技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物工程
微生物发酵技术领域，尤其涉及一种防治根结线虫的复合菌制剂及其制备技术。
背景技术
[0002] 根结线虫是一类广泛寄生于
植物根部的病原生物，对蔬菜、果树和药用植物等经济
农作物造成严重危害。
[0003] 根结线虫的防治方法包括
轮作防病、抗线虫品种培育和杀线虫药剂的使用。其中轮作防病被广泛使用，但对一些特殊经济作物或特定地区无法达到合理轮作的要求，具有较大的局限性，同时也不适用于寄主范围较宽的根结线虫的防治。常规抗病育种由于存在两方面的问题而进展缓慢：一是利用单一抗性基因使得不受抗性影响的线虫大量繁殖而发展成为新的病害，或造成线虫小种变异，在控制大豆胞囊线虫方面同样面临这样的问题；一是抗源材料匮乏使常规育种满足不了生产上的需要。化学杀线虫药剂由于可收到立竿见影的预期效果，在根结线虫的防治上被广泛使用，但化学药剂的长期使用带来了一系列的
副作用，如破坏生态平衡、造成次要病害猖獗、药剂残留造成
水源
土壤之污染、引起人畜中毒、抗性丧失等。例如公开号为CN103918731A的
专利名称为一种杀植物根结线虫的
农药组合物的发明专利，公开了使用主要成分为阿维菌素、噻唑膦和大蒜油复配的杀线虫农药组合物。因此，符合现代农业可持续发展战略理念的
生物防治方法成为根结线虫治理的首选措施，引起人们的广泛重视。
[0004] 目前，市场上的生物防治产品菌种单一，容易使线虫产生抗性，且应用范围有限，效果不是很明显。例如公开号为CN102524307A的专利名称为防治根结线虫的复合微生物菌剂及其制备方法中，公开的是淡紫拟青霉和厚垣轮枝菌的复合微生物菌剂，但是这种菌剂只对花椒根结线虫有效。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的第一个技术问题是：针对
现有技术存在的不足，提供一 种绿色、环保、对人体无毒、无害、没有药物残留，并且防治效果好、可应用于各种蔬菜、瓜果等农作物的防治根结线虫的复合菌制剂。
[0006] 本发明所要解决的第二个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种绿色、环保、对人体无毒、无害、没有药物残留，并且防治效果好、可应用于各种蔬菜、瓜果等农作物的防治根结线虫的复合菌制剂的制备方法。
[0007] 为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案是：
[0008] 一种防治根结线虫的复合菌，包含以下重量份数的原料菌种：
[0009]
[0010] 为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案是：
[0011] 一种防治根结线虫的复合菌的制备方法，包括以下步骤：分别将苏
云金芽孢杆菌、
荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、黑曲霉、淡紫拟青霉和尖孢镰刀菌的原料菌种进行高
密度培养，首先接种至装有体积比为15～30％的培养基的摇瓶中活化培养，将培养好的菌种接种到
发酵罐内进行发酵扩大培养，将扩大培养得到的各种单菌脱水干燥，制备成休眠体微生物干粉，然后按照
苏云金芽孢杆菌10～20份，荧光假单胞菌5～10份，枯草芽孢杆菌10～20份，链霉菌10～20份，黑曲霉10～15份，淡紫拟青霉10～25份和尖孢镰刀菌8～15份的重量比，混合得到防治根结线虫的复合菌制剂。
[0012] 其中，所述苏云金芽孢杆菌休眠体微生物干粉的制备包括以下步骤：
[0013] 将纯化培养的斜面培养基上的苏云金芽孢杆菌菌种接种至装有体积比为15～30％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为蛋白胨10～18g/L、
氯化钠3～7g/L和
酵母粉2～10g/L，在培养
温度为36～40℃,摇瓶转速180～ 220rpm培养18～24h；
[0014] 将活化培养好的苏云金芽孢杆菌菌种接种到装有体积比为50～70％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为1～3％，所述发酵培养基的配方为玉米粉10～20g/L、
葡萄糖5～10g/L、豆饼粉18～36g/L、
硫酸铵0.3～1.0g/L、
磷酸氢二
钾0.5～2g/L、
硫酸镁0.1～0.5g/L和硫酸锰0.1～0.5g/L，在培养温度为36～40℃,发酵罐搅拌转速200～
220rpm培养20～32h，至发酵罐中苏云金芽孢杆菌含量≥109个/ml，然后将发酵得到的苏云金芽孢杆菌单菌经
沸腾干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0015] 其中，所述荧光假单胞菌的休眠体微生物干粉的制备包括以下步骤：
