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通过分批添加 碳源底物和碱来制备有机酸的方法

阅读：321发布：2024-02-27

专利汇可以提供通过分批添加碳源底物和碱来制备有机酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种分批补料培养方法，包括分批添加碳源和碱的步骤，这种方式使得pH值可以保持在适合微生物生长的水平，其中该微生物用于使碳源发酵。本发明还提供了一种使用分批补料培养方法来制备有机酸的方法。本发明在通过微生物发酵制备有机酸时，分批添加中和剂例如碳酸氢铵、碳酸铵或含碱金属的弱碱以及碳源底物。因此，pH值可以保持适合用于碳源发酵的微生物存活的水平，并且注入碳源-碱即源材料的速度可以进行适当调节。本发明可提高产率、得率和有机酸的浓度，并可以根据pH水平的变化自动注入碱和碳源底物，从而提高发酵工艺操作的可靠性和便利性。，下面是通过分批添加碳源底物和碱来制备有机酸的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种通过分批补料培养发酵碳源底物以生产有机酸的方法，包括以分批补料方式将底物-碱混合物添加至包含碳源底物和产有机酸的菌株的反应器中，其中所述底物-碱混合物包含碳源底物和至少一种选自碳酸氢铵、碳酸铵和包含碱金属的弱碱中的碱。
2.一种通过分批补料培养生产有机酸的方法，包括：
制备包含碳源底物、产有机酸的菌株和菌株生长成分的培养基；
发酵所述碳源底物，同时以分批补料方式添加底物-碱混合物至所述培养基中，以使所述培养基具有所述产有机酸的菌株生长的最适pH值，其中所述底物-碱混合物由碳源底物和至少一种选自碳酸氢铵、碳酸铵和包含碱金属的弱碱中的碱组成；和
从所述培养基中回收所述有机酸，所述有机酸是通过发酵所述碳源底物生产的。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述包含碱金属的弱碱是碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾或它们的组合。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述碳源底物是一种或多种选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘蔗、糖蜜和淀粉水解物组成的组中的糖。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述有机酸是至少一种选自由丁酸、乳酸、乙酸、甲酸、柠檬酸、己二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、3-羟基丙酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖二酸、衣康酸、丙烯酸、和己二烯二酸组成的组中的有机酸。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述产有机酸的菌株选自梭状芽孢杆菌属、假单胞菌属、根霉属、曲霉属、棒状杆菌属、放线菌属、酵母、假丝酵母属、毕赤酵母属、大肠杆菌、和乳酸菌。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述发酵是在安装有pH控制传感器或气量计、或者同时安装有这两者的发酵罐中进行的。
8.如权利要求2所述的方法，其中，所述底物-碱混合物添加完成后，氨水、碱金属氢氧化物溶液、碱土金属氢氧化物溶液、或它们的组合被添加到发酵罐，以使上述培养基具有所述产有机酸的菌株生长的最适pH值，直至所述碳源底物发酵完全。
9.如权利要求2所述的方法，其中所述生长成分为选自由氮源、维生素、矿物质和碳源分解酶组成的组中的至少一者。
10.一种通过分批补料培养生产丁酸的方法，包括：
制备含有碳源底物、产丁酸的菌株、和所述菌株的生长成分的培养基；
发酵所述碳源底物，同时以分批补料方式添加底物-碱混合物至所述培养基中，以使所述培养基具有4.5-7的pH值，其中所述底物-碱混合物由碳源底物和至少一种选自碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸铵、碳酸钠、碳酸钾及其混合物组成的组中的碱组成；和从所述培养基中回收丁酸，所述丁酸是通过所述碳源底物的发酵产生的。
11.如权利要求10所述方法，其中所述产丁酸的菌株是梭状芽孢杆菌属微生物。

说明书全文

通过分批添加碳源底物和碱来制备有机酸的方法

技术领域

[0001] 本申请涉及一种通过分批补料培养来生产有机酸的方法。更具体地，本申请涉及一种通过分批补料的方式添加碳源和碱来生产有机酸的方法。

背景技术

[0002] 用于各种食品、食品添加剂、化学原料等中的有机酸长期通过发酵进行生产。近年来，有机酸被评价为可作为燃料和化学物质的原材料的高可用性资源，其中所述化学物质可用于研发新型环保可再生能源和化学品。

