异丙醇；醚，如甲基叔丁基醚、叔戊基甲基醚；抗氧化剂，如丁基化羟基甲苯、乙二胺；抗爆剂，如四乙基铅、二茂铁甲苯；清铅剂，如磷酸三甲苯酯；染料；等等)。举例来说，C1代谢微生物的油组合物可以在精炼(例如，酯基转移、裂化)之前与燃料组分掺合以产生如本文所描述的燃料产品。在其它实施方案中，油组合物是液体或固体，并且被精炼到燃料添加剂中用于生产生物燃料产品。在某些实施方案中，油组合物包含萜烯、类萜、异戊二烯或类异戊二烯。在其它实施方案中，生物燃料产品具有85-120的辛烷值或大于90的辛烷值。实施例
[0150] 实施例1
[0151] 用于C1代谢微生物产生脂质的培养和生物反应器条件
[0152] 本公开的示范性的C1代谢微生物(甲烷营养菌、甲基营养菌、梭菌)在管中、在小瓶中、在瓶中、在板上或在生物反应器中培养(发酵)。用于多种微生物的生长条件、培养基和碳源描述于本实施例中。
[0153] 发孢甲基弯菌菌株OB3b(NCIMB 11131)；甲基单胞菌属菌株16a(ATCC PTA-2402)；或甲烷甲基单胞菌
[0154] 对于血清瓶来说，在30℃下于Higgins最低硝酸盐培养基(NSM；Cornish等,J.Gen.Microbiol.130:2565,1984；Park等,Biotechnol.Bioeng.38:423,1991)或MM-W1培养基中培养细菌。将顶部空间组成调整为1:1体积的甲烷:空气。将这些瓶以200-250rpm的速率振荡。或者，将培养物维持于在含有1:1(v/v)甲烷:空气气体混合物的气密室中或在甲醇蒸气(经由石腊膜密封板的盖子中的0.5mL甲醇)存在下生长的含有1.5％w/v琼脂的NSM培养基板上，或补充有0.5％甲醇的NSM培养基板上。将板在30℃下于加湿室中倒置孵育。
[0155] 所用NSM培养基的组成如下：1.0g MgSO4*7H2O、0.20g CaCl2*6H2O、2.0ml螯合铁溶液(0.1g柠檬酸铁(III)铵或0.5g氯化铁(III)；0.2g EDTA钠盐；0.3ml浓盐酸；100.0ml蒸馏去离子水)、1.0g KNO3、0.5ml微量元素溶液(500.0mg EDTA、200.0mg FeSO4*7H2O、10.0mg ZnSO4*7H2O、3.0mg MnCl2*4H2O、30.0mg H3BO3、20.0mg CoCl2*6H2O、1.0mg CaCl2*2H2O、2.0mg NiCl2*6H2O、3.0mg Na2MoO4*2H2O、1.0L蒸馏水)、0.272g KH2PO4、0.717g Na2HPO4*
12H2O，任选12.5g纯化琼脂(例如，Oxoid L28或BactoTM琼脂；在制造板时使用)、1.0L蒸馏去离子水，将pH调整到6.8并且在121℃下高压灭菌15分钟。
12H2O，任选12.5g纯化琼脂(例如，Oxoid L28或BactoTM琼脂；在制造板时使用)、1.0L蒸馏去离子水，将pH调整到6.8并且在121℃下高压灭菌15分钟。
[0156] 对于发酵来说，将含有1L灭菌的确定成分培养基MM-W1的2升生物反应器用来自在供给有甲烷与空气的1:1(v/v)混合物的MM-W1中生长的血清瓶分批培养物(10-20％v/v)的细胞接种。所用培养基MM-W1的组成如下：0.8mM MgSO4*7H2O、10mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4*2H2O、1μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA，以及每升1mL的微量金属溶液(每升含有500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*
7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在高压灭菌并冷却培养基之后，添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。在某些发酵中添加至多
0.1％(w/v)的碳酸氢盐。使用顶置式叶轮以恒定的750rpm搅拌反应器内容物。使用以约
60mL/min到约120mL/min喷射的恒定甲烷向培养物补料，同时以约10-100mL/min的可变速率供给浓缩氧气(至少85％)来维持约40％到约80％的溶解氧水平(相对于培养基的空气饱和度)。
7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在高压灭菌并冷却培养基之后，添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。在某些发酵中添加至多
0.1％(w/v)的碳酸氢盐。使用顶置式叶轮以恒定的750rpm搅拌反应器内容物。使用以约
60mL/min到约120mL/min喷射的恒定甲烷向培养物补料，同时以约10-100mL/min的可变速率供给浓缩氧气(至少85％)来维持约40％到约80％的溶解氧水平(相对于培养基的空气饱和度)。
[0157] 将生物反应器中的温度维持于30℃，并且约每隔4小时到约24小时(对应于约5OD单位的OD600增加)向培养物中自动添加0.5M NaOH和0.5M HCl连同其它添加一起将pH维持于7.1±0.1。其它添加在金属添加(10μM CuSO4、5μM FeSO4、5μM FeIII-Na-EDTA最终浓度)与营养素添加(5.75mM KxHyPO4、10mM NaNO3)之间交替进行。在这些条件下，观测到基本上成线性的生长，其中有效的生物质产生速率为每天每升约2.7到约3.3克细胞干重到大于20的OD600。通过离心收集培养生物质，在MM-W1培养基中洗涤一次，并且将所回收的生物质在-80℃下冷冻或立即用于细胞组分的分级(例如，脂质提取)。
[0158] 还可以应用半连续发酵方法来维持生物质生产力并且减少与发酵停止和启动相关的时间(即，周转时间或前置时间)。
[0159] 在培养物密度接近静止期时(但在进入静止期之前)，以约12-24小时的时间间隔进行细菌生物质的收集。通过经由离心泵转移到独立的容器中来移出约一半的生物反应器体积。然后，使等体积的灭菌或再循环的培养基返回到生物反应器，以使得反应器的光密度约为其初始值的一半。根据上述方案继续进行生物反应器发酵，以便可以在单次发酵运作期间进行多个周期的生长和生物质回收。
[0160] 荚膜甲基球菌Bath(NCIMB 11132)
[0161] 在42℃下于含有Higgins最低硝酸盐培养基(NSM)或MM-W1培养基的血清瓶中培养细菌。将顶部空间组成调整为1:1体积的甲烷:空气。将这些瓶以200-250rpm的速率振荡。或者，将培养物维持于在含有1:1(v/v)甲烷:空气气体混合物的气密室中生长的用1.5％w/v琼脂固化的NSM培养基板上。将板在42℃下于这个室中倒置孵育。
[0162] 对于发酵来说，将含有1.25L灭菌的培养基MMF1.1的3升生物反应器用来自在供给有甲烷与空气的1:1(v/v)混合物的相同培养基中生长的血清瓶分批培养物(10-20％v/v)的细胞接种。培养基MMF1.1的组成如下：0.8mM MgSO4*7H2O、40mM NaNO3、0.14mM CaCl2、6mM NaHCO3、4.7mM KH2PO4、6.8mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4*2H2O、6μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA，以及每升1mL的微量金属溶液(每升含有500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在高压灭菌并冷却培养基之后，添加磷酸盐、碳酸氢盐和FeIII-Na-EDTA。使用顶置式叶轮以恒定的
