利用微生物水解和发酵处理城市固体废物(MSW)的方法
阅读：158发布：2020-05-08
专利汇可以提供利用微生物水解和发酵处理城市固体废物(MSW)的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 一种提供处理MSW的方法，包括以下步骤：‑向 微 生物 发酵 反应器提供未分拣MSW流，在所述反应器中在足以将活的乳酸菌浓度保持至少10.000.000.000CFU/L的条件下将MSW在35‑75℃的 温度 和10‑50重量％的非 水 含量下搅拌发酵1‑72小时，和‑从反应器中去除发酵的未分拣的MSW流并使其进行分离步骤，其中去除不可降解的固体以提供生物可降解组分的浆料。此外，提供根据所述方法制备的生物可降解组分的浆料。，下面是利用微生物水解和发酵处理城市固体废物(MSW)的方法专利的具体信息内容。
1.一种处理城市固体废物(MSW)的方法，包括以下步骤：
-向微生物发酵反应器提供未分拣MSW流，在所述反应器中在足以将活的乳酸菌浓度保持至少1.0x 10^10CFU/L并且所述MSW被酶促水解的条件下将MSW用接种的微生物群并且通过在35-75℃的温度下以10-50重量％的非水含量搅拌1-72小时来发酵，其中所述微生物群包括活的乳酸菌并且提供至少30FPU/L的微生物来源的纤维素酶活性，和-从反应器中去除发酵的未分拣的MSW流并使其进行分离步骤，其中去除不可降解的固体以提供生物可降解组分的浆料。
2.权利要求1的方法，其中未分拣的MSW流用所述废物中天然存在的微生物的微生物群接种，并处于37到55℃的温度范围内和4.2-6.0的pH范围内的发酵条件中。
3.权利要求1或2的方法，其中通过向MSW添加0.5-2.5kg水/kg MSW的恒定质量比的水获得适当的非水含量。
4.权利要求1或2的方法，其中纤维素酶活性通过用显示胞外纤维素酶活性的选定的微生物接种来添加。
5.权利要求1或2的方法，其中分离不可降解的固体之后将生物可降解组分的浆料进行后发酵。
6.权利要求1或2的方法，其中未分拣MSW流的接种通过用于从不可降解的固体回收剩余的有机材料的再循环洗涤水或工艺溶液来提供。
7.权利要求1或2的方法，其中生物可降解组分的浆料中至少40重量％的溶解的挥发性固体包含乳酸盐，和/或其中生物可降解组分的浆料中至少40重量％的非水含量包含溶解的挥发性固体。
8.权利要求1或2的方法，其中微生物发酵在45-50℃的温度范围内进行。
9.权利要求1或2的方法，其中在发酵之前，将MSW加热至不高于75℃的温度。
10.权利要求1或2的方法，其中所分离的不可降解的固体包含MSW干重的至少约20％，和/或其中所分离的不可降解的固体包含可回收材料干重的至少约20％。
11.权利要求1或2的方法，其中不可降解的固体的分拣从酶促水解开始时起36小时内进行。
12.权利要求1或2的方法，其中不可降解的固体的分拣从酶促水解开始时起24小时内进行。
13.权利要求1或2的方法，其中首先从生物可降解组分的浆料中去除乙醇或乳酸盐，然后厌氧消化，以生产生物甲烷。
14.根据权利要求1或2的方法制备的生物可降解组分的浆料。
利用微生物水解和发酵处理城市固体废物(MSW)的方法
[0002] 领域：本发明总体涉及处理固体废物的方法，特别是依赖于微生物发酵的方法。
[0003] 城市固体废物(MSW)，尤其包括家庭日常废物、来自饭店和食品加工厂的废物和来自办公楼的废物，含有大量可被进一步加工成能源、燃料和其他有用产品的有机材料组分。目前，只有小部分的可用MSW被回收，而绝大部分被扔到垃圾填埋场。
[0004] 发展高效而环境友好的处理固体废物的方法来最大限度地回收其固有能量潜力，以及回收可回收材料已经引起了非常大的兴趣。“废物到能源”加工中一个重大的挑战是MSW的异质性。固体废物通常包含大量混入了塑料、玻璃、金属和其他不可降解材料的有机可降解材料的组分。未分类废物可直接焚烧，就像在依赖于区域供热系统的国家如丹麦和瑞典广泛应用。参见Strehlik 2009。然而，焚烧方法与负面环境后果相关，也不能完成原材料的有效回收。清洁和高效地利用MSW的可降解组分与回收组合通常需要一些分类法将可降解的材料和不可降解的材料分开。