[0003] 发酵生产有机酸通常以分批方式进行。通过发酵法生产有机酸的方法公开在美国专利5,503,750和5,766,439中。根据分批发酵方法，使用于生产目标有机酸的微生物在生物反应器中生长，其中在该生物反应器中同时添加了供应量有限的用于生长的营养物质，如糖、氮源、矿物质等。由于糖的供应量有限，因而有机酸的产率也有限，因此在分批培养中初始采用高浓度的糖以获得更大量的有机酸。然而，高浓度的糖作为抑制微生物生长的一个因素，会降低发酵速率。补料分批培养被建议作为解决这一问题的替代方案。

[0004] 分批补料培养是生物技术工艺中的操作技术，其中分批培养初始以适当的糖浓度进行，然后接着提供高浓度的糖来保持培养基中糖的低浓度。关于此技术，依据添加糖的时间、方法和量，存在多种分批补料培养方法。根据每种方法的不同会影响微生物的生长率和产率。

[0005] 迄今已知的糖控技术包括以根据微生物的生长模式分析而确定的恒定速率人工添加糖，以及响应于DO(溶解氧)或pH(氢指数)的信息从而自动添加糖。当应用前项技术时，分批补料培养与分批培养相比可以提高产率和产量，但也可能因为糖的添加不能与微生物的生长以及糖的消耗准确地保持一致而效率较低。此外，操作者应持续地观测糖的添加量。

[0006] 至于后一技术，pH-stat或OD-stat分批补料发酵广泛应用于培养需氧微生物，如大肠杆菌，因为此方法使培养物中的糖浓度的波动小，并且符合微生物生长曲线。具体地，pH-stat分批补料培养是针对需氧微生物诸如大肠杆菌代谢糖时的pH值下降现象而开发的，其目的是以最小的浓度来添加糖而不降低微生物的活性。在pH-stat分批补料模式中，设定所需pH值，并且，当培养物的pH值超过设定值的许可时则添加少量的糖。当少量的糖被代谢时，pH值略微降低。如果糖被完全消耗，则培养物的pH再次增加，因此添加糖。持续进行此循环，直到获得满意量的产品。然而，在发酵生产有机酸时，培养物没有发生由糖消耗引起的pH值的轻微增加，却随着有机酸的生成pH值不断降低。因此，传统的分批补料培养，如pH-stat法，不能适用于发酵生产有机酸。发明内容

[0007] 技术问题

[0008] 本发明的发明人牢记此问题，即随着有机酸的生成，培养物pH值持续降低，因此传统的分批补料培养不适合应用于发酵生产有机酸，从而构思了一种生产有机酸的方法，其中以分批补料的模式添加碳源底物(糖)和碱，由此为生产有机酸的厌氧微生物的生长创造了最适条件。

[0009] 本发明一方面涉及一种生产有机酸的方法，其通过以分批补料方式简单且可靠地添加碳源，从而能够以高产率和产量获得高浓度有机酸。

[0010] 技术方案

[0011] 根据其一个方面，本发明提供了一种生产有机酸的方法，其通过分批补料方式将i)碳源底物和ii)至少一种选自碳酸氢铵或含碱金属的弱碱(例如，碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾)的碱组成的混合物添加至包含产有机酸的微生物菌株的生物反应器中，由此可以同时对培养物的pH值和碳源底物浓度进行适当调节，从而抵抗发酵进行过程中pH值和碳源底物(例如，糖)浓度的变化。

[0012] 在其另一个方面，本发明提供了一种通过本发明的分批补料培养方法生产丁酸的方法。

[0013] 有益效果

[0014] 本发明的方法被设置为以一定速率添加碳源，该速率取决于碱的添加速率，其中碱是依据pH值的变化而添加的。在生产有机酸的发酵体系中，根据本发明，将碳源与碱以分批补料方式一同添加，以保持碳源在培养基中的恒定浓度。相比于常规的方法中操作者在直接测量碳源浓度或培养基的pH值或以小时计分析微生物生长情况后确定糖的添加速率，本发明的方法除了更简单和更具可重复性外，还具有更优异的产率和产量。

[0015] 根据本发明的方法，发酵可以进一步地持续直到碳源完全耗尽，这样能够获得最大产率，并且伴随产生的副产物如乙酸的产生程度更小。此外，消除或减少了对用于菌种培养的昂贵培养基的需求。因此，本发明的方法提供了一种减少发酵过程成本的经济策略。附图说明