750rpm搅拌反应器内容物。使用以约60mL/min到约200mL/min喷射的恒定甲烷向培养物补料，同时以15-90mL/min的可变速率供给浓缩氧气(>85％)，并且维持溶解氧水平低于10％(相对于培养基的空气饱和度)。
750rpm搅拌反应器内容物。使用以约60mL/min到约200mL/min喷射的恒定甲烷向培养物补料，同时以15-90mL/min的可变速率供给浓缩氧气(>85％)，并且维持溶解氧水平低于10％(相对于培养基的空气饱和度)。
[0163] 将生物反应器中的温度维持于44℃，并且每隔3-6小时(在达到OD 5之后对应于约3-5OD单位的OD600增加)向培养物中自动添加0.5M NaOH和0.5M HCl连同添加铜和铁(5μM CuSO4、5μM FeSO4、10μM FeIII-Na-EDTA最终浓度)一起将pH维持于7.0±0.1。在这些条件下，观测到基本上成线性的生长，其中有效的生物质产生速率为每天每升大于5克细胞干重到大于10的OD600。通过离心收集培养生物质，在MM-W1培养基中洗涤细胞一次，并且将细胞团在-80℃下冷冻或立即用于细胞组分的分级。
[0164] 营养素耗尽被公认为可能限制发酵期间的生长产量的问题。为了避免营养素，主要是氮和磷酸盐的限制，在培养物的OD600超过5之后，起始由2倍浓缩的MMF1.1组成的营养素补料。以对应于培养物的生长速率的约一半的稀释速率来起始营养素补料以避免洗出(wash-out)并维持OD的增加同时扩展培养物体积。根据上述方案继续进行生物反应器发酵，以便可以在单次发酵运作期间进行多个周期的生长和生物质回收。
[0165] 扭脱甲基杆菌或发孢甲基弯菌菌株OB3b(NCIMB 11131)
[0166] 在30℃下于含有补充有0.5％甲醇的Higgins最低硝酸盐培养基(NSM)的管中培养细菌。将这些管以200-250rpm的速率振荡。或者，将培养物维持于在甲醇蒸气(经由石腊膜密封板的盖子中的0.5mL甲醇)存在下生长或补充有0.5％甲醇的含有1.5％w/v琼脂的NSM培养基板上。将板在30℃下在标准大气压下于加湿室中倒置孵育。
[0167] 对于发酵来说，将含有1L确定成分培养基MM-W1的2升生物反应器用来自培养管分批培养物(10-20％v/v)的细胞接种。培养基MM-W1的组成如上文所描述。使用顶置式叶轮以恒定的800rpm搅拌反应器内容物。用初始剂量到0.5％的最终浓度的甲醇和可变的甲醇补料向培养物补料，同时以30-100mL/min的可变速率供给纯氧来维持60-90％的溶解氧水平(相对于培养基的空气饱和度)。
[0168] 将生物反应器中的温度维持于30℃，并且如上文所描述自动添加0.5M NaOH和1M HCl连同添加金属和营养素一起将pH维持于7.1±0.1。在这些条件下，观测到基本上成线性的生长，其中有效的生物质产生速率为每天每升2.7到3.3克细胞干重到大于20的OD600。通过离心收集培养生物质，在MM-W1培养基中洗涤细胞一次，并且将细胞团在-80℃下冷冻或立即用于细胞组分的分级。
[0169] 还可以应用半连续发酵方法来维持生物质生产力并且减少与发酵停止和启动相关的时间(即，周转时间或前置时间)。
[0170] 在培养物密度接近静止期时(但在进入静止期之前)，以约12-24小时的时间间隔进行积累的细菌生物质的收集。通过经由离心泵转移到独立的容器中来移出约一半的生物反应器体积。然后，使等体积的新鲜或再循环的培养基返回到生物反应器，以使得反应器的光密度约为其初始值的一半。根据上述方案继续进行生物反应器发酵，以便在单次发酵运作期间进行多个周期的生长和生物质回收。
[0171] 产乙醇梭菌和杨氏梭菌
[0172] 在37℃下在具有丁基橡胶塞和200kPa炼钢厂废气的塑料涂布的500ml-SchottGL45瓶中于100mL改良的PETC培养基(ATCC培养基1754)中以厌氧方式培养梭菌细菌。通过测量600nm下的光密度(OD600)来监测生长。
[0173] 改良的PETC培养基含有(每升)1g NH4Cl、0.4g KCl、0.2g MgSO4*7H2O、0.8g NaCl、0.1g KH2PO4、20mg CaCl2*2H2O、10ml微量元素溶液(见下文)、10ml沃尔夫氏维生素溶液(Wolfe's vitamin solution)(见下文)、2g NaHCO3和1mg刃天青(resazurin)。将pH调整到
5.6之后，将培养基煮沸，以厌氧方式分配，并且在121℃下高压灭菌15分钟。炼钢厂废气(组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)或等效的合成混合物用作碳源。培养基具有5.9的最终pH并且用0.008％(w/v)的浓度的半胱氨酸-HCl和Na2S还原。
5.6之后，将培养基煮沸，以厌氧方式分配，并且在121℃下高压灭菌15分钟。炼钢厂废气(组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)或等效的合成混合物用作碳源。培养基具有5.9的最终pH并且用0.008％(w/v)的浓度的半胱氨酸-HCl和Na2S还原。
[0174] 微量元素溶液每升含有2g次氮基三乙酸(在添加其余成分之前用KOH调整到pH 6)、1g MnSO4、0.8g Fe(SO4)2(NH4)2*6H2O、0.2g CoCl2*6H2O、0.2mg ZnSO4*7H2O、20mg CuCl2*
2H2O、20mg NiCl2*6H2O、20mg Na2MoO4*2H2O、20mg Na2SeO4和20mg Na2WO4。
2H2O、20mg NiCl2*6H2O、20mg Na2MoO4*2H2O、20mg Na2SeO4和20mg Na2WO4。
[0175] 沃尔夫氏维生素溶液(Wolin等,J.Biol.Chem.238:2882,1963)含有(每升)2mg生物素、2mg叶酸、10mg盐酸吡哆辛(pyridoxine hydrochloride)、5mg硫胺素-HCl、5mg核黄素、5mg烟酸、5mg D-(+)-泛酸钙、0.1mg维生素B12、5mg对氨基苯甲酸和5mg硫辛酸。
[0176] a.产乙醇梭菌发酵
[0177] 使用与例如美国专利申请号2011/0300593中所描述的那些类似的方法来进行产乙醇梭菌的发酵。简单地说，用N2气喷射含有1.3L溶液A(3.083g NH4Ac；0.61g MgCl2*6H2O；0.294g CaCl2*2H2O；0.15g KCl；0.12g NaCl(任选的)；用蒸馏水达到1L)的2升生物反应器。
添加H3PO4的85％溶液(2.025mL，30mM)，并且使用浓NH4OH水溶液将pH调整到5.3。然后，添加
13.5mL溶液B(20.0mg生物素；20.0mg叶酸；10.0mg盐酸吡哆辛；50.0mg硫胺素*HCl；50.0mg核黄素；50.0mg烟酸；50.0mg D-(*)-泛酸钙；50.0mg维生素B12；50.0mg对氨基苯甲酸；
50.0mg硫辛酸；用蒸馏水达到1L)，且用N2气喷射溶液。添加氯化铬(II)直到溶液的氧化还原电位(ORP)下降到约-200mV，其中添加刃天青(1.35mL的2g/L溶液)。添加多硫化钠(5.4mL的3M溶液，见下文)，并且用N2、然后用含CO气体(1％H2；13％N2；71％CO；15％CO2)喷射溶液。
添加金属硫化物溶液(150mL，见下文)，且再喷射溶液30分钟，随后用约5％(v/v)的水平的活跃地生长的产乙醇梭菌培养物接种。
添加H3PO4的85％溶液(2.025mL，30mM)，并且使用浓NH4OH水溶液将pH调整到5.3。然后，添加