[0016] 将纯化培养的斜面培养基上的荧光假单胞菌菌种接种至装有体积比为15～30％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为蛋白胨15～30g/L、
磷酸氢二钾0.5～2g/L、硫酸镁1～2g/L、和甘油5～20ml/L，在培养温度为28～32℃,摇瓶转速180～
220rpm培养20～26h；
[0017] 将活化培养好的荧光假单胞菌菌种接种到装有体积比为50～70％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为1～3％，所述发酵培养基的配方为玉米粉10～20g/L、葡萄糖5～20g/L、豆饼粉5～15g/L、磷酸氢二钾0.5～1g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L和硫酸锰0.1～
0.5g/L，在培养温度为28～32℃,发酵罐搅拌转速200～220rpm培养20～32h，至发酵罐中荧光假单胞菌含量≥109个/ml，然后将发酵得到的荧光假单胞菌单菌经
冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0018] 其中，所述枯草芽孢杆菌休眠体微生物干粉的制备包括以下步骤：
[0019] 将纯化培养的斜面培养基上的枯草芽孢杆菌菌种接种至装有体积比为15～30％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为葡萄糖18～22g/L、蛋白胨12～18g/L、氯化钠3～7g/L和
牛肉膏0.2～0.8g/L，在培养温度为36～40℃,摇瓶转速180～220rpm培养20～32h；
[0020] 将活化培养好的枯草芽孢杆菌菌种接种到装有体积比为50～70％的发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为1～3％，所述发酵培养基的配方为玉米粉10～15g/L、葡萄糖3～8g/L、豆饼粉18～22g/L、鱼粉3～8g/L、
碳酸
钙5～9g/L、 硫酸铵0.8～1.2g/L、磷酸氢二钾0.1～0.5g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L和硫酸锰0.1～0.3g/L，在培养温度为36～
9
40℃,发酵罐搅拌转速200～220rpm培养20～32h，至发酵罐中枯草芽孢杆菌含量≥10个/ml，然后将发酵得到的枯草芽孢杆菌单菌经干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0021] 其中，所述链霉菌的休眠体微生物干粉的制备包括以下步骤：
[0022] 将纯化培养的斜面培养基上的链霉菌菌种接种至装有体积比为15～30％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为可溶性
淀粉15～30g/L、磷酸氢二钾0.1～1g/L、
硝酸钾0.5～2g/L、硫酸镁0.1～1g/L、氯化钠0.1～1g/L和硫酸亚
铁0.005～0.05g/L，在培养温度为28～32℃,摇瓶转速180～220rpm培养45～50h；
[0023] 将活化培养好的链霉菌菌种接种到装有体积比为50～70％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为1～3％，所述发酵培养基的配方为玉米粉10～20g/L、葡萄糖10～20g/L、豆饼粉1～10g/L、磷酸氢二钾0.5～1g/L和硫酸镁0.1～0.5g/L，在培养温度为28～8
32℃,发酵罐搅拌转速180～220rpm培养30～40h，至发酵罐中链霉菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的链霉菌单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0024] 其中，所述黑曲霉的休眠体微生物干粉的制备包括以下步骤：
[0025] 将纯化培养的斜面培养基上的黑曲霉菌种接种至装有体积比为15～30％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基为
马铃薯葡萄糖培养基，在培养温度为28～30℃、摇瓶转速140～180rpm，活化培养22～30h；
[0026] 将活化培养好的黑曲霉菌种接种到装有体积比为50～70％发酵培养基的发酵罐内，接种量为体积比1～3％，所述发酵培养基的配方为葡萄糖8～12g/L、麸皮5～20g/L、豆饼粉2～15g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L、磷酸二氢钾18～22g/L、酵母膏8～12g/L、硫酸亚铁3～7mg/L和硫酸锰1.2～1.8mg/L，在培养温度为28～30℃,发酵罐搅拌转速8