[0016] 图1为根据本发明的一个实施方案通过分批补料培养生产有机酸的示意图。

[0017] 图2显示了产品丁酸和副产物乙酸的生成曲线。

具体实施方式

[0018] 本发明是基于这样的事实，即通过微生物消耗的碳源和生成的有机酸的量(例如，降低的pH值)之间存在直接的关联。随着有机酸的生成，用于生产有机酸的培养物中碳源含量和pH值变低。在本发明中，以分批补料的形式提供由碳源和至少一种选自碳酸氢铵和含碱金属的弱碱的碱组成的底物-碱混合物，以此补充含量降低的碳源以及由于有机酸的生成而降低的pH值，因此提高了有机酸的产率。

[0019] 强碱如NaOH、KOH和Ca(OH)2可用来中和在培养物中产生的有机酸，但这些强碱，尤其含钙(Ca)的碱，非常容易使蛋白质变性并沉淀。如此强碱进入培养基，会使氮源变性，从而抑制氮源被微生物利用，导致发酵效率降低。因此，弱碱，尤其是碳酸氢铵、或含碱金属的弱碱(如碳酸氢钠、碳酸氢钾等)、或这两者被用于中和本发明中的有机酸。碳酸氢铵是有利的，这是因为它也可以充当微生物生长必需的铵离子营养源。

[0020] 以下是本发明的详述。

[0021] 本发明一个方面涉及通过碳源底物发酵生产有机酸的方法，包括以分批补料方式添加底物-碱混合物至包含碳源底物和产有机酸的菌株的生物反应器中，以维持适合于发酵碳源底物的微生物生长的pH值，所述混合物包含：i)碳源底物；和ii)至少一种选自碳酸氢铵、碳酸铵、和含碱金属的碱中的碱。

[0022] 根据其中的一个实施方案，本发明提供了一种通过分批补料培养生产有机酸的方法，包括：

[0023] 制备包含有碳源底物、产有机酸的菌株、以及菌株生长的必要成分(菌株生长成分)的培养基；

[0024] 通过以分批补料方式将底物-碱混合物添加至培养基来创建最适条件，并在该最适条件下发酵碳源底物，从而使培养基具有最适合产有机酸的菌株生长的pH值，其中所述底物-碱混合物由碳源底物和至少一种选自碳酸氢铵、碳酸铵、和含碱金属的弱碱中的碱组成；和

[0025] 从培养基中回收有机酸，该有机酸是通过碳源底物的发酵而生成的。

[0026] 术语“弱碱”是指含有元素周期表的1族中的碱金属的碱，例如碳酸氢钠和碳酸氢钾。

[0027] 在本发明的一个实施方案中，碳源底物可以是糖，其可以为单糖、二糖、多糖及其组合的形式。实例包括但不限于：葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、甘蔗、糖蜜以及淀粉水合物。

[0028] 可根据发酵特性来调整在发酵期间提供的底物-碱混合物中碳源底物和碱的含量比例，其中发酵特性与碱的溶解度和有机酸的产率有关。假定碳源底物和碱保持为无菌，碳源底物和碱之间的含量比例甚至可以在发酵过程进行时进行调整。

[0029] 以分批补料方式添加的碳源底物可以与最初包含在生物反应器的培养基中的碳源底物相同或不同。

[0030] 除了碳源底物外，氮源、维生素、无机盐和/或碳源分解酶(如转化酶)都可能落在微生物菌株生长的必要成分的范围内。本领域技术人员可以根据菌株从而容易地确定生长所需成分。

[0031] 在能以本发明的分批补料培养方法生产的有机酸范围内的有：丁酸，乳酸，乙酸，甲酸，柠檬酸，己二酸，琥珀酸，富马酸，苹果酸，3-羟基丙酸，谷氨酸，戊二酸，葡糖二酸，衣康酸，丙烯酸，和己二烯二酸，这些均已知可应用于生物燃料和生物化学。

[0032] 任何微生物均可作为本发明中的产有机酸的菌株，只要其可以生产有机酸即可。产有机酸的菌株可以选自梭状芽孢杆菌属(Clostridium spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、放线菌属(Actinobacillus spp.)、酵母、假丝酵母属(Candida spp.)、毕赤酵母属(Pichia spp.)、大肠杆菌、和乳酸菌。产有机酸的菌株的具体实例包括酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、乙酰丁酸梭菌(C.acetobutyricum)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(R.oryzae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

[0033] 适于单一菌株的发酵条件是本领域公知的。

[0034] 本文中所使用的涉及菌株生长的术语“最适条件”是指包括厌氧条件、温度范围和pH范围的环境，在此环境下微生物菌株生长，并且伴随着有机酸实现最大生产量。最适条件可依据所使用的菌株而调节。本领域技术人员可依据微生物菌株的生长阶段调节生物反应器的环境至最适条件。例如，生物反应器可以被设置为加热或冷却到20℃至50℃的温度，同时培养基具有4至7的pH值。

