一种滞留效应增强的内质网滞留信号肽突变体
阅读：406发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种滞留效应增强的内质网滞留信号肽突变体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种滞留效应增强的内质网滞留 信号 肽突变体WEHDEL，属于 生物 工程 技术领域。本发明通过突变 酵母 内质网滞留信号肽FEHDEL，得到一系列滞留信号肽突变体。通过构建pESD‑Aga2‑FLAG‑ERS重组质粒(ERS,ER sequestration signal,内质网滞留信号肽)，分析Aga2‑FLAG‑ERS 复合体 在酵母体内的诱导和表面展示情况，并利用 荧光 标记技术和流式细胞仪检测细胞表面展示的蛋白。根据细胞表面荧光的强弱，进而分析内质网滞留信号肽滞留效应的强弱。经流式细胞仪的分析，发现滞留信号肽突变体WEHDEL与原始的FEHDEL相比，滞留效应明显增强了。在最近建立的酵母内质网滞留系统中，利用内质网滞留信号肽的滞留效应来延长蛋白底物在内质网中的 停留时间 ，以显著增 大底 物在内质网中的浓度，使蛋白酶即使在低浓度和低活性状态下也可以产生强的 水 解 反应信号，从而便于检测和分析。，下面是一种滞留效应增强的内质网滞留信号肽突变体专利的具体信息内容。
1.一种滞留效应增强的内质网滞留信号肽突变体，其特征在于：将源于酵母内质网内的滞留信号肽FEHDEL进行点突变，得到滞留效应增强的内质网滞留信号肽突变体WEHDEL；
突变体WEHDEL的制备方法包括如下步骤：
(1)构建含有内质网滞留信号肽的Aga2-FLAG-ERS复合体的基因工程菌；
(2)内质网滞留信号肽突变体Aga2-FLAG-ERS复合体的诱导表达；
(3)流式细胞仪检测不同滞留信号肽的滞留效果；
步骤(1)中的Aga2-FLAG-ERS复合体的基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
(1.1)采用PCR方法克隆得到含有一系列含有不同内质网滞留信号肽突变体Aga2-FLAG-ERS复合体的基因片段；
(1.2)将步骤(1.1)获得的PCR产物回收后，用限制性核酸内切酶双酶切，再与经过限制性核酸内切酶PstⅠ和EcoRⅠ双酶切后琼脂糖凝胶回收的酵母表面展示载体pESD在16℃酶连
16h；酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD感受态细胞中，每种挑选四个转化子经测序得到含有滞留信号肽突变体Aga2-FLAG-ERS的重组质粒pESD-Aga2-FLAG-ERS；
(1.3)将步骤(1.2)获得的重组质粒pESD-Aga2-FLAG-ERS，通过化学转化法转入酿酒酵母EBY100，得到基因工程菌。
一种滞留效应增强的内质网滞留信号肽突变体
技术领域
背景技术
[0002] 内质网滞留信号肽是存在于蛋白羧基端的一段4个氨基酸长度左右的多肽序列。它可以与内质网内膜上的蛋白相互作用，使携带滞留信号肽的蛋白往返穿梭于内质网与高尔基体中以延长蛋白在内质网与高尔基体中的滞留时间，达到被充分修饰或降解，从而影响蛋白质的正确折叠与分泌。早期研究认为内质网内的滞留信号肽长度是4个氨基酸，在人体细胞内是KDEL （Raykhel, I., Alanen, H., Salo, K., Jurvansuu, J., Nguyen, V. D., Latva-Ranta, M., and Ruddock, L. “A molecular specificity code for the three mammalian KDEL receptors”, J. Cell Biol., 2007, 179:1193-1204），而在酵母细胞内是HDEL，目前发现的有较强滞留效应的信号肽是FEHDEL （Pelham, H. R., Hardwick, K. G., and Lewis, M. J. “Sorting of soluble ER proteins in yeast”, EMBO J., 1988, 7:1757–1762）。研究已经发现细胞体内存在不同的滞留信号肽，这会导致带有不同滞留信号肽的蛋白在内质网中的滞留效应也不相同，从而直接影响到蛋白的修饰及分泌功能。（Capitani, M., and Sallese, M. “The KDEL receptor: new functions for an old protein”, FEBS Lett., 2009, 583:3863–3871）。
[0003] 在细胞体内直接研究相关的蛋白酶水解反应，才能真实解析蛋白酶的生理活性。然而细胞体内低浓度的蛋白酶水解反应所产生的计量信号十分微弱，一般的检测系统难以检测，从而使分析细胞体内的蛋白酶水解反应面临着计量信号放大的问题。运用滞留信号肽来增加蛋白底物在内质网中的停留时间和浓度有以下优势：1、不裂解细胞并且不改变内质网内蛋白酶的浓度，从而使蛋白酶水解反应处于完全生理状态；2、增大底物浓度可以更全面的解析浓度与活性较低的内源蛋白酶反应。在最近建立的酵母内质网滞留系统中[Yi, L., Gebhard, M. C., Li, Q., Taft, J.M., Georgiou, G., and Iverson, B. L. “Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2013,110(18):7229-34]，已有研究利用强滞留效应的内质网滞留信号肽来延长蛋白底物在内质网中的停留时间，以显著增大底物在内质网中的浓度，使蛋白酶即使在低浓度和低活性状态下也可以产生强的水解反应信号，从而便于检测和分析。