140～180rpm，扩大培养68～80h，至发酵罐中黑曲霉含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的黑曲霉单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0027] 其中，所述淡紫拟青霉的休眠体微生物干粉的制备包括以下步骤：
[0028] 将纯化培养的斜面培养基上的淡紫拟青霉菌种接种至装有体积比为15～30％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基为马铃薯葡萄糖培养基，在培养温度为26～30℃,摇瓶转速180～220rpm培养72～86h；
[0029] 将活化培养好的淡紫拟青霉菌种接种到装有体积比为50～70％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为1～3％，所述发酵培养基的配方为玉米粉5～10g/L、葡萄糖5～10g/L、麸皮10～20g/L、豆饼粉1～10g/L、磷酸氢二钾0.5～1g/L和硫酸镁0.1～0.5g/L，在培养温度为26～30℃,发酵罐搅拌转速180～220rpm培养68～76h，至发酵罐中淡
8
紫拟青霉含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的淡紫拟青霉单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0030] 其中，所述尖孢镰刀菌的休眠体微生物干粉的制备包括以下步骤：
[0031] 将纯化培养的斜面培养基上的尖孢镰刀菌菌种接种至装有体积比为15～30％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基为马铃薯葡萄糖培养基，在培养温度为24～28℃、摇瓶转速140～180rpm，活化培养5-7天；
[0032] 将活化培养好的尖孢镰刀菌菌种接种到装有体积比为50～70％发酵培养基的发酵罐内，接种量为体积比1～3％，所述发酵培养基的配方为玉米淀粉10～20g/L、麸皮5～20g/L、豆饼粉2～15g/L、硫酸铵1～5g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L、磷酸氢二钾1～5g/L和硫酸锰1.2～1.8mg/L，在培养温度为24～28℃,发酵罐搅拌转速140～180rpm，扩大培
8
养4～5天，至发酵罐中尖孢镰刀菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的尖孢镰刀菌单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0033] 其中各菌种的休眠体微生物干粉的制备不分先后顺序，可以同时进行。
[0034] 本发明中的苏云金芽孢杆菌、荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌都属于
根际细菌。根际细菌对线虫的作用机理主要有三个方面：
[0035] 一是产生杀线虫物质。杀线虫物质包括含氮物降解过程中产生的挥发性的NH3和NO2、毒素和其它抑制线虫的化合物。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)在形成芽孢的同时有伴孢晶体蛋白形成,具有很高的
杀虫活性。枯草芽孢杆菌产生的细菌素、活性
蛋白质类物质、多肽类物质对线虫的幼虫也有一定的抑制作用。
[0036] 二是改变根分泌物与线虫作用方式。从特定的根区分泌出来的根分泌物是影响线虫生活史中特定发育阶段的重要因素。根分泌物影响线虫卵孵化、线虫趋向于根的运动、线虫与寄主的识别及在根上的寄生。这些阶段被认为是线虫发育的薄弱环节而适用于生防。特定根围的根际细菌可消耗或改变根分泌物的分泌形式，从而影响根分泌物依赖型植物寄生线虫的发育，而不是产生抗生素或嗜铁素。
[0037] 三是营养和空间位点竞争。线虫与根的相互识别是根表面的外源凝聚素与线虫体表糖类之间的相互识别。G-菌的细胞壁双层脂膜上具有结合植物外源凝聚素的结构而优先占据线虫的侵染位点，并且在根部定居繁殖，消耗根围营养、占据空间位点而达到生防的目的。荧光假单胞菌就属于G-菌，另外，它还可以定殖到线虫体内，抑制线虫卵的孵化。
[0038] 本发明中的链霉菌属于放线菌。放线菌是一类控制植物病原传播的重要微生物资源，它对病原生物有很高的拮抗作用和寄生性。研究结果表明，链霉菌对卵的寄生率和幼虫死亡率都很高，主要是和其产生的生物活性物质有关。