13.5mL溶液B(20.0mg生物素；20.0mg叶酸；10.0mg盐酸吡哆辛；50.0mg硫胺素*HCl；50.0mg核黄素；50.0mg烟酸；50.0mg D-(*)-泛酸钙；50.0mg维生素B12；50.0mg对氨基苯甲酸；
50.0mg硫辛酸；用蒸馏水达到1L)，且用N2气喷射溶液。添加氯化铬(II)直到溶液的氧化还原电位(ORP)下降到约-200mV，其中添加刃天青(1.35mL的2g/L溶液)。添加多硫化钠(5.4mL的3M溶液，见下文)，并且用N2、然后用含CO气体(1％H2；13％N2；71％CO；15％CO2)喷射溶液。
添加金属硫化物溶液(150mL，见下文)，且再喷射溶液30分钟，随后用约5％(v/v)的水平的活跃地生长的产乙醇梭菌培养物接种。
[0178] 在装有Na2S(93.7g，0.39mol)和200ml H2O的500ml烧瓶中制备多硫化钠溶液。搅拌溶液直到盐溶解，并且在恒定的N2流下添加硫(25g，0.1mol)。在室温下搅拌2小时后，将现在是澄清的红棕色液体的多硫化钠溶液(关于Na约4M以及关于硫约5M)转移到N2净化的血清瓶中，并且包裹在铝箔中。
[0179] 在1L三颈烧瓶中制备铬(II)溶液，这个三颈烧瓶配备有气密入口和出口以允许在惰性气体下工作并且随后将所需的产物转移到适合的储存烧瓶中。向烧瓶中装入CrCl3*6H2O(40g，0.15mol)、锌粒[20目](18.3g，0.28mol)、汞(13.55g，1mL，0.0676mol)和500mL蒸馏水。用N2吹洗一小时后，将混合物升温到约80℃以起始反应。在恒定的N2流下搅拌两小时后，冷却混合物到室温并且再连续搅拌48小时，届时反应混合物变成深蓝色溶液。将溶液转移到N2净化的血清瓶中并且在4℃下储存以供将来使用。
[0180] 通过将约950mL溶液A添加到1L发酵罐中并且用N2气喷射来制备金属硫化物溶液。添加H3PO4的85％溶液(1.5mL，30mM)，并且使用浓NH4OH水溶液将pH调整到5.3。添加溶液B(10mL)，并且用N2喷射溶液。添加氯化铬(II)直到溶液的氧化还原电位(ORP)下降到约-
200mV，其中添加刃天青(1mL的2g/L溶液)。添加溶液C(1/10；10ml FeCl3；5ml CoCl2；5ml NiCl2；1ml H3BO3；1ml Na2MoO4；1ml MnCl2；1ml Na2WO4；1ml ZnCl2；1ml Na2SeO3；添加到1L培养基中)，然后添加多硫化钠(2mL的3M溶液)，然后用N2气喷射溶液。
200mV，其中添加刃天青(1mL的2g/L溶液)。添加溶液C(1/10；10ml FeCl3；5ml CoCl2；5ml NiCl2；1ml H3BO3；1ml Na2MoO4；1ml MnCl2；1ml Na2WO4；1ml ZnCl2；1ml Na2SeO3；添加到1L培养基中)，然后添加多硫化钠(2mL的3M溶液)，然后用N2气喷射溶液。
[0181] 在分批条件下在多硫化物存在下用产乙醇梭菌使包含CO的底物发酵得到实质上增加的积累速率以及经过2-3天的时段约4g/L的最终生物质积累。举例来说，在约1天的短暂停滞期之后，经过约36小时的发酵，生物质可以从约0.5g/L增加到至少3.5g/L。此外，在多硫化物存在下在生长期期间不产生乙酸盐(如在分批发酵中通常所见)，并且在某些情况下一些乙酸盐被消耗，使得发酵罐中存在乙酸盐量的净减少。通过离心收集培养生物质，在培养基中洗涤细胞一次，并且将细胞团在-80℃下冷冻或立即用于细胞组分的分级。
[0182] 还可以应用半连续发酵方法来维持生物质生产力并且减少与发酵停止和启动相关的时间(即，周转时间或前置时间)。
[0183] 在培养物密度接近静止期时(但在进入静止期之前)，以约12-24小时的时间间隔进行积累的细菌生物质的收集。通过经由离心泵转移到独立的容器中来移出约一半的生物反应器体积。然后，使等体积的新鲜或再循环的培养基返回到生物反应器，以使得反应器的光密度约为其初始值的一半。根据上述方案继续进行生物反应器发酵，以便在单次发酵运作期间进行多个周期的生长和生物质回收。
[0184] b.杨氏梭菌发酵
[0185] 使用与例如美国专利号5,173,429和5,593,886中所描述的那些类似的方法来进行杨氏梭菌的发酵。简单地说，使用杨氏梭菌的生物纯的培养物进行分批发酵。在80％氮气和20％CO2的气氛中以厌氧方式进行培养基的制备((1)80.0mL盐，其包含3.00g/L KH2PO4、3.00g/L K2HPO4、6.00g/L(NH4)2SO4、6.00g/L NaCl、1.25g/L Mg SO4*2H2O；(2)1.0g酵母提取物；(3)1.0g胰酶解酪蛋白；(4)3.0ml PFN(Pfenning)微量金属溶液，其包含1500mg FeCl2*4H2O、100mg ZnSO4*7H2O、30mg MnCl2*4H2O、300mg H3BO3、200mg CoCl2*6H2O、10mg CuCl2*H2O、20mg NiCl2*6H2O、30mg NaMoO4*2H2O、10mg Na2SeO3，以及蒸馏水达到1L；(5)
10.0ml维生素B，其包含10mg吡哆醛HCl、50mg核黄素、50mg硫胺素HCl、50mg烟酸、50mg D-泛酸钙、60mg硫辛酸、50mg对氨基苯甲酸、20mg叶酸、20mg生物素、50mg氰钴胺(cyanocoba lamin)，以及蒸馏水达到1L；(6)0.5g半胱氨酸HCl；(7)0.06gCaCl2*2H2O；(8)2.0g NaHCO3；
(9)1.0mL刃天青(0.01％)；以及(10)920.0mL蒸馏水)。在发酵期间控制培养基的pH，并且用HCl维持于5.0。如有需要，用无菌的10％NaOH或1.0％乙酸溶液对pH作调整。将培养基转移到157.5mL血清瓶中，并且用丁基橡胶塞和铝密封圈密封。然后将这些瓶在121℃下高压灭菌20分钟。
10.0ml维生素B，其包含10mg吡哆醛HCl、50mg核黄素、50mg硫胺素HCl、50mg烟酸、50mg D-泛酸钙、60mg硫辛酸、50mg对氨基苯甲酸、20mg叶酸、20mg生物素、50mg氰钴胺(cyanocoba lamin)，以及蒸馏水达到1L；(6)0.5g半胱氨酸HCl；(7)0.06gCaCl2*2H2O；(8)2.0g NaHCO3；
(9)1.0mL刃天青(0.01％)；以及(10)920.0mL蒸馏水)。在发酵期间控制培养基的pH，并且用HCl维持于5.0。如有需要，用无菌的10％NaOH或1.0％乙酸溶液对pH作调整。将培养基转移到157.5mL血清瓶中，并且用丁基橡胶塞和铝密封圈密封。然后将这些瓶在121℃下高压灭菌20分钟。
[0186] 在开始实验之前约48小时，类似于如上文所描述的那些，从瓶中的杨氏梭菌的储备培养物来制备种子培养物。使种子培养物在37℃下于振荡孵育箱中生长并且以100rpm振荡。将还原溶液(2.0ml Na2S的2.5％溶液和2.0ml半胱氨酸-HCl的3.5％溶液)添加到培养物中，将其放置在振荡孵育箱中约15分钟以允许完全去除氧并适应温度。不同于用于分离生物体的生物纯的培养物的程序，在分批发酵中不需要添加甲烷抑制剂。
[0187] 在37℃下在含有营养素培养基的New Brunswick Scientific Bioflow IIc 2.5升发酵罐中用杨氏梭菌进行发酵，并且维持1.5升的恒定流体水平，同时使用以约500立方厘米/分钟的速率引入的气体以至多1,000转/分钟的可变速率搅动流体。最佳气体保留时间在三分钟的范围内。气体补料随着其被细菌吸收而变化，这种吸收又随细胞密度而变。
[0188] 在培养物密度接近静止期时(但在进入静止期之前)，以约12-24小时的时间间隔进行积累的细菌生物质的收集。通过经由离心泵转移到独立的容器中来移出约一半的生物反应器体积。然后，使等体积的新鲜或再循环的培养基返回到生物反应器，以使得反应器的光密度约为其初始值的一半。根据上述方案继续进行生物反应器发酵，以便在单次发酵运作期间进行多个周期的生长和生物质回收。