发明内容
[0004] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种滞留效应增强的内质网滞留信号肽突变体，将源于酵母内质网内的滞留信号肽FEHDEL进行点突变，得到突变体WEHDEL。通过建立Aga2-FLAG-ERS (ERS, ER sequestration signal, 内质网滞留信号肽)复合体，复合体在酵母细胞内表达展示在细胞表面后，利用FLAG 标签的荧光抗体（Anti-FLAG-APC）对细胞进行荧光标记，再利用流式细胞仪检测细胞表面展示的复合体，检测的荧光信号通道是APC。在同样的电压值和阈值的条件下，根据APC信号的强弱，可以判断酵母细胞表面展示Aga2-FLAG-ERS复合体的情况，进而可以推断出内质网滞留信号肽的滞留效应强弱，荧光信号越弱，说明滞留信号肽的滞留作用越强。
[0005] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建含有内质网滞留信号肽的Aga2-FLAG-ERS复合体的基因工程菌的方法，具体包括如下步骤：
[0006] （1）采用PCR方法克隆得到含有不同滞留信号肽的Aga2-FLAG-ERS复合体的基因片段。
[0007] （2）将步骤（1）获得的PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳回收后，用限制性内切酶PstⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切体系为：PstⅠ，0.5 μl；EcoRⅠ，0.5 μl；10 × O buffer，5 μl；PCR回收产物，30 μl，加ddH2O至50 μl。37 ℃处理6 h后，用1%的琼脂糖凝胶回收，再与经过限制性核酸内切酶PstⅠ和EcoRⅠ双酶切后琼脂糖凝胶回收的载体pESD [Yi, L., Gebhard, M. C., Li, Q., Taft, J.M., Georgiou, G., and Iverson, B. L. “Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2013,110(18):7229-
34]，在16 ℃ 酶连16h，酶连体系为：酶切片段，1.2 μl；酶切载体，0.3 μl；SolutionⅠ(TakaRa公司)，5 μl; 加ddH2O至10 μl。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD（Invitrogen公司）感受态细胞中，每种滞留信号肽挑选四个转化子经测序验证后得到含有不同滞留信号肽突变体的重组质粒pESD-Aga2-FLAG-ERS 。
34]，在16 ℃ 酶连16h，酶连体系为：酶切片段，1.2 μl；酶切载体，0.3 μl；SolutionⅠ(TakaRa公司)，5 μl; 加ddH2O至10 μl。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD（Invitrogen公司）感受态细胞中，每种滞留信号肽挑选四个转化子经测序验证后得到含有不同滞留信号肽突变体的重组质粒pESD-Aga2-FLAG-ERS 。
[0008] （3）将步骤（2）获得的重组质粒转化酿酒酵母EBY100得到基因工程菌：将构建好的重组质粒pESD-Aga2-FLAG-ERS，通过化学转化法转入酿酒酵母EBY100 (URA+, leu-, trp-)中，然后涂布于MD平板。所述MD培养基组成成分为6.7g/L YNB，20g/L葡萄糖，0.1g/L亮氨酸，15g/L琼脂。
[0009] 本发明要解决的第三个技术问题是应用流式细胞仪检测不同滞留信号肽的滞留效果，具体包括如下步骤：
[0010] （1）将含有带有不同滞留信号肽质粒的酿酒酵母EBY100 (URA+, leu-, trp-)，接种于YNB-CAA-Glucose培养基中（YNB-CAA-Glucose：20 g/L 葡萄糖, 6.7 g/L YNB, 5.4g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4•H2O and 5 g/L casamino acids, pH7.4），于30 ℃、225 rpm培养12h。培养至OD600=2~3，换YNB-CAA-Galactose（YNB-CAA-Galactose：20 g/L 半乳糖, 6.7 g/L YNB, 5.4g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4•H2O and 5 g/L casamino acids, pH7.4）培养基诱导并使起始OD600=0.5，于30 ℃、225 rpm培养，诱导3h和6h后取样。