[0039] 本发明中的黑曲霉、淡紫拟青霉和尖孢镰刀菌都是食线虫
真菌。食线虫真菌是线虫的真菌天敌，是指寄生、捕捉、定殖、毒杀线虫的一大类真菌。食线虫真菌主要包括捕食线虫真菌，内寄生真菌，产毒素杀线虫真菌和定殖于固着性线虫、卵、雌虫、胞囊的机会病原真菌4大类。淡紫拟青霉主要通过产生几丁质酶和丝
氨酸蛋白酶作用于卵壳使菌丝得以侵入根结线虫的卵并寄生于卵内,从而杀灭虫卵。黑曲霉和尖孢镰刀菌主要通过产生毒素类物质杀死虫卵和幼虫。
[0040] 本发明中的菌种均属于生防菌，且各菌种在复配之前均做过拮抗实验，结果证明它们之间无拮抗性。
[0041] 由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0042] 本发明的防治根结线虫的复合菌包括重量份数为苏云金芽孢杆菌10～20份、荧光假单胞菌5～10份、枯草芽孢杆菌10～20份、链霉菌10～20份、黑 曲霉10～15份、淡紫拟青霉10～25份和尖孢镰刀菌8～15份，其中各原料菌种均是从土壤中筛选出来的，且分别属于根际细菌、放线菌和食线虫真菌，均属于生防菌，他们之间相互协作，共同杀灭线虫卵和幼虫。大田实验证明减少其中任意一种菌，均不能达到七种菌共同作用的效果，充分证明各菌种之间具有相互协同的效果。本发明采用合理原料菌种配比，混合得到的防治根结线虫复合菌剂，可有效抑制根结线虫的繁殖，防治效果明显(防治效果≥75％)，优于普通的
生物农药(防治效果为35％左右)；并且能促进植株的生长，减少农药的使用量，不会造成瓜果蔬菜的农药残留，长期使用不会产生抗药性，因此安全、环保，不会破坏生态平衡。
[0043] 本发明用于防治根结线虫，相比现有产品，绿色、环保、对人体无毒、无害、防治效果好。
具体实施方式
[0044] 下面结合具体的
实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或
修改，这些等价形式同样落于本
申请所附
权利要求书所限定的范围。
[0045] 实施例1
[0046] 一种防治根结线虫的复合菌，包含以下重量份数的原料菌种：
[0047]
[0048] 实施例2
[0049] 一种防治根结线虫的复合菌，包含以下重量份数的原料菌种：
[0050]
[0051] 实施例3
[0052] 一种防治根结线虫的复合菌，包含以下重量份数的原料菌种：
[0053]
[0054] 实施例4
[0055] 分别将苏云金芽孢杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、黑曲霉、淡紫拟青霉和尖孢镰刀菌的原料菌种进行高密度培养，首先接种至装有体积比为20％的培养基的摇瓶中活化培养，将培养好的菌种接种到发酵罐内进行发酵扩大培养，将扩大培养得到的各种单菌脱水干燥，制备成休眠体微生物干粉，然后按照苏云金芽孢杆菌10份，荧光假单胞菌5份，枯草芽孢杆菌10份，链霉菌10份，黑曲霉10份，淡紫拟青霉10份和尖孢镰刀菌8份的重量比，混合得到防治根结线虫的复合菌制剂。
[0056] 实施例5
[0057] 制备苏云金芽孢杆菌休眠体微生物干粉：
[0058] 将纯化培养的斜面培养基上的苏云金芽孢杆菌菌种接种至装有体积比为 28％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为蛋白胨12g/L、氯化钠5g/L和酵母粉5g/L，在培养温度为38℃,摇瓶转速200rpm培养22h；
[0059] 将活化培养好的苏云金芽孢杆菌菌种接种到装有体积比为60％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为2％，所述发酵培养基的配方为玉米粉12g/L、葡萄糖8g/L、豆饼粉26g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.9g/L、硫酸镁0.3g/L和硫酸锰0.3g/L，在培养温度为
9
38℃,发酵罐搅拌转速220rpm培养28h，至发酵罐中苏云金芽孢杆菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的苏云金芽孢杆菌单菌经沸腾干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0060] 制备荧光假单胞菌的休眠体微生物干粉：
[0061] 将纯化培养的斜面培养基上的荧光假单胞菌菌种接种至装有体积比为20％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁1g/L、和甘油10ml/L，在培养温度为30℃,摇瓶转速200rpm培养25h；