[0035] 此外，本发明的一个实施方案预期是一种在梭状芽胞杆菌菌株的存在下，以分批补料方式提供糖类以及至少一种选自碳酸氢钠和碳酸氢钾的碱，从而通过使糖发酵来生产丁酸的方法。作为发酵所需，碳源底物、氮源、维生素和矿物质和/或酶例如转化酶可加入到培养基中。

[0036] 更具体地说，本发明提供了一种通过分批补料培养生产丁酸的方法，包括：

[0037] 制备包含碳源底物、产丁酸的微生物菌株、以及菌株生长的必要成分(生长必要成分)的培养基；

[0038] 通过以分批补料方式添加底物-碱混合物至培养基，以使培养基具有4.5至7的pH值，从而建立最适条件，在该最适条件下发酵碳源底物，其中所述底物-碱混合物由碳源底物和至少一种选自碳酸氢铵、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的碱构成；和

[0039] 从培养基中回收丁酸，该丁酸是随着碳源底物的发酵而生成的。

[0040] 产丁酸的微生物菌株可以是梭状芽孢杆菌属，并且可以选自酪丁酸梭菌、丁酸梭菌和乙酰丁酸梭菌组成的组。

[0041] 参考图1，解释本发明的一个实施方式。

[0042] 本发明设置为以分批补料方式将进料罐中的含有碳源底物和碱(例如，碳酸氢铵)的中和溶液加入至发酵罐，在该发酵罐中，碳源底物在微生物存在下发酵生产有机酸。

[0043] 发酵罐可以安装有pH控制传感器和/或气量计。

[0044] pH控制传感器旨在在发酵罐的培养基中建立对产有机酸的微生物生长的最适pH值。在发酵罐内，对于微生物生长所必需的的典型成分，例如氮源，可以与碳源底物一同存在。当培养基的pH值随着发酵的进行而偏离预定范围时，系统设定自动添加碳源底物和碱(例如，碳酸氢铵)的混合物。适合单一产有机酸微生物生长的pH值是本领域已知的。例如，当生产丁酸时，对于产丁酸的微生物生长的最适pH值在4.5-7的范围内。

[0045] 气量计可以与pH控制传感器一起或单独安装在发酵罐中，来测定气体在发酵罐中的生成量和生成速率。气体的生成速率提供了关于底物-碱混合物的添加速率或终止添加时机的信息。

[0046] 如上所述，本领域技术人员根据气体的生成速率和混合物的添加量，可以容易地确定底物-碱混合物添加终止的时机。

[0047] 一个规则是，发酵会被它的终产物抑制(产物抑制)。随着发酵的进行，有机酸产物使得微生物菌株的活性降低。通常情况下，甚至当碳源底物没有完全消耗完发酵就停止。这种情况下，碳源底物被浪费。在本发明中，弱碱如碳酸氢铵被使用作为中和剂，避免了微生物菌株受到高pH值影响。伴随二氧化碳(CO2)和氢气(H2)的产生，所述碱中和了有机酸，如丁酸。气体的生成速率可用于监测微生物菌株的活性，其提供了关于碳源底物适当添加时机的信息。因此在本发明中，发酵可以进行至碳源底物完全消耗。因此，由于碳源底物的供给可以在适当的时间点停止，以避免剩余碳源底物的损失，因此发酵过程可以保持微生物的最佳活性而有效进行。碳源底物和碱添加完成后，发酵罐的pH值可以以本领域公知的方法进行调节，例如，通过以恒定速率添加pH调节剂，如氨水、碱金属氢氧化物溶液、碱土金属氢氧化物溶液、它们的混合物，例如氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾等。

[0048] 此外，当将根据本发明的分批补料培养方法应用于发酵生产有机酸时，可使用记载于本发明中的培养基取代用于细菌发酵的菌种培养的昂贵培养基，并将其用在菌种培养的最后培养阶段，因此极大提高了发酵的经济性。常规丁酸发酵采用RCM(强化梭菌培养基)或类似的用于菌种培养的富含营养的培养基以提高主培养物的效率。然而，这种昂贵的菌种培养基增加了生产成本，降低了发酵的经济性。与此相反，根据本发明的补料分批培养允许在主培养物中采用这种用于菌种培养的最后阶段的培养基，而不会降低微生物的活性。