[0189] 实施例2
[0190] 经过工程改造以增强脂质产生的C1代谢微生物
[0191] 宿主细胞经过工程改造而具有遗传修饰以最小化或减少脂肪酸的降解-通过敲除由内源fadD基因编码的长链脂肪酸-CoA连接酶活性。此外，通过将硫酯酶(TE)基因引入到本公开的甲烷营养菌(荚膜甲基球菌)中来增强游离脂肪酸(FFA)的生物合成。所述重组改变进一步描述于本实施例中。
[0192] 重组核酸分子
[0193] 编码野生型FadD蛋白质的核酸序列是用于设计突变型fadD基因的参考标准起点。举例来说，由发孢甲基弯菌OB3b、荚膜甲基球菌Bath、甲烷甲基单胞菌、扭脱甲基杆菌和杨氏梭菌编码的野生型FadD蛋白质序列分别以GenBank入藏号EFH00931.1、YP_114021.1、YP_
004512148.1、YP_002964871.1和YP_003782065.1提供。因此，个别地合成编码上述蛋白质的fadD基因的核酸分子以将数个终止突变和读框移位并入到来自发孢甲基弯菌OB3b(SEQ ID NO.:1)、甲烷甲基单胞菌(SEQ ID NO.:35)、扭脱甲基杆菌(SEQ ID NO.:52)和杨氏梭菌(SEQ ID NO.:85)的基因的5'区域中。对于荚膜甲基球菌fadD基因来说，合成包含内部缺失的核酸分子以便可以连接基因的剩余5'和3'末端以维持原始的阅读框架(SEQ ID NO.:
18)。
004512148.1、YP_002964871.1和YP_003782065.1提供。因此，个别地合成编码上述蛋白质的fadD基因的核酸分子以将数个终止突变和读框移位并入到来自发孢甲基弯菌OB3b(SEQ ID NO.:1)、甲烷甲基单胞菌(SEQ ID NO.:35)、扭脱甲基杆菌(SEQ ID NO.:52)和杨氏梭菌(SEQ ID NO.:85)的基因的5'区域中。对于荚膜甲基球菌fadD基因来说，合成包含内部缺失的核酸分子以便可以连接基因的剩余5'和3'末端以维持原始的阅读框架(SEQ ID NO.:
18)。
[0194] 对于产乙醇梭菌来说，可以对基因组进行测序，并且经由tblastn搜索(具有大肠杆菌FadD的蛋白质序列的经过翻译的核苷酸基因序列的搜索)来鉴别大肠杆菌的fadD同源物。合成产乙醇梭菌fadD基因的核酸分子以将数个终止突变和读框移位并入到基因的5'区域中。
[0195] 将突变型fadD核酸分子个别地克隆到质粒载体(缺乏甲烷营养菌或梭菌复制起点并编码卡那霉素(kanamycin)抗性)中用于使用本文所描述的方法接合、电穿孔或转化到C1代谢微生物中。这种载体(其在C1代谢微生物中不会复制)确保了任何卡那霉素抗性C1代谢微生物由于同源重组以及内源fadD基因被上述fadD突变体置换而将具有并入到宿主细胞基因组中的抗性基因(以使得重组细胞将缺乏或具有最小的长链脂肪酸-CoA连接酶活性)。
[0196] 另外，对一个或多个所选硫酯酶序列、丙二酰基CoA-酰基载体蛋白转酰酶(fabD)序列以及乙酰基-CoA羧化酶序列(例如，来自大肠杆菌的accA、accB、accC和accD)进行密码子优化并且用适当的启动子合成。然后，将一个或多个硫酯酶基因和乙酰基-CoA羧化酶基因(例如，accA或accABCD)克隆到适当的表达载体中，并且接合、电穿孔或转化到如本文所描述的野生型或fadD敲除C1代谢微生物中。
[0197] 密码子优化的硫酯酶序列如下所列：(1)对于发孢甲基弯菌OB3b，SEQ ID NO.:3-13；(2)对于荚膜甲基球菌Bath，SEQ ID NO.:20-30；(3)对于甲烷甲基单胞菌，SEQ ID NO.:
37-47；(4)对于扭脱甲基杆菌，SEQ ID NO.:54-64；(5)对于产乙醇梭菌，SEQ ID NO.:70-
80；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:87-97。密码子优化的fabD序列如下所列：(1)对于发孢甲基弯菌OB3b，SEQ ID NO.:2；(2)对于荚膜甲基球菌Bath，SEQ ID NO.:19；(3)对于甲烷甲基单胞菌，SEQ ID NO.:36；(4)对于扭脱甲基杆菌，SEQ ID NO.:53；(5)对于产乙醇梭菌，SEQ ID NO.:69；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:86。密码子优化的accA、accB、accC和accD序列分别如下所列：(1)对于发孢甲基弯菌OB3b，SEQ ID NO.:14-17；(2)对于荚膜甲基球菌Bath，SEQ ID NO.:31-34；(3)对于甲烷甲基单胞菌，SEQ ID NO.:48-51；(4)对于扭脱甲基杆菌，SEQ ID NO.:65-68；(5)对于产乙醇梭菌，SEQ ID NO.:81-84；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:98-101。
37-47；(4)对于扭脱甲基杆菌，SEQ ID NO.:54-64；(5)对于产乙醇梭菌，SEQ ID NO.:70-
80；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:87-97。密码子优化的fabD序列如下所列：(1)对于发孢甲基弯菌OB3b，SEQ ID NO.:2；(2)对于荚膜甲基球菌Bath，SEQ ID NO.:19；(3)对于甲烷甲基单胞菌，SEQ ID NO.:36；(4)对于扭脱甲基杆菌，SEQ ID NO.:53；(5)对于产乙醇梭菌，SEQ ID NO.:69；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:86。密码子优化的accA、accB、accC和accD序列分别如下所列：(1)对于发孢甲基弯菌OB3b，SEQ ID NO.:14-17；(2)对于荚膜甲基球菌Bath，SEQ ID NO.:31-34；(3)对于甲烷甲基单胞菌，SEQ ID NO.:48-51；(4)对于扭脱甲基杆菌，SEQ ID NO.:65-68；(5)对于产乙醇梭菌，SEQ ID NO.:81-84；以及(6)对于杨氏梭菌，SEQ ID NO.:98-101。
[0198] 接合
[0199] 用于将来自大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒接合到发孢甲基弯菌OB3b或甲烷甲基单胞菌中的程序是基于由Martin和Murrell(FEMS Microbiol.Lett.127:243,1995)开发的方法，而用于将来自大肠杆菌的质粒接合到荚膜甲基球菌中的程序是基于由Ali和Murrell(Microbiology 155:761,2009)报道的方法。
[0200] 简单地说，使用标准电穿孔方法将含有一个或多个所关注的基因(例如，突变型fadD、MCT、一个或多个TE、一个或多个Acc)并编码卡那霉素抗性的可移动质粒首先转化到大肠杆菌S17-1中。通过在含有30μg/mL卡那霉素的LB琼脂上选择卡那霉素抗性菌落来确认转化。将经过转化的菌落接种到含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，并且在37℃下振荡过夜。然后，在无菌的47mm硝化纤维素过滤器(0.2mm孔径)上收集过夜培养物的10mL等分试样。在过滤器上用50mL无菌NSM培养基洗涤大肠杆菌供体细胞以去除残余培养基和抗生素。