[0062] 将活化培养好的荧光假单胞菌菌种接种到装有体积比为60％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为2％，所述发酵培养基的配方为玉米粉12g/L、葡萄糖12g/L、豆饼粉12g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.2g/L和硫酸锰0.2g/L，在培养温度为30℃,发酵罐搅拌
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转速200rpm培养28h，至发酵罐中荧光假单胞菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的荧光假单胞菌单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0063] 制备枯草芽孢杆菌休眠体微生物干粉：
[0064] 将纯化培养的斜面培养基上的枯草芽孢杆菌菌种接种至装有体积比为20％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为葡萄糖18g/L、蛋白胨18g/L、氯化钠5g/L和牛肉膏0.5g/L，在培养温度为38℃,摇瓶转速200rpm培养28h；
[0065] 将活化培养好的枯草芽孢杆菌菌种接种到装有体积比为60％的发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为1.5％，所述发酵培养基的配方为玉米粉15g/L、葡萄糖4g/L、豆饼粉20g/L、鱼粉5g/L、碳酸钙6g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、硫酸镁0.2g/L和硫酸锰0.2g/L，在培养温度为38℃,发酵罐搅拌转 速200rpm培养32h，至发酵罐中枯草芽孢
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杆菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的枯草芽孢杆菌单菌经干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0066] 制备链霉菌的休眠体微生物干粉：
[0067] 将纯化培养的斜面培养基上的链霉菌菌种接种至装有体积比为20％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为可溶性淀粉20g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硝酸钾0.8g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.6g/L和硫酸亚铁0.03g/L，在培养温度为30℃,摇瓶转速
200rpm培养48h；
[0068] 将活化培养好的链霉菌菌种接种到装有体积比为65％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为2.5％，所述发酵培养基的配方为玉米粉12g/L、葡萄糖12g/L、豆饼粉3g/L、磷酸氢二钾0.6g/L和硫酸镁0.2g/L，在培养温度为32℃,发酵罐搅拌转速220rpm培养40h，8
至发酵罐中链霉菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的链霉菌单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0069] 制备黑曲霉的休眠体微生物干粉：
[0070] 将纯化培养的斜面培养基上的黑曲霉菌种接种至装有体积比为20％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基为马铃薯葡萄糖培养基，在培养温度为30℃、摇瓶转速160rpm，活化培养24h；
[0071] 将活化培养好的黑曲霉菌种接种到装有体积比为55％发酵培养基的发酵罐内，接种量为体积比1.5％，所述发酵培养基的配方为葡萄糖10g/L、麸皮10g/L、豆饼粉10g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢钾20g/L、酵母膏10g/L、硫酸亚铁5mg/L和硫酸锰1.5mg/L，在培养8
温度为28℃,发酵罐搅拌转速160rpm，扩大培养72h，至发酵罐中黑曲霉含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的黑曲霉单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0072] 制备淡紫拟青霉的休眠体微生物干粉：