[0049] 通过下述实施例的说明可以更好的理解本发明，但其不视为对本发明的限制。

[0050] 实施例

[0051] 比较例1：分批培养

[0052] 甘蔗液和矿物质(糖浓度150～200g/L，30L)置于被氮气置换的50L厌氧发酵罐中。在此厌氧条件下，酪丁酸梭菌接种于培养液中，其中酪丁酸梭菌为培养液体积的1％～20％，然后向培养液中加入氨水以将pH值调节至6.0。随着发酵在37℃下进行，二氧化碳(CO2)和氢气(H2)产生，保持此厌氧条件。

[0053] 实施例1：分批补料培养

[0054] 在50L的厌氧发酵罐中，与比较例1相同的微生物接种到甘蔗液和矿物质中(糖浓度20～40g/L，10～15L)，然后在37℃培养，同时添加碳酸氢铵和甘蔗液的混合物(碳酸氢铵80～120g/L，糖浓度200～300g/L，15～20L)，使培养液保持在pH为6.0。与分批培养相比，补料分批培养从较小体积的培养基开始，但培养基的最终体积相同。可选地，这一最终体积可以进行调整。随着发酵的进行，产生CO2和H2气体。当气体的生成速度经监测达到1.5～2.5L/L(发酵罐)/小时的时候，终止添加碳酸氢铵和甘蔗液的混合物，以便发酵进行直至将此前所添加的糖完全耗尽。

[0055] 对比例1和实施例1的两种培养方法生产的丁酸浓度均为6％或更高。为了进行比较，当获得相同丁酸浓度时，检测了两种方法在此时间点的效率。比较例1(分批培养)和实施例1(分批补料培养)的细胞浓度(OD600-MAX)、丁酸产率(PBA)、丁酸的得率(YBA)以及乙酸的得率(YAA)的测定结果列于如下的表1中。

[0056] 表1

[0057]

[0058] 从表1的数据可了解到，分批补料培养的所有指数均优于分批培养。特别是，副产物乙酸(AA)的产生在实施例1中被极大抑制，随之而来丁酸的得率显著提升。发酵性能的这种提高被理解为源于将糖维持在不抑制微生物生长的浓度。相反，比较例1的分批培养即使保持在初始浓度时，也不能进一步发酵糖，这是因为每一批微生物间的状态并不相同。其结果是糖不能完全消耗掉，而是仍然存留。在分批补料培养中，糖可以被完全消耗而没有损失，这是因为可以根据发酵进程监测CO2和H2气体的生成从而对停止供应糖的时机进行控制。相对于传统的分批培养或等量方式逐步添加糖(参照下述比较例2)，根据本发明的丁酸(BA)的得率大幅度增加，表明了糖与碳酸氢铵混合添加以调节pH值是非常可靠且有效的。

[0059] 实施例2：添加碳酸氢铵和培养基的混合物的分批补料培养

[0060] 在此实施例中，表明了分批补料培养极大提高了丁酸(BA)浓度。因为BA本身对于产BA的微生物是有毒性的，它抑制微生物的活性(产物抑制)，即使存在底物糖时，也造成产物不再进一步生成。因此，酸的得率有限或糖被浪费。此实施例设计为通过控制糖的适当浓度来尽量减少微生物的渗透压变化，以维持微生物的活性，从而生产高浓度BA。

[0061] 在此实施例中，使用由加料罐和发酵罐组成的生物反应器系统。在发酵罐中，发酵开始所使用的培养基的体积为所需最终体积的20％～50％，而剩余培养基的添加速率取决于填充有底物-碱混合物(含有碳源底物和碱的pH调节剂)的进料罐中的pH变化。

[0062] 发酵罐的培养基的组成如下：14L的水溶液，其中含有0.8L甘蔗糖浆、180g有机氮源CSP(玉米浸渍粉)和1.8g FeSO4·7H2O；向该水溶液中加入1.5ml的消泡剂，然后高压灭菌得到培养基。另外地，含有54克KH2PO4的1L的水溶液高压灭菌后完全冷却。其与培养基一起添加到发酵罐中。对于进料罐的培养基储备，将含7.4L甘蔗糖浆的19.5L水溶液与2ml的消泡剂混合。高压灭菌后，添加2kg碳酸氢铵(NH4HCO3)至此溶液中，将其加入进料罐中，搅拌12小时使碳酸氢铵完全溶解。