[0201] 平行地，将发孢甲基弯菌OB3b、甲烷甲基单胞菌或荚膜甲基球菌Bath受体菌株的样品独立地接种到含有20-50mL NSM培养基的100mL血清瓶中。然后用氧气与甲烷的1:1混合物吹洗瓶的顶部空间，并且将这些瓶用丁基橡胶隔膜密封并卷边。在30℃(发孢甲基弯菌OB3b、甲烷甲基单胞菌)或45℃(荚膜甲基球菌Bath)孵育箱中连续地振荡这些瓶直到达到约0.3的OD600。在与大肠杆菌供体菌株相同的过滤器上收集细胞。再次用50mL无菌NSM培养基洗涤过滤器。将过滤器放置(细胞朝上)在含有0.2％酵母提取物的NSM琼脂板上，并且在30℃(发孢甲基弯菌OB3b、甲烷甲基单胞菌)或37℃(荚膜甲基球菌Bath)下在甲烷与空气的
1:1混合物存在下孵育24小时。24小时后，使细胞再悬浮于10mL无菌(NSM)培养基中，随后通过离心浓缩。使所收集的细胞再悬浮于1mL无菌NSM培养基中，并且将等分试样(100μL)铺展到含有10μg/mL卡那霉素的NSM琼脂板上。
1:1混合物存在下孵育24小时。24小时后，使细胞再悬浮于10mL无菌(NSM)培养基中，随后通过离心浓缩。使所收集的细胞再悬浮于1mL无菌NSM培养基中，并且将等分试样(100μL)铺展到含有10μg/mL卡那霉素的NSM琼脂板上。
[0202] 将板在含有甲烷与空气的1:1混合物的密封室中孵育，并且维持在30℃(发孢甲基弯菌OB3b、甲烷甲基单胞菌)或45℃(荚膜甲基球菌Bath)下。每隔2天补充气体混合物直到形成菌落，通常是在7-14天之后。将菌落在含有卡那霉素的NSM板上划线培养以确认卡那霉素抗性以及进一步分离经过转化的甲烷营养菌细胞与残余大肠杆菌供体细胞。
[0203] 电穿孔-甲烷杆菌
[0204] 用 于 将 质粒 引 入到 扭 脱甲 基 杆 菌中 的 程 序是 基 于 U ed a 等 ,Appl.Environ.Microbiol.57:924,1991所描述的程序。简单地说，在30℃下于补充有0.5％甲醇的NSM培养基中培养野生型(wt)扭脱甲基杆菌。通过以6,000×g离心10分钟来收集生长到对数中期(1.4×109/ml)的扭脱甲基杆菌NR-2的细胞，并且用电穿孔缓冲液(10mM Tris-HCl、2mM MgCl2*6H20、10％[wt/vol]蔗糖[pH 7.5])洗涤。使细胞以7.0×1010/ml的细胞浓度再悬浮于相同缓冲液中。将细胞悬浮液和载体(70μg/mL)以9:1(vol/vol)的比率在管中混合，然后将10μL转移到一个室的电极之间的空间中，在此平衡3分钟。在经受10kV/cm电场的10次脉冲(每次脉冲持续300微秒)之后，将混合物的5μL等分试样转移到洁净的管中，并且添加0.2mL NSM培养基。然后在30℃下孵育细胞悬浮液2小时以允许表达抗生素抗性基因，随后涂于含有0.5甲醇和20μg/mL卡那霉素的NSM板上。
[0205] 将板在30℃下孵育直到形成菌落。将菌落在一式两份的板上划线培养以确认卡那霉素抗性以及进一步分离经过转化的甲基营养菌细胞与残余大肠杆菌供体细胞。
[0206] 电穿孔-梭菌
[0207] 用于产乙醇梭菌或杨氏梭菌的转化方法如美国专利公布号2011/0236941中所描述，或使用经过修改的用于酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)的方案(Zhu等,Biotechnol.Bioeng.90:154,2005)来进行。简单地说，为了制造感受态细胞，根据本文所描述的培养条件将产乙醇梭菌的50mL培养物次培养到新鲜培养基中，持续3个连续日。使用这些细胞以0.05的OD600接种50mL含有40mM DL-苏氨酸的PETC培养基。当培养物达到0.4的OD600时，将细胞转移到厌氧室中，并且在4,700×g和4℃下收集。用冰冷的电穿孔缓冲液(270mM蔗糖、1mM MgCl2、7mM磷酸钠，pH 7.4)洗涤培养物两次，并且最后悬浮于600μl体积的新鲜电穿孔缓冲液中。将这种混合物转移到具有0.4cm电极间隙并含有1μg载体(缺乏梭菌复制起点并且含有所关注的核酸分子并编码克拉霉素(clarithromycin)抗性)的预冷却的电穿孔试管中，并且立即使用具有以下设置的Gene pulser Xcell电穿孔系统(Bio-Rad)进行脉冲：2.5kV、600μl和25μF。获得3.7-4.0ms的时间常数。将培养物转移到5ml新鲜培养基中。在600nm的波长下使用配备有管座的Spectronic Helios Epsilon分光光度计(Thermo)来监测细胞的再生。在生物质初始下降之后，细胞开始再次生长。在生物质从那个点起已经加倍后，收集细胞，使其悬浮于200μl新鲜培养基中，并且涂于具有4μg/μl克拉霉TM
素的选择性PETC板(含有1.2％Bacto 琼脂(BD))上。在37℃下与30psi炼钢厂气体一起孵育
4-5天之后，菌落明显可见。
素的选择性PETC板(含有1.2％Bacto 琼脂(BD))上。在37℃下与30psi炼钢厂气体一起孵育
4-5天之后，菌落明显可见。
[0208] 或者，在电穿孔脉冲之后，将细胞转移到亨盖特管(Hungate tube)中的5mL预升温之培养基中，并且在37℃下孵育直到生长可见(使用光度计在亨盖特管中测量)。将转化体的等分试样接种到5mL液体培养基中并且铺展到含克拉霉素板上以显现突变型菌落。
[0209] 使用所选的重组菌落来接种2ml含有4μg/μl克拉霉素的PETC培养基。当生长出现时，将培养物按比例放大到5ml并且稍后到50ml含有4μg/μl克拉霉素的PETC培养基中，并且使用30psi炼钢厂气体作为碳源。
[0210] 重组C1代谢细菌
[0211] 通过细胞对抗生素选择的抗性来确认转化，并且通过PCR、北方墨点、西方墨点或ELISA方法来确认基因表达。举例来说，为了验证转移，可以分离出质粒DNA，并且使用illustra PuReTaq Ready-To-GoTMPCR珠粒(GE Healthcare)，使用标准条件(95℃持续5分钟；95℃持续30秒、50℃持续30秒以及72℃持续1分钟的32个循环；72℃持续10分钟)对其进行PCR。作为进一步控制，将1μl每个分离的质粒再转化到大肠杆菌XL1-Blue MRF'Kan(Stratagene,La Jolla,CA)中，从这里可以干净地分离出质粒并且通过限制性消化来验证。
[0212] 在本领域中充分确立了鉴别同源重组事件的方法，例如在基因组和载体中使用独特的引物进行PCR和测序以确认适当的插入。然后，使被鉴别为具有适当的插入的重组细菌在不存在选择压力(例如，没有卡那霉素或克拉霉素)的情况下生长几代，并且通过影印培养(或等效技术)来鉴别卡那霉素敏感性克隆体。约50％的卡那霉素敏感性回复体应具有突变形式的靶基因替代野生型，这通过PCR和测序来确认。fadD表达或功能的损失可以通过以下一者或多者来验证：(1)PCR和测序，(2)北方墨点分析，以及(3)检验酰基-CoA合成酶活性。
[0213] 对于酰基-CoA合成酶活性来说，可以通过使细胞在具有抗生素(需要时)的NSM中生长到对数中期，通过离心收集细胞，用NSM洗涤两次，使细胞以1.2×109个细胞/毫升的密度悬浮于10mMTris-HC1(pH 7.5)中，然后通过在冰上进行三个周期的声波处理而溶解来使用例如Kameda等(J.Biol.Chem.256:5702,1981)的方法。制备0.5ml总体积的反应混合物，其包括200mM Tris-HC1(pH 7.5)、2.5mM ATP、8mM MgCl、2mM EDTA、20mM NaF、0.1％X-100、10pM[3H]油酸酯、0.5mM辅酶A和细胞提取物。通过添加辅酶A来起始酶反应，在35℃下孵育10分钟，并且通过添加2.5ml异丙醇:正庚烷:l M H2SO4(40:10:1)来终止。通过使用正庚烷进行有机提取来去除放射性油酸，而在反应期间形成的油酰基-CoA保留在水性部分中有待通过闪烁计数来定量。使用Bradford检验以牛血清白蛋白作为标准物来测定酶提取物中的蛋白质浓度。