[0073] 将纯化培养的斜面培养基上的淡紫拟青霉菌种接种至装有体积比为20％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基为马铃薯葡萄糖培养基，在培养温度为28℃,摇瓶转速200rpm培养80h；
[0074] 将活化培养好的淡紫拟青霉菌种接种到装有体积比为60％发酵培养基的发 酵罐内，体积接种量为1.5％，所述发酵培养基的配方为玉米粉8g/L、葡萄糖8g/L、麸皮18g/L、豆饼粉8g/L、磷酸氢二钾0.8g/L和硫酸镁0.3g/L，在培养温度为28℃,发酵罐搅拌转速8
220rpm培养68h，至发酵罐中淡紫拟青霉含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的淡紫拟青霉单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0075] 制备尖孢镰刀菌的休眠体微生物干粉：
[0076] 将纯化培养的斜面培养基上的尖孢镰刀菌菌种接种至装有体积比为18％的活化培养基的摇瓶中，进行高密度培养，所述活化培养基为马铃薯葡萄糖培养基，在培养温度为28℃、摇瓶转速180rpm，活化培养7天；
[0077] 将活化培养好的尖孢镰刀菌菌种接种到装有体积比为60％发酵培养基的发酵罐内，接种量为体积比2％，所述发酵培养基的配方为玉米淀粉17g/L、麸皮15g/L、豆饼粉12g/L、硫酸铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾2g/L和硫酸锰1.4mg/L，在培养温度为8
6℃,发酵罐搅拌转速160rpm，扩大培养4～5天，至发酵罐中尖孢镰刀菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的尖孢镰刀菌单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0078] 将制备得到的各菌种的休眠体微生物干粉，按照苏云金芽孢杆菌16份，荧光假单胞菌6份，枯草芽孢杆菌16份，链霉菌16份，黑曲霉12份，淡紫拟青霉18份和尖孢镰刀菌12份的重量比，混合得到防治根结线虫的复合菌制剂。
[0079] 实施例6
[0080] 制备苏云金芽孢杆菌休眠体微生物干粉：
[0081] 将纯化培养的斜面培养基上的苏云金芽孢杆菌菌种接种至装有体积比为20％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为蛋白胨14g/L、氯化钠4g/L和酵母粉6g/L，在培养温度为38℃,摇瓶转速200rpm培养22h；
[0082] 将活化培养好的苏云金芽孢杆菌菌种接种到装有体积比为60％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为2％，所述发酵培养基的配方为玉米粉15g/L、葡萄糖8g/L、豆饼粉22g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁0.3g/L和硫酸锰0.3g/L，在培养温度为
9
38℃,发酵罐搅拌转速220rpm培养28h，至发酵罐中苏云金芽孢杆菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的苏云金芽孢杆菌单菌 经沸腾干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0083] 制备荧光假单胞菌的休眠体微生物干粉：
[0084] 将纯化培养的斜面培养基上的荧光假单胞菌菌种接种至装有体积比为20％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为蛋白胨22g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、硫酸镁1.2g/L、和甘油15ml/L，在培养温度为30℃,摇瓶转速220rpm培养24h；
[0085] 将活化培养好的荧光假单胞菌菌种接种到装有体积比为60％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为2％，所述发酵培养基的配方为玉米粉15g/L、葡萄糖15g/L、豆饼粉10g/L、磷酸氢二钾0.8g/L、硫酸镁0.2g/L和硫酸锰0.2g/L，在培养温度为30℃,发酵罐搅
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拌转速220rpm培养26h，至发酵罐中荧光假单胞菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的荧光假单胞菌单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0086] 制备枯草芽孢杆菌休眠体微生物干粉：