[0005] MSW中的可降解组分可采用热化学和生物方法用于“废物到能源”加工中利用。MSW可以经历高温分解或其他方式的热化学气化。有机废物在极高温下的热分解会产生挥发性组分，例如焦油和甲烷以及与直接焚烧相比，燃烧产生较低毒性后果的固体残留或“焦炭”。或者，有机废物可以热转化为包含一氧化碳、二氧化碳和氢气的“合成气”，其可以进一步被转化为合成燃料。参见例如Malkow 2004综述。
[0006] 用于转化MSW中可降解组分的生物方法包括发酵，以生产特定有用的终产物例如乙醇。参见例如WO2009/150455；WO2009/095693；WO2007/036795；Ballestero s等，2010；Li等，2007。
[0007] 或者，生物转化也可以通过厌氧消化生成生物甲烷或“沼气”实现。参见例如Hartmann and Ahring 2006综述。预分类的MSW有机成分可以直接转化为生物甲烷，参见例如US2004/0191755，或涉及在添加水的存在下的切碎的相对简单的“制浆”过程之后，参见例如US2008/0020456。
[0008] 然而，预分类MSW而获得的有机组分通常是昂贵、低效或无用的。源分类需要庞大的基础设施和运营费用以及废物收集所在社区的积极参与和支持，这在现代都市社会已被证明难以实现。机械分类是典型的资金密集型，且与有机材料的大量损失有关，大约至少30％且通常更高。参见例如Connsonni 2005。
[0009] 有关分拣系统的这些问题中的一些已经通过将未分拣废物中有机可降解组分进行液化而成功避免。液化后的有机材料可轻易与不可降解材料分离。一旦被液化为可泵浆料，有机组分可以容易地用于热化学或生物转化过程。通过高压高温的“压热器”法液化可降解组分已经被广泛报道。参见例如US2013/0029394；US2012/006089；US20110008865；WO2009/150455；WO2009/108761；WO2008/081028；US2005/0166812；US2004/0041301；US
5427650；US 5190226。
5427650；US 5190226。
[0010] 一种完全不同的液化可降解有机组分的方法是其可采用生物过程，尤其是通过酶促水解来实现。参见Jensen等，2010；Jensen等，2011；Tonini and Astrup 2012；WO2007/036795；WO2010/032557。
[0011] 与“压热器”法相比，酶促水解在液化可降解有机组分方面提供独特的优势。采用酶促液化，MSW加工可以以连续的方式进行，使用相对廉价的设备可以在相对较低的温度下运行非加压反应。相比之下，“压热器”过程则必须以批处理模式进行，而且通常涉及更高的资本成本。
[0012] “灭菌”以减少MSW引起的可能的健康风险—伯恩病原微生物的认知性需求已经成为支持“压热器”液化法占优势的流行观点。参见例如WO2009/150455；WO2000/072987；Li等，2012；Ballesteros等，2010；Li等，2007。类似地，之前据信酶促液化需要热预处理到相对较高的至少90-95℃的温度。这样的高温被认为是必需的，一部分是为了实现未分拣MSW的“灭菌”，也能使可降解有机组分软化和纸张产品的“浆化”。参见Jensen等，2010；Jensen等，2011；Tonini和Astrup 2012。