[0214] 从C1底物(CH4和CO)产生脂肪酸
[0215] 对于甲烷营养菌来说，用含有编码一个或多个硫酯酶基因的基因或过度表达乙酰基-CoA羧化酶基因的载体转化的野生型或fadD敲除的发孢甲基弯菌OB3b、甲烷甲基单胞菌、扭脱甲基杆菌或荚膜甲基球菌Bath被用来接种100mL含有20-50mL NSM培养基和10μg/mL卡那霉素的血清瓶或培养管。对于扭脱甲基杆菌来说，用0.5％甲醇作为碳源来补充培养基，而对于发孢甲基弯菌OB3b、甲烷甲基单胞菌和荚膜甲基球菌Bath来说，用氧气与甲烷的1:1混合物作为碳源来吹洗瓶的顶部空间。将这些瓶用丁基橡胶隔膜密封并卷边。然后，在孵育期间在30℃(发孢甲基弯菌OB3b、甲烷甲基单胞菌、扭脱甲基杆菌)或42-45℃(荚膜甲基球菌Bath)下以200-250rpm的速率连续地振荡这些瓶或管。
[0216] 对于梭菌来说，用含有编码一个或多个硫酯酶的基因并且具有或没有乙酰基-CoA羧化酶基因的载体转化的野生型或fadD敲除的产乙醇梭菌或杨氏梭菌被用来接种2ml含有4μg/μl克拉霉素的PETC培养基。当生长出现时，将培养物按比例放大到5ml并且稍后到50ml含有4μg/μl克拉霉素的PETC培养基中，并且使用30psi炼钢厂气体作为碳源。然后，在孵育期间在37℃下以200-250rpm的速率连续地振荡这些瓶。
[0217] 使用气相色谱仪/质谱仪(GC/MS)进行重组C1代谢细菌所产生的脂肪酸的定量。通过与作为内标的含有十一烷酸的乙酸丁酯一起剧烈地涡旋来提取细胞培养物中的脂肪酸用于提取物的GC/MS分析。在混合物的短暂离心之后，将小部分的有机层转移到独立的小瓶中，接下来添加等体积的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。通过具有质谱仪检测器(HP 5792)的GC，使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(30.0m×250μM×0.25μM膜厚度)来分析样品。在
250℃下20:1的分流比用于注射器，并且氦为1.2mL/min的流速的载气。将烘箱温度在60℃下保持1分钟，接下来是19℃/min的温度梯度增加直到达到250℃的温度。使用选择性离子模式，基于脂肪酸标准的校准曲线来计算细胞培养物中脂肪酸的浓度。因为甲烷是向细胞提供的唯一碳源，所以所产生的所有脂肪酸都必须来源于甲烷。
250℃下20:1的分流比用于注射器，并且氦为1.2mL/min的流速的载气。将烘箱温度在60℃下保持1分钟，接下来是19℃/min的温度梯度增加直到达到250℃的温度。使用选择性离子模式，基于脂肪酸标准的校准曲线来计算细胞培养物中脂肪酸的浓度。因为甲烷是向细胞提供的唯一碳源，所以所产生的所有脂肪酸都必须来源于甲烷。
[0218] 结果
[0219] 通过敲除fadD并且通过引入和表达大肠杆菌硫酯酶基因来改变荚膜甲基球菌Bath的脂肪酸型态。首先，使用经过设计以产生具有不同表达水平的变异体的三种不同的密码子组成(TesA'-3，SEQ ID NO:102；TesA'-37，SEQ ID NO:103；以及TesA'-20，SEQ ID NO:104)来合成周质靶向序列被去除的大肠杆菌硫酯酶基因(TesA')。将TesA'变异体克隆到基于IncP的质粒(包含Inc-P oriV和oriT)中，并且操作性地连接到在甲烷营养菌中发挥功能的启动子。将含有TesA'的重组表达载体转化到如本文所描述的荚膜甲基球菌中。使150mL密封血清瓶中的5mL体积的荚膜甲基球菌培养物在40mL甲烷和80mL氧气下生长5天。
在生长阶段之后，使用如本文所描述的GC/MS来检验1mL的每种培养物的脂肪酸浓度和组成。将测量的游离脂肪酸值针对培养物的OD600标准化。注意，C16:1部分由至少三种不同的同分异构体组成，其中最丰富的是Δ9-顺式棕榈烯酸(数据未示出)。
在生长阶段之后，使用如本文所描述的GC/MS来检验1mL的每种培养物的脂肪酸浓度和组成。将测量的游离脂肪酸值针对培养物的OD600标准化。注意，C16:1部分由至少三种不同的同分异构体组成，其中最丰富的是Δ9-顺式棕榈烯酸(数据未示出)。
[0220] 平行地，将大肠杆菌酰基辅酶A(CoA)合成酶(fadD)的同源物以重组方式敲除如本文所描述的荚膜甲基球菌基因组中的SEQ ID NO:18，并且通过PCR分析来确认。FadD敲除已经在几种其它微生物菌株中显示出增加游离脂肪酸水平(参看例如Lennen等,Trends Biotechnol.12:659,2012)。荚膜甲基球菌fadD敲除突变体并不显示出游离脂肪酸水平的显著增加，这指示了一个或多个额外的FadD同源物可能存在于荚膜甲基球菌基因组中，但因为存在C18:0脂质的增加，所以脂质型态转变。
[0221] 经过转化的细胞中的游离脂肪酸汇集物大幅增加(参看图3A)，这种增加主要是归因于增加的C16:0和C18:0脂质水平(参看图3B)。
[0222] 实施例3
[0223] 从C1代谢微生物中提取脂质
[0224] 使用修改型式的Folch提取方案(Folch等,J.Biol.Chem.226:497,1957)来提取所收集的细菌生物质内所含的油组合物，这种方案在20℃(即，室温)下以及在由含一体积甲醇的两体积氯仿组成的提取溶液(CM溶液)中进行。约5g细胞湿重(WCW)的新鲜细菌生物质(或储存在-80℃下并且随后解冻的细菌生物质)用于提取。将100mL CM溶液添加到细胞物质中，并且在分液漏斗中剧烈地提取混合物。至少10分钟后，解析出三个相。含有提取的脂质的有机相沉降在分液漏斗的底部，其被排入到洁净的玻璃瓶中。中间层主要含有溶解的细胞物质，并且可以与含有盐和其它可溶性细胞组分的轻质水相分离。
[0225] 任选地，可以使用离心机或其它机械浓缩装置来浓缩水相中的固体。可以使从固体去除的水再循环，而可以将具有一些残余水的固体馈送到固体处理单元。
[0226] 为了提高脂质提取效率，通过将额外的100mL新鲜CM溶液直接添加到含有剩余溶解的细胞团块和残余水的分液漏斗中来进行第二提取步骤。将混合物再次剧烈地混合，使相分离，并且汇集来自两次提取的底部有机相。然后，在分液漏斗中用100mL去离子水洗涤汇集的有机相以去除任何残余水溶性物质。将分离的有机部分再次从分液漏斗的底部分离出，并且通过优选地在不存在氧气的情况下用热进行旋转蒸发，或通过在55℃下在氮气流下蒸发来去除溶剂。
[0227] 表1.从三种不同的甲烷营养菌提取的脂质含量
[0228]批号 参考菌株 脂质分数(g/g DCW)*
68C 发孢甲基弯菌OB3b 40.1
62A 荚膜甲基球菌Bath 10.3
66A 甲基单胞菌属16a 9.3
68C 发孢甲基弯菌OB3b 40.1
62A 荚膜甲基球菌Bath 10.3
66A 甲基单胞菌属16a 9.3
[0229] *克提取的物质/克细胞干重(DCW)
[0230] 将从发孢甲基弯菌OB3b、荚膜甲基球菌Bath和甲基单胞菌属16a的收集的培养物中提取的固化的油组合物各自称重，并且在表1中以原始细胞干重(DCW)的重量分数示出。这些数据显示，来自这些C1代谢微生物的DCW的大部分是由脂质组成。
[0231] 还使用Hara和Radin的己烷:异丙醇(HIP)提取方法(Anal.Biochem.90:420,1978)从甲基单胞菌属16a生物质中提取油组合物。使用HIP方法提取的油组合物的分析显示，这种油组合物基本上与使用修改的Folch方法提取的油组合物相同(数据未示出)。
[0232] 实施例4
[0233] 来自C1代谢微生物的脂质的脂肪酸甲酯转化