[0087] 将纯化培养的斜面培养基上的枯草芽孢杆菌菌种接种至装有体积比为22％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为葡萄糖20g/L、蛋白胨15g/L、氯化钠6g/L和牛肉膏0.6g/L，在培养温度为38℃,摇瓶转速200rpm培养30h；
[0088] 将活化培养好的枯草芽孢杆菌菌种接种到装有体积比为65％的发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为2.5％，所述发酵培养基的配方为玉米粉12g/L、葡萄糖5g/L、豆饼粉20g/L、鱼粉5g/L、碳酸钙8g/L、硫酸铵1.0g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、硫酸镁0.2g/L和硫酸锰0.2g/L，在培养温度为38℃,发酵罐搅拌转速220rpm培养28～32h，至发酵罐中枯草芽
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孢杆菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的枯草芽孢杆菌单菌经干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0089] 制备链霉菌的休眠体微生物干粉：
[0090] 将纯化培养的斜面培养基上的链霉菌菌种接种至装有体积比为18％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基的配方为可溶性淀粉25g/L、磷酸氢二钾0.8g/L、硝酸钾1.5g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.8g/L和硫酸亚铁0.05g/L，在培养温度为30℃,摇瓶转速
220rpm培养48～50h；
[0091] 将活化培养好的链霉菌菌种接种到装有体积比为55％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为1.5％，所述发酵培养基的配方为玉米粉15g/L、葡萄糖15g/L、豆饼粉8g/L、磷酸氢二钾0.8g/L和硫酸镁0.4g/L，在培养温度为30℃,发酵罐搅拌转速200rpm培养38～8
40h，至发酵罐中链霉菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的链霉菌单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0092] 制备黑曲霉的休眠体微生物干粉：
[0093] 将纯化培养的斜面培养基上的黑曲霉菌种接种至装有体积比为20％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基为马铃薯葡萄糖培养基，在培养温度为30℃、摇瓶转速160rpm，活化培养28h；
[0094] 将活化培养好的黑曲霉菌种接种到装有体积比为60％发酵培养基的发酵罐内，接种量为体积比1.5％，所述发酵培养基的配方为葡萄糖10g/L、麸皮15g/L、豆饼粉12g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢钾20g/L、酵母膏10g/L、硫酸亚铁6mg/L和硫酸锰1.6mg/L，在培养8
温度为28℃,发酵罐搅拌转速180rpm，扩大培养78～80h，至发酵罐中黑曲霉含量≥10个/ml，然后将发酵得到的黑曲霉单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0095] 制备淡紫拟青霉的休眠体微生物干粉：
[0096] 将纯化培养的斜面培养基上的淡紫拟青霉菌种接种至装有体积比为20％的活化培养基的摇瓶中，所述活化培养基为马铃薯葡萄糖培养基，在培养温度为28℃,摇瓶转速220rpm培养78～80h；
[0097] 将活化培养好的淡紫拟青霉菌种接种到装有体积比为60％发酵培养基的发酵罐内，体积接种量为2％，所述发酵培养基的配方为玉米粉8g/L、葡萄糖8g/L、麸皮15g/L、豆饼粉6g/L、磷酸氢二钾0.6g/L和硫酸镁0.2g/L，在培养温度为28℃,发酵罐搅拌转速8
220rpm培养68～72h，至发酵罐中淡紫拟青霉含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的淡紫拟青霉单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0098] 制备尖孢镰刀菌的休眠体微生物干粉：
[0099] 将纯化培养的斜面培养基上的尖孢镰刀菌菌种接种至装有体积比为20％的 活化培养基的摇瓶中，进行高密度培养，所述活化培养基为马铃薯葡萄糖培养基，在培养温度为26℃、摇瓶转速160rpm，活化培养6天；