[0063] 酪丁酸梭菌的菌种培养物以3L的量接种至发酵罐中。任选地，加入浓度为若干ppm的酶(转化酶)。

[0064] 在接种后，随即将培养基的pH值用氨水调节到6.3。在下述条件下进行发酵：pH值：6.3，温度：37℃，搅拌速度：200rpm。

[0065] 发酵进行时，可额外将合适量的CSP加入到发酵罐中。当气体产生速度经监测达到1.5～2.5L/L(发酵罐)/小时的时候，停止投料。之后用氨水调节培养基的pH值直至发酵完成。

[0066] 比较例2

[0067] 作为与实施例2的对比，发酵以分批方式进行。发酵罐的培养基组成如下：27L的水溶液，其中含有8L甘蔗糖浆溶液、330g有机氮源CSP(玉米浸渍粉)和1.6g FeSO4·7H2O，向该水溶液中加入3ml的消泡剂，高压灭菌后得到培养基。另外地，将含有49克KH2PO4的1L水溶液高压灭菌并完全冷却。将其与上述培养基一起加到发酵罐中。高压灭菌后，酪丁酸梭菌的菌种培养物以3L的量接种至发酵罐中。任选地，加入浓度为若干ppm的酶(转化酶)。

[0068] 在接种后，随即将培养基的pH值用氨水调节到6.3。在下述条件下进行发酵：pH值：6.3，温度：37℃，搅拌速度：200rpm。

[0069] 实施例2和比较例2的发酵结果总结在下述表2中。从图2的数据可以了解到，与常规的分批培养(比较例2)相比，根据本发明的分批补料培养(实施例2)在计算作为发酵性能和BA浓度上的所有指标均极大增加。表2显示了产物BA和副产物乙酸(AA)的产生曲线。可以看到，在分批补料培养中观测到乙酸生成减少，这对于提升发酵产量和BA产率具有贡献。

[0070] 表2

[0071]

[0072] 比较例3

[0073] 在此比较例中，糖与不同的碱一起以间歇方式添加，以便确认分批补料培养生产有机酸的效果。用氨水调节发酵开始之前发酵罐的初始pH值，以创建适合产有机酸的菌株的环境。发酵开始后，在pH探测器监测下自动添加在下表3中列出的碱溶液，同时间歇性地添加仅由糖组成的溶液。糖的间歇式引入以如下方式进行：以固定的时间间隔添加糖，或在连续测定的糖数据分析的基础上添加糖，如表3中所示。

[0074] 甘蔗液、有机氮成分(RCM：强化梭菌培养基)、和矿物(糖浓度30～100g/L，30L)置于被氮气置换的50L厌氧发酵罐中。在此厌氧条件下，酪丁酸梭菌接种于培养液中，其中该酪丁酸梭菌为培养液体积的1％～20％，然后向培养液中加入氨水以将pH值调节至6.0。随着发酵在37℃进行，二氧化碳(CO2)和氢气(H2)产生，保持此厌氧条件。

[0075] 表3总结了发酵开始后在所述发酵条件下生产的丁酸(BA)的最终浓度、产率、得率和选择性的数据。

[0076] 分批补料#1：将全部发酵所需的总糖量分为三等份，并在所测得的糖浓度为1-10g/L时添加。作为碱，稀释的氨水以表3所示的量使用。

[0077] 分批补料#2：将全部发酵所需的总糖量分为六等份，并在所测得的糖浓度为20g/L时添加。因此，糖的总体浓度维持在20-40g/L。作为碱，稀释的氨水以表3所示的量使用。

[0078] 分批补料#3：将全部发酵所需的总糖量分为三等份，并在所测得的糖浓度为1-10g/L时添加。这和分批补料#1相同，但是碱从氨换为Ca(OH)2以检测碱变化的效果。

[0079] 分批补料#4：将整体发酵所需的总糖量分为多份并持续添加(10次)，维持糖浓度在30g/L。这和分批补料#2的条件相似，但是添加的频率更快，使糖浓度在发酵期间波动程度更小。

[0080] 表3

[0081]

[0082] 1)除丁酸产品外不同有机酸的浓度(％)

[0083] 如表3所示，没有某一策略在产率、产品浓度和得率上均优于其它策略。例如，补料批次#2观察到在产率上增加，但在选择率上降低。

[0084] 另外，间歇性添加糖的策略很难应用于实际工艺中，不仅因为它很难成功控制合适的糖浓度，还因为它是劳动力密集型的，可能会导致难以自动化并且由于频繁的分析容易受到污染。

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