[0234] 用氢氧化钾(KOH)个别地水解从干固体形式的荚膜甲基球菌Bath、发孢甲基弯菌OB3b和甲基单胞菌属16a培养生物质中提取的脂质部分，并且经由在单一步骤中与甲醇反应而转化成脂肪酸甲酯(FAME)。用甲苯:甲醇(1:1v/v)的5mL 0.2M KOH溶液溶解10mL玻璃瓶中的约5g提取的固体脂质。剧烈地搅动这个瓶，然后在42℃下以250rpm混合60分钟，此后使溶液冷却到环境温度并转移到分液漏斗中。将约5mL蒸馏水和5mL CM溶液添加到分液漏斗中，混合，然后在重力作用下或通过离心(3,000rpm，25℃)5分钟使相分离。去除含有溶解的甘油磷酸酯的顶部水层，而收集重油相(底部)并且通过旋转蒸发或用恒定的氮气流浓缩到干燥。
[0235] 使用气相色谱仪/质谱仪(GC/MS)进行来自每种甲烷营养菌培养物的脂质中所见的FFA和FAME的分析。将在水解/酯基转移步骤之前和之后收集的固体溶解于300μL作为内标的含有十一烷酸的乙酸丁酯中用于GC/MS分析。使所得溶液以14,000rpm离心5分钟来去除不溶性残余物。将相同体积当量的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺添加到来自离心步骤的上清液中并且短暂地涡旋。将样品加载到配备有质谱仪检测器(HP 5792)的GC上，并且使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(30.0m×250μm×0.25μm膜厚度)来分离FFA和FAME。FFA和FAME的身份是使用其标准物的质谱的保留时间和电子电离来确认。GC/MS方法利用氦作为1.2mL/min的流速的载气。将注射口以20:1的分流比保持在250℃下。将烘箱温度在60℃下保持1分钟，接下来是包含8℃增加/分钟的温度梯度直到300℃。基于来自质量检测器响应的总离子来计算每个FFA和FAME的面积％。
[0236] 通过GC/MS分析在水解/酯基转移之前和之后收集的固体残余物的FFA和FAME(参看表2)。而且，来自GC/MS分析的色谱图提供于图4-6中。
[0237] 表2.在KOH水解/酯化之前和之后提取的脂质中的FFA和FAME的相对组成
[0238]
[0239]
[0240] *-＝未检出；面积％：MS检测器响应-总离子
[0241] 如从表2和图4-6显而易见，在水解/酯基转移之前提取的油组合物具有丰富的游离脂肪酸和作为(最有可能)二酰甘油和三酰甘油存在的额外脂肪酸(其在GC/MS迹线上没有检测到)，但FFA在水解/酯基转移之后转化成各种长度的脂肪酸甲酯。这些数据指示，来自本公开的C1代谢微生物的油组合物可以经过精炼并且用于制造高价值的分子。
[0242] 实施例5
[0243] 使用来自C1代谢微生物的油组合物生产生物燃料
[0244] 从C1代谢微生物中提取的油组合物可以在共同定位的精炼厂中处理或被运输到远处的精炼厂。精炼厂用于将来自生物可再生进料(例如脂肪、油脂和甲烷营养菌油)的三酸甘油酯转化成液态烃燃料(主要是生物柴油和生物喷气燃料)的混合物，一种高质量的合成石蜡煤油(SPK)。这个工艺需要氢气，其可以在现场使用甲烷重整来产生或通过在现有的精炼厂中共同定位发酵设施来提供。
[0245] 精炼厂可以按混合模式运作，其中输出是生物柴油与生物喷气燃料的混合物；或按柴油模式运作，其中输出主要是生物柴油。
[0246] 在精炼期间，将脂肪酸和甘油酯在三个步骤中转化成SPK。首先，处理原始的原料以去除催化剂污染物和水(必要时)。在第二步中，在氢化处理器中将脂肪酸链转化成正烷烃。一个实例是在氢化处理器中经由氢化和脱氧反应将油酸转化成正十八烷。对于大多数生物油、脂肪和油脂来说，氢化处理器的液体产品主要是C15-C18正烷烃组合物。在这个工艺的第三步中，将这些长的直链烷烃加氢裂化成较短的支链烷烃。加氢裂化的产品主要处于煤油的沸程内。
[0247] 所生产的SPK除了密度以外优选地满足或超过所有喷气燃料的适用规格。SPK的高H/C比，这赋予其极佳的热稳定性和低颗粒排放属性，意味着与775kg/m3的最低ASTM规范值相比较低密度的烃组成：760-770kg/m3。但是，这对于石油喷气燃料:SPK掺合物(例如，50/50)来说不是问题。
[0248] 实施例6
[0249] 来自C1代谢微生物的脂质中的稳定碳同位素分布
[0250] 经由元素分析仪/连续流同位素比质谱分析，使用与IsoPrime100 IRMS(Isoprime,Cheadle,UK)耦接的CHNOS元素分析仪(vario ISOTOPE cube,Elementar,Hanau,Germany)来分析发孢甲基弯菌生物质和脂质部分的干样品的碳和氮含量(干重％)
13 15
以及碳( C)和氮( N)的稳定同位素比。将在发酵罐或血清瓶中培养的甲烷营养菌生物质的样品离心，再悬浮于去离子水中，并且将对应于0.2-2mg碳(约0.5-5mg细胞干重)的体积转移到5×9mm锡囊(Costech Analytical Technologies,Inc.,Valencia,CA)中并在80℃下干燥24小时。类似地，使先前提取的脂质部分悬浮于氯仿中，并且将含有0.1-1.5mg碳的体积转移到锡囊中并在80℃下蒸发到干燥持续24小时。含有0.1mg碳的标准物提供可靠的δ13C值。
13 15
以及碳( C)和氮( N)的稳定同位素比。将在发酵罐或血清瓶中培养的甲烷营养菌生物质的样品离心，再悬浮于去离子水中，并且将对应于0.2-2mg碳(约0.5-5mg细胞干重)的体积转移到5×9mm锡囊(Costech Analytical Technologies,Inc.,Valencia,CA)中并在80℃下干燥24小时。类似地，使先前提取的脂质部分悬浮于氯仿中，并且将含有0.1-1.5mg碳的体积转移到锡囊中并在80℃下蒸发到干燥持续24小时。含有0.1mg碳的标准物提供可靠的δ13C值。
[0251] 同位素比以“δ”符号(‰)表示，其中以每百万偏差为基础的物质相对于标准物的同位素组成是用δ13C(或δ15N)＝(R样品/R标准物-1)×1,000给出，其中R是重同位素形式与轻同位素形式的分子比。碳的标准物是维也纳拟箭石化石(Vienna Pee Dee Belemnite；V-PDB)，并且氮的标准物是空气。国家标准与技术研究院(NIST；National Institute of Standards and Technology)提议的1547号标准参考物质(SRM；Standard Reference Material)，桃叶，用作校准标准。所有同位素分析都在稳定同位素生物地球化学中心(Center for Stable Isotope Biogeochemistry)(University of California,Berkeley)进行。C和N同位素分析的长期外部精度分别为0.10‰和0.15‰。
[0252] 发孢甲基弯菌菌株OB3b在三个不同的发酵批次中在甲烷上生长，荚膜甲基球菌Bath在两个不同的发酵批次中在甲烷上生长，并且甲基单胞菌属16a在单一的发酵批次中在甲烷上生长。分析来自这些培养物中的每一者的生物质的稳定碳同位素分布(δ13C值；参看表3)。
[0253] 表3.不同甲烷营养菌中的稳定碳同位素分布
[0254]
[0255]
[0256] *DCW，细胞干重以g/L报道，其使用特定的相关因子从测量的光密度(OD600)计算，这些相关因子涉及对于Mt OB3b来说1.0到0.558g/L的OD、对于Mc Bath来说1.0到0.355g/L的OD以及对于Mms 16a来说1.0到0.42g/L的OD。对于Mt OB3b来说，每个发酵所用的碳酸氢盐的初始浓度是1.2mM或0.01％(批号68C)以及0.1％或12mM(批号68A和68B)。
[0257] EFT＝有效发酵时间(小时)