[0013] 我们发现，采用分离的纤维素酶制剂将未分拣MSW安全的酶促液化可以不通过高温预处理而实现。事实上，与期望相反，高温预处理不仅不是必需的，而且是非常有害的，因为这会杀死在废物中生长旺盛的环境微生物。促进微生物发酵的同时，通常在40-55℃的嗜热条件下，纤维素酶水解采用“环境”微生物或采用选择性“接种”的生物来促进“生物可降解的捕获”。也就是说，同时进行的嗜热微生物发酵安全地增加回收的“生物可降解浆料”的产量。在这些情况下，通常在MSW中存在的病原微生物无法生长。参见例如Hartmann和Ahring 2006；Deportes等，1998；Carrington等，1998；Bendixen等，1994；Kubler等，1994；Six和De Baerre等，1992。在这些情况下，典型的MSW-伯恩病原体很容易被普遍存在的乳酸菌和其他安全的生物战胜。
[0014] 除了从采用分离的纤维素酶制剂的酶促水解促进“生物可降解捕获”，用乳酸菌或能产生醋酸盐、乙醇、甲酸盐、丁酸盐、乳酸盐、戊酸盐或己酸盐的微生物的任意组合同时进行的微生物发酵，能“预处理”生物可降解浆料使其更有效的成为生物甲烷生产的底物。与单独的采用分离的纤维素酶制剂酶促液化产生的生物可降解浆料相比，微生物发酵产生的生物可降解浆料中溶解物的比例相对于悬浮固体通常增加。由于微生物的“预处理”，高链多糖通常降解得更充分。同时进行的采用分离的纤维素酶制剂的微生物发酵和酶促水解将生物聚合物降解为随时可用的底物，而且，使初始底物通过代谢转化为短链羧酸和/或乙醇。由此产生的包含高比例的微生物代谢产物的生物可降解浆料提供了一种有效避免限速“水解”步骤的生物甲烷底物，参见例如Delgenes等2000；Angelidaki等，2006；Cysneiros等，2011，而且为甲烷生产提供进一步的优势，尤其是采用非常快速“固定过滤”厌氧消化系统。
[0015] 令人惊讶地，在分离不可降解材料之前将未分拣MSW的可降解组分充分液化可以仅通过微生物发酵在相对较短的处理时间内实现，通常为36小时或更短，而对于分离的纤维素酶制剂没有任何要求。可以获得包含高度的溶解固体和细菌代谢物的改进的“快速”生物甲烷底物，甚至其中不可降解材料的初步分离仅通过微生物发酵、通过在初步分离不可降解材料之后继续发酵回收的生物可降解浆料的简便方法来实现。附图说明
[0016] 图1.示范装置的主要特征的示意图。
[0017] 图2.含有或不含由分离的酶制剂提供的补充的纤维素酶活性而获得的生物来源浆料中的乳酸盐、醋酸盐和乙醇浓度的总结。
[0018] 图3.以kg TS/kg affald表示的生物可降解的捕获。(A).在3mm筛子后的生物来源的浆料中。(B)包括通过筛子保留的材料的总捕获。
[0019] 图4.通过微生物接种物和CTEC3的纤维素底物和典型MSW的降解。
[0020] 图5.通过微生物接种物和CTEC3的典型MSW的纤维素级分的比较降解。
[0021] 图6.同时进行的用CTEC3酶促水解和微生物发酵中干物质的转化。
[0022] 图7.同时进行的用CTEC3酶促水解和微生物发酵后上清液中回收的细菌代谢产物。
[0023] 图8.REnescience测试反应器的示意图。
[0024] 图9.在不同时间段期间生物来源浆料的生物可降解的捕获，以kg VS/kg处理的MSW表示。
[0025] 图10.在不同时间点的生物来源浆料中的细菌代谢物和需氧细菌数。
[0026] 图11.来自实施例7的生物来源浆料中鉴定的细菌种类分布。
[0027] 图12.来自实施例9的生物来源浆料中13种优势菌的分布。
[0028] 图13.采用来自实施例9的生物来源浆料的生物甲烷生产的增加和减少。
[0029] 图14.来自实施例6的“高乳酸盐”生物液体的生物甲烷生产的“增加”和“减少”表征。
[0030] 图15.来自实施例6中的“低乳酸盐”生物液体的生物甲烷生产的“增加”和“减少”表征。
[0031] 图16.水解的小麦秸秆生物液体的生物甲烷生产的“增加”表征。
[0032] 实施方式的详细说明
[0033] 在一些实施方案中，本发明提供了一种处理MSW的方法，包括以下步骤：
[0034] -向微生物发酵反应器提供未分拣MSW流，在所述反应器中在足以将活的乳酸菌浓度保持至少1.0x 10^10CFU/L的条件下将MSW通过在35-75℃的温度下以10-50重量％的非水含量搅拌1-72小时来发酵，