[0100] 将活化培养好的尖孢镰刀菌菌种接种到装有体积比为60％发酵培养基的发酵罐内，接种量为体积比2％，所述发酵培养基的配方为玉米淀粉16g/L、麸皮16g/L、豆饼粉12g/L、硫酸铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾2g/L和硫酸锰1.5mg/L，在培养温度为8
26℃,发酵罐搅拌转速160rpm，扩大培养4～5天，至发酵罐中尖孢镰刀菌含量≥10 个/ml，然后将发酵得到的尖孢镰刀菌单菌经冷冻干燥制备成休眠体微生物干粉。
[0101] 将制备得到的各菌种的休眠体微生物干粉，按照苏云金芽孢杆菌16份，荧光假单胞菌7份，枯草芽孢杆菌16份，链霉菌16份，黑曲霉13份，淡紫拟青霉20份和尖孢镰刀菌12份的重量比，混合得到防治根结线虫的复合菌制剂。
[0102] 实验例1
[0103] 将实施例2的防治根结线虫的复合菌剂对西红柿的杀菌情况进行实验，结果如下表1。
[0104] 在同一试验田内的不同西红柿植株上，各选取40棵共两组，作为实验组、空白对照组。实验组用实施例2制备得到的复合菌剂，空白对照组不使用
杀菌剂。首先在移苗前，将复合菌剂穴施到土壤中，然后每隔一个月冲施一次。通过对西红柿一个周期的
跟踪实验，分别对西红柿生物学性状、发病情况等方面进行了全面考察。从西红柿植株生物学性状可以看出，不论是西红柿植株株高、茎围，还是西红柿结果率、果实大小，使用复合菌制剂对西红柿植株的处理，其各项指标均优于空白对照组，其防治效果为76％。
[0105] 表1复合菌制剂对西红柿的防治效果
[0106]项目 病情指数 防治效果
实验组(使用复合菌制剂) 13.1 76％
空白对照组(CK) 54.6 ——
[0107] 实验例2
[0108] 将实施例6制备得到的防治根结线虫的复合菌剂对韭菜的杀菌情况做实验， 结果如下表2。
[0109] 在同一试验田内的韭菜植株上，各选取四垄共两组，作为实验组、空白对照组。实验组用实施例6制备得到的复合菌剂，空白对照组不使用杀菌剂。首先将复合菌剂穴施到离韭菜根部5-10cm处的土壤中，然后每隔二十天冲施一次。通过对韭菜四个月的跟踪实验，分别对韭菜生长状况、发病情况等方面进行了全面考察。使用复合菌制剂对韭菜植株的处理，其各项指标均优于空白对照组，其防治效果为76.7％。
[0110] 表2复合菌制剂对韭菜的防治效果
[0111]项目 病情指数 防治效果
实验组(使用复合菌制剂) 11.3 76.7％
空白对照组(CK) 48.6 ——
[0112] 实验对比例1
[0113] 在同一试验田内的不同西红柿植株上，各选取20棵共八组，作为实验组、对照组1-对照组6和空白对照组，实验组和对照组1-6分别用实施例2的复合菌剂和对比例1-6的复合菌剂，空白对照组不使用杀菌剂。将实施例2的防治根结线虫的复合菌剂以及对比例1-6的复合菌剂对西红柿的杀菌情况做实验，结果如下表4。(对比例1-6的复合菌配方见表3)。
[0114] 首先在移苗前，将实验组和对照组1-6的复合菌剂穴施到土壤中，做好标记，然后每隔一个月冲施一次。通过对西红柿一个周期的跟踪实验，分别对西红柿生物学性状、发病情况等方面进行了全面考察。从西红柿植株生物学性状可以看出，不论是西红柿植株株高、茎围，还是西红柿结果率、果实大小，使用实验组的复合菌制剂对西红柿植株的处理，其各项指标均优于对照组1-对照组6，其防治效果分别为76.8％、63.2％、62.7％、64.2％、65.5％、61.4％和62.2％。
[0115] 表3对比例1-6的复合菌配方
[0116]
[0117]
[0118] 表4复合菌制剂实验组和对照组对西红柿的防治效果
[0119]项目 病情指数 防治效果
实验组(实施例2的复合菌剂) 13.3 76.8％
对照组1(对比例1) 21.1 63.2％
对照组2(对比例2) 21.4 62.7％
对照组3(对比例3) 20.5 64.2％
对照组4(对比例4) 19.8 65.5％
对照组5(对比例5) 22.1 61.4％
对照组6(对比例6) 21.6 62.2％
空白对照组(CK) 57.3 ——
[0120] 实验对比例3复合菌制剂和阿维菌素在西红柿上的对比实验见表5：
[0121] 在同一试验田内的不同西红柿植株上，各选取20棵共三组，作为实验组、对照组和空白对照组，实验组和对照组分别用实施例6制备得到的复合菌剂跟阿维菌素对根结线虫杀菌实验，分别将复合菌剂跟阿维菌素穴施到实验组和对照组的土壤中，做好标记，然后每隔一个月冲施一次，空白对照组不使用杀菌剂。通过对西红柿一个周期的跟踪实验，分别对西红柿生物学性状、发病情况等方面进行了全面考察。从西红柿植株生物学性状可以看出，不论是西红柿植株株高、茎围，还是西红柿结果率、果实大小，使用复合菌制剂对西红