[0258] 另外，对来自如实施例1中所描述在生物反应器中在甲烷上生长的菌株发孢甲基弯菌OB3b(Mt OB3b)、荚膜甲基球菌Bath(Mc Bath)和甲基单胞菌属16a(Mms 16a)的生物质和对应的脂质部分(参看表4)进行稳定碳同位素分析。
[0259] 表4.细胞和脂质中的稳定碳同位素分布
[0260]批号 菌株 δ13C细胞 δ13C脂质
68C Mt OB3b -57.7 -48.6
62A Mc Bath -57.6 -52.8
66A Mms 16a -64.4 -42.2
68C Mt OB3b -57.7 -48.6
62A Mc Bath -57.6 -52.8
66A Mms 16a -64.4 -42.2
[0261] 分别在94小时(3.14g DCW/L)、26小时(2.2g DCW/L)和39小时(1.14g DCW/L)收集来自菌株Mt OB3b、Mc Bath和Mms 16a的生物质。表4中脂质的δ13C值代表了一式两份的测定的平均值。
[0262] 实施例7
[0263] 甲烷来源和纯度对脂质中的稳定碳同位素分析的影响
[0264] 为了检查在含有天然气组分的甲烷上生长的甲烷营养菌，将一系列含有100mL确定成分培养基MMS1.0的0.5升血清瓶用来自在供给有甲烷与空气的1:1(v/v)混合物的相同培养基中生长的血清瓶分批培养物(5％v/v)的发孢甲基弯菌OB3b或荚膜甲基球菌Bath接种。培养基MMS1.0的组成如下：0.8mM MgSO4*7H2O、30mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4*2H2O、6μM CuSO4*5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA，以及每升1mL的微量金属溶液(每升含有：500mg FeSO4*7H2O、400mg ZnSO4*7H2O、20mg MnCl2*7H2O、50mg CoCl2*6H2O、10mg NiCl2*6H2O、15mg H3BO3、250mg EDTA)。在高压灭III
菌并冷却培养基之后，添加磷酸盐、碳酸氢盐和Fe -Na-EDTA。培养基的最终pH是7.0±
0.1。
菌并冷却培养基之后，添加磷酸盐、碳酸氢盐和Fe -Na-EDTA。培养基的最终pH是7.0±
0.1。
[0265] 将接种的瓶用橡胶套塞密封，并且用经由针筒通过无菌0.45μm过滤器和无菌27G针添加的60mL甲烷气体注射。将一式两份的培养物各自用60mL体积的以下各物注射：(A)99％纯度的甲烷(2.0级,Praxair through Alliance Gas,San Carlos,CA)；(B)代表天然气标准的70％纯度的甲烷(Sigma-Aldrich；还含有9％乙烷、6％丙烷、3％甲基丙烷、3％丁烷和其它次要烃组分)；(C)以甲烷来源A与B的1:1混合物形式递送的85％纯度的甲烷；以及(D)>93％甲烷(1.3级,Specialty Chemical Products,South Houston,TX；内部分析显示>
99％甲烷的组成)。在30℃(发孢甲基弯菌菌株OB3b)或42℃(荚膜甲基球菌Bath)下在以
250rpm旋转振荡下孵育培养物，并且以约12小时的时间间隔通过抽取1mL样品以测定OD600来测量生长。在这些时间下，将瓶排气，并且用60mL相应的甲烷来源(A、B、C或D)和60mL浓缩氧气(至少85％纯度)置换顶部空间。以约24小时的时间间隔，移出5mL样品，通过离心(8,
000rpm，10分钟)回收细胞，然后在分析之前储存在-80℃下。
99％甲烷的组成)。在30℃(发孢甲基弯菌菌株OB3b)或42℃(荚膜甲基球菌Bath)下在以
250rpm旋转振荡下孵育培养物，并且以约12小时的时间间隔通过抽取1mL样品以测定OD600来测量生长。在这些时间下，将瓶排气，并且用60mL相应的甲烷来源(A、B、C或D)和60mL浓缩氧气(至少85％纯度)置换顶部空间。以约24小时的时间间隔，移出5mL样品，通过离心(8,
000rpm，10分钟)回收细胞，然后在分析之前储存在-80℃下。
[0266] 如实施例6中所描述来进行来源于发孢甲基弯菌菌株OB3b和荚膜甲基球菌Bath的甲烷营养菌生物质的碳和氮含量(干重％)以及碳(13C)和氮(15N)的稳定同位素比的分析。表5示出了来自在具有不同纯度水平的甲烷上和多种批次的瓶培养物中生长的荚膜甲基球菌Bath的生物质样品的稳定碳同位素分析的结果。
[0267] 表5.在具有不同纯度的不同甲烷来源上生长的荚膜甲基球菌Bath的稳定碳同位素分布
[0268]
[0269] *甲烷纯度：A：99％甲烷，2.0级(最低99％)；B：70％甲烷，天然气标准(含有9％乙烷、6％丙烷、3％甲基丙烷、3％丁烷)；C：85％甲烷(A与B甲烷的1:1混合物)
[0270] 时间＝瓶培养时间(小时)
[0271] 在一种甲烷来源(A，99％)上生长的荚膜甲基球菌Bath的平均δ13C为-41.2±1.2，而在不同甲烷来源(B，70％)上生长的荚膜甲基球菌Bath的平均δ13C为-44.2±1.2。当甲烷13
来源A与B混合时，观测到-43.8±2.4的中间平均δ C。这些数据显示，在甲烷来源A和B上生长的细胞物质的δ13C彼此显著不同，这是由于输入甲烷的δ13C的差异。但是，在两种气体的混合物上生长的细胞优先利用12C，并且因此显示出趋向于更大负值的δ13C值。
来源A与B混合时，观测到-43.8±2.4的中间平均δ C。这些数据显示，在甲烷来源A和B上生长的细胞物质的δ13C彼此显著不同，这是由于输入甲烷的δ13C的差异。但是，在两种气体的混合物上生长的细胞优先利用12C，并且因此显示出趋向于更大负值的δ13C值。
[0272] 进行类似的实验来检查在不同甲烷来源上和多种批次的瓶培养物中生长的两种13
不同的甲烷营养菌荚膜甲基球菌Bath和发孢甲基弯菌OB3b是否显示出δ C分布的差异(参看表6)。
不同的甲烷营养菌荚膜甲基球菌Bath和发孢甲基弯菌OB3b是否显示出δ C分布的差异(参看表6)。
[0273] 表6.在不同纯度的不同甲烷来源上生长的不同甲烷营养菌的稳定碳同位素分布[0274]
[0275] *甲烷来源和纯度：A：99％甲烷(2.0级)；D：>93％甲烷(1.3级)
[0276] 时间＝瓶培养时间(小时)
[0277] 在第一甲烷来源(A)上生长的荚膜甲基球菌的平均δ13C为-44.5±8.8，而在相同甲烷来源上生长的发孢甲基弯菌的平均δ13C为-47.8±2.0。在第二甲烷来源(B)上生长的荚膜甲基球菌的平均δ13C为-37.9±0.4，而发孢甲基弯菌的平均δ13C为-39.8±4.5。这些数据显示，在甲烷来源上生长的细胞物质的δ13C非常类似于来自在相同甲烷来源上生长的不同菌株的细胞物质的δ13C。因此，所观测的细胞物质的δ13C似乎主要取决于输入气体的组成而不是所研究的特定细菌菌株的特性。
[0278] 可以组合上文所描述的各种实施方案以提供其它实施方案。本说明书中参考和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利公布，包括(但不限于)美国专利申请号61/671,52，以全文引用的方式并入本文中。必要时，可以修改这些实施方案的方面以采用各种专利、申请和公布的概念来提供其它实施方案。
[0279] 鉴于上述描述可以对实施方案作出这些和其它改变。一般来说，在以上权利要求书中，所用的术语不应被解释为将权利要求限于本说明书和权利要求书中所公开的特定实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及所述权利要求所赋予的等效物的完整范围。因此，权利要求书不受本公开所限制。
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