[0035] -从反应器中去除发酵的未分拣的MSW流并使其进行分离步骤，其中去除不可降解的固体以提供生物可降解组分的浆料。
[0036] 存在于废物中的天然存在的乳酸菌(LAB)菌株之前已经显示提供包含水果、蔬菜、谷物、肉、鱼等的典型厨房废物向乳酸的有效转化。参见Sakai等，2000；Sakai等，2004；Akao等，2007a；Akao等，2007b。不需要特定的接种程序来产生废物的有效乳酸发酵，这只不过是在等体积水中绞碎，然后加热至37-55℃。通常出现天然存在的菌株群落，其中一种或另一种明显作为优势菌出现。参见Sakai等，2004。然而，为了促进大规模的处理，有利的是在去除不可降解的固体之前的最初步骤期间保持尽可能短的可行的发酵时间。来自微生物的酶活性的一些降解通常应在分离不可降解的固体之前完成。理想地，MSW的生物可降解组分在分离之前液化，意味着发生充分降解，使得溶解和不溶解的固体浆料是可泵抽的。
[0037] 其中乳酸发酵已经利用包括大比例纤维素和木质纤维素材料的底物来进行，分离的纤维素酶制剂通常用于促进与利用乳酸菌的发酵同时发生的纤维素酶水解。参见例如Abe和Takagi 1990；Parajo等，1997；Chen和Lee 1997；Schmidt和Padukone 1997。然而，许多种LAB，包括几乎每种测试的乳酸菌(Lactobaccillus)和许多种小球菌(Pediococcus)已经显示胞外纤维素酶活性。参见Yang等，2001；Matthews等，2004；Matthews等，2006；Gao等，2008。因此，可以利用主要包含或甚至仅包含LAB的微生物发酵实施本发明方法并实现有效的纤维素酶活性水平。
[0038] 可以使用任何合适的固体废物以实施本发明方法。本领域技术人员将理解，术语“城市固体废物”(MSW)是指城市中通常可见的废物部分，其本身并不需要来自于城市。MSW可以是任意组合的纤维素、植物、动物、塑料、金属或玻璃废物，包括但不限于以下的一种或多种：正常城市收集系统收集的垃圾，任选在一些中心分拣、粉碎或打浆装置如或 中处理；家庭分拣出来的固体废物，包括有机部分和富含纸张部分；来源于工业的废物部分，比如饭店业、食品加工业、普通工业；来自造纸工业的废物部分；来自回收设施的废物部分；来自食品或饲料工业的废物部分；来自医药工业的废物部分；来自农业或农场相关部门的废物部分；来自富含糖或淀粉的产品加工的废物部分；污染的或以其他方式变质的农产品，例如不能用来生产食品或饲料的谷物、马铃薯和甜菜；花园垃圾。
[0039] MSW本质上通常是异质性的。关于废物材料的组成，能为国家之间的比较提供坚实基础的统计数据并不广为人知。正确的采样和表征的标准以及操作流程仍未标准化。事实上，仅报道过很少的标准化采样方法。参见Riber等，2007。至少在家庭废物方面，其组成表现出季节和地理变化。参见Dahlen等，2007；Hansen等，2007b；Muhle等，2010；Riber等，2009。还报道了家庭废物组成的地理变化，即使是在短距离的200-300km的不同城市之间。
参见Hansen等，2007b。作为一般规则，来自西欧的现代城市废物的干重通常包含约25重量％的“蔬菜和食品废物”。相反，在中国，“食品废物”的相对比例通常相对于来自西欧的MSW增加至少两倍。参见Zhang等，2010。
参见Hansen等，2007b。作为一般规则，来自西欧的现代城市废物的干重通常包含约25重量％的“蔬菜和食品废物”。相反，在中国，“食品废物”的相对比例通常相对于来自西欧的MSW增加至少两倍。参见Zhang等，2010。
[0040] 在一些实施方案中，MSW以“未分拣的”废物处理。如本文所用的术语“未分拣的”是指其中MSW没有被充分分成单独部分的过程，这样生物来源材料就没有充分和塑料和/或其他非生物来源材料分离。如本文所使用，术语“生物来源”是指生物可降解的材料，其包含来源于活生物的材料。据此定义，尽管去除了一些大型物体或金属物体，且尽管塑料和/或其他非生物来源材料有一些分离，如本文所用，废物可以是“未分拣的”。如本文所用的术语“未分拣废物”(或“未分拣MSW”)是指包含生物来源和非生物来源材料的混合物、其中15重量％或更大的干重是非生物来源材料的废物。