[0011] （2）每次取样取106个细胞，先用溶液A（1X PBS，0.5%BSA，1mM EDTA，pH7.4）洗一次，再用溶液B（1X PBS，0.5%BSA，pH7.4）洗一次。整个过程应在冰上操作，转速为3000rpm，离心2min。最后用20μl溶液B和0.3μl荧光抗体Anti-FLAG-APC（GenScript公司，0.5μg/μl）重悬，将细胞先置于4℃ 15min，再室温放置30min，整个过程避光操作。
[0012] （3）将标记好的细胞于3000rpm，离心2min，去掉上清。再用溶液B洗一次，最后用1×PBS重悬细胞，重悬的细胞用于CytoFLEX流式细胞仪分析，检测的荧光信号通道是APC。附图说明
[0013] 图1： 重组质粒pESD-Aga2-FLAG-ERS的构建流程图；（ERS分别为： AEHDEL，WEHDEL，
[0014] FDHDEL，FKHDEL，FEKDEL，FEADEL，FEEDEL）。
[0015] 图2：含有不同滞留序列FEHDEL，AEHDEL，WEHDEL，FDHDEL，FKHDEL，FEKDEL，[0016] FEADEL，FEEDEL和不含滞留序列的Aga2-FLAG-ERS蛋白复合体的表面展示结果分析图，
[0017] 从图中可以看出，Aga2-FLAG-WEHDEL的表面展示效果最弱，说明滞留信号肽WEHDEL
[0018] 的滞留效果最强。
[0019] 图3：不同滞留序列FEHDEL，HDEL，WEHDEL和不含滞留序列的Aga2-FLAG-ERS蛋白[0020] 复合体的表面展示结果分析图。从图中也可以看出，滞留信号肽WEHDEL的滞留效果最强。
具体实施方式
[0021] 实施例1 产Aga2-FLAG-ERS复合体的基因工程菌的构建方法
[0022] （1）采用PCR方法克隆得到含有不同滞留信号肽的Aga2-FLAG-ERS复合体目的基因。
[0023] PCR反应体系：10 × KOD buffer，5 μl；dNTP（2.5 mM），5 μl；引物F (10 μM)，2 μl；引物R (10 μM)，2 μl；Pfu聚合酶，0.5μl；模板（载体pESD），1 μl；加ddH2O至50 μl。
[0024] PCR扩增体系：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，25个循环；72 ℃，5min；4 ℃，∞ 。
[0025] 设计的引物列表如下：
[0026]
[0027] （2）将获得的PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶回收后，用限制性内切酶PstⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切体系为：PstⅠ，0.5 μl；EcoRⅠ，0.5 μl；10 × O buffer，5 μl；PCR回收产物，30 μl，加ddH2O至50 μl。37 ℃处理6 h后，用1%的琼脂糖凝胶回收，再与经过限制性核酸内切酶PstⅠ和EcoRⅠ双酶切后琼脂糖凝胶回收的载体pESD在16 ℃ 酶连16h，酶连体系为：酶切片段，1.2 μl；酶切载体，0.3 μl；SolutionⅠ(TakaRa公司)，5 μl; 加ddH2O至10 μl。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD（Invitrogen公司）感受态细胞中，每个挑选四个转化子经测序得到含有滞留信号肽突变体的重组质粒pESD-Aga2-FLAG-ERS 。
[0028] （3）将构建好的重组质粒pESD-Aga2-FLAG-ERS，通过化学转化法转入酿酒酵母EBY100 (URA+, leu-, trp-)中，然后涂布于MD平板。
[0029] 实施例2 内质网滞留信号肽突变体Aga2-FLAG-ERS复合体的诱导表达
[0030] 将含有带有不同滞留信号肽的质粒的酿酒酵母EBY100，接种于YNB-CAA-Glucose培养基中，于30 ℃、225 rpm培养12h。培养至OD600=2 3，换YNB-CAA-Galactose培养基诱导~并使起始OD600=0.5，于30 ℃、225 rpm培养，诱导3h和6h后取样。
[0031] 实施例3 应用流式细胞仪检测不同滞留信号肽的滞留效果
[0032] 每次取样取106个细胞，先用溶液A洗一次，再用溶液B洗一次。整个过程应在冰上操作，转速为3000rpm，离心2min。最后用20μl溶液B和0.3μl荧光抗体Anti-FLAG-APC（GenScript公司，0.5μg/μl）重悬，将细胞先置于4℃ min，再室温放置30min，整个过程避光操作。将标记好的细胞于3000rpm，离心2min，去掉上清。再用溶液B洗一次，最后用1×PBS重悬细胞，重悬的细胞用于CytoFLEX流式细胞仪分析，检测的荧光信号通道是APC。在同样的电压值和阈值的条件下，根据APC信号的强弱，可以判断酵母细胞表面展示Aga2-FLAG-ERS复合体的情况，进而可以推断出内质网滞留信号肽的滞留效应强弱，荧光信号越弱，说明滞留信号肽的滞留作用越强。
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