[0041] 通常，未分拣的MSW包含生物来源废物，包括食品和厨房废物、含有纸张和/或纸板的材料、食物废物等；可回收材料，包括玻璃、瓶、罐、金属、和某些塑料；其他可燃烧物质，虽然其本身几乎不是可回收的，但可能以废物衍生燃料的形式提供热能；和惰性物质，包括陶瓷、岩石、和各种形式的碎片。
[0042] 在一些实施方案中，MSW可以作为“分拣的”废物处理。如本文所用的术语“分拣的”是指其中MSW被充分分成单独部分的过程，这样生物来源材料就充分和塑料和/或其他非生物来源材料分离。如本文所用的术语“分拣废物”(或“分拣MSW”)是指其中小于15重量％的干重是非生物来源材料的废物。
[0043] 在一些实施方案中，MSW可以是主要包含水果、蔬菜和/或动物废物的源分离的有机废物。在一些实施方案中，各种不同的分拣系统，包括源分拣可应用于未分拣MSW，其中住户分开处理不同的废物材料。目前在奥地利、德国、卢森堡、瑞典、比利时、荷兰、西班牙和丹麦的某些城市里适当使用源分拣系统。或者，可以使用工业分拣系统。机械分拣和分离的手段包括任何现有技术已知的方法，包括但不限于在US2012/0305688；WO2004/101183；WO2004/101098；WO2001/052993；WO2000/0024531；WO1997/020643；WO1995/0003139；
CA2563845；US5465847中描述的系统。在一些实施方案中，可略微分拣废物，但仍产生了如本文所用的“未分拣的”废物部分。在一些实施方案中，使用未分拣MSW，其中大于15重量％的干重是非生物来源物质，或大于18％、或大于20％、或大于21％、或大于22％、或大于
23％、或大于24％、或大于25％。
CA2563845；US5465847中描述的系统。在一些实施方案中，可略微分拣废物，但仍产生了如本文所用的“未分拣的”废物部分。在一些实施方案中，使用未分拣MSW，其中大于15重量％的干重是非生物来源物质，或大于18％、或大于20％、或大于21％、或大于22％、或大于
23％、或大于24％、或大于25％。
[0044] 在本发明的实施方法中，调节MSW的水含量使得MSW包含10-50重量％，或在某些实施方案中为12-40％、或13-35％、或14-30％、或15-25％的非水含量。在一些实施方式中，当MSW包含适当的非水含量，不管是否已经直接添加水，水含量被认为如本文所使用的“调节的”。MSW通常包含相当大的水含量。MSW中的所有其他固体均称为如本文所用的“非水含量”。本发明实施方法中使用的含水量水平与若干个相互关联的变量有关。本发明的方法通常产生生物来源的浆料。如将容易理解的，浆料是生物来源的，其中它主要包含生物来源的材料，但也可以包括非生物来源的污染物。如本文所使用，浆料是“液体”，达到可泵抽的的程度，尽管大量内容物为不溶解固体。
[0045] 本领域技术人员将容易理解，使固体组分转化为液体浆料的能力会随着含水量的增加而增加。在一些国家中，有效的含有大量MSW的纸张和纸板的制浆通常随着含水量的增加而改进。水含量提供了一种微生物制剂可以繁殖并溶解代谢物的介质。此外，众所周知，当水解在低含水量的条件下进行时，酶活性会表现出降低的活性。例如，纤维素酶在水解非含水量高于10重量％的混合物时，通常表现出降低的活性。在降解纸张和纸板的纤维素酶情况下，已报道了来自每克底物的酶促反应的底物浓度和产量的有效线性反向关系。参见Kristensen等，2009。
[0046] 在一些实施方案中，应在废物中正常加入一些水量以使其达到适当的非水含量。例如，考虑一部分未分拣的丹麦家庭废物。表1描述了Riber等(2009),“Chemical composition of material fractions in Danish household waste,”Waste Management
29:1251中报道的未分拣MSW的特有组成。Riber等表征了2001年一天内在丹麦从2220户家庭获得的家庭废物的组分部分。本领域技术人员很容易理解，该报道的组成仅是一个用于解释本发明方法的代表性实例。在表1的实例中，不加入任何的水量，含有蔬菜、纸张和动物废物的生物来源的生物可降解部分预期平均具有大约47％的非水含量。[(绝对的非水％)/(％湿重)＝(7.15+18.76+4.23)/(31.08+23.18+9.88)＝47％非水含量。]加入相当于被处理废物部分1个重量的体积的水会使废物本身的非水含量降低到29.1％(58.2％/2)，同时使可降解组分的非水含量降低到约23.5％(47％/2)。加入相当于被处理废物部分2个重量的体积的水会使废物本身的非水含量降低到19.4％(58.2％/3)，同时使可降解组分的非水含量降低到约15.7％(47％/3)。
29:1251中报道的未分拣MSW的特有组成。Riber等表征了2001年一天内在丹麦从2220户家庭获得的家庭废物的组分部分。本领域技术人员很容易理解，该报道的组成仅是一个用于解释本发明方法的代表性实例。在表1的实例中，不加入任何的水量，含有蔬菜、纸张和动物废物的生物来源的生物可降解部分预期平均具有大约47％的非水含量。[(绝对的非水％)/(％湿重)＝(7.15+18.76+4.23)/(31.08+23.18+9.88)＝47％非水含量。]加入相当于被处理废物部分1个重量的体积的水会使废物本身的非水含量降低到29.1％(58.2％/2)，同时使可降解组分的非水含量降低到约23.5％(47％/2)。加入相当于被处理废物部分2个重量的体积的水会使废物本身的非水含量降低到19.4％(58.2％/3)，同时使可降解组分的非水含量降低到约15.7％(47％/3)。
[0047] 表1.丹麦2001年总结的废物部分的质量分布
[0048] (a)纯的部分。
[0050] (c)软塑料、塑料瓶、其他硬塑料和不可回收塑料的总和。
[0051] (d)土壤、岩石等、灰、陶瓷、猫砂和其他非可燃物的总和。
[0052] (e)铝容器、铝箔、金属箔、金属容器和其他金属的总和。
[0053] (f)透明玻璃、绿色玻璃、褐色玻璃和其他玻璃的总和。
[0054] (g)剩余13种材料部分的总和。
[0055]
[0056]
[0057] 在调节水含量时，如果需要的话，本领域技术人员能很容易地确定要加入废物的适当的水量。通常作为一个实际问题，尽管被处理的MSW的组成存在一些可变性，方便的是加入相对恒定的质量比的水(其包含水性溶液)，在一些实施方案中，为0.8-1.8kg水/kg MSW，或者0.5-2.5水/kg MSW，或者1.0-3.0水/kg MSW。因此，在处理过程中，MSW中实际的非水含量可以在一个合适范围内变化。
[0058] 可以使用多种不同的微生物发酵反应器。在一些实施方式中，可以使用类似于WO2011/032557中描述的反应器，其特征在于在基本上水平的轴上旋转的腔室，在其内表面配备有形成螺旋阵列的附加装置，其将MSW从输入端连续移动至输出端。取决于反应器填充的程度，和取决于反应器的尺寸，可以控制MSW在反应器内的平均“停留时间”。反应器可以配备有加热元件以保持适当的温度。当将MSW连续引入反应器中并从反应器中连续去除部分降解的MSW时，获得某一平均停留时间。在其他的实施方式中，可以使用可能由混凝土或其他简单建筑材料构成的大容器，其配备有搅拌装置，例如提升并混合引入的MSW的具有桨的水平设置的轴。反应器可配备用于被动通风的装置，其中提供空气暴露，且搅拌促进空气暴露。或者可以配置反应器使得通过限制空气暴露有效保持厌氧条件。
[0059] 可以通过各种不同的装置实现搅拌。搅拌是有利的，因为它不仅促进微生物发酵本身，而且促进由活微生物分泌或提供的酶催化的水解。事实上，在这点上，微生物发酵是有效的水解和发酵。在一些实施方式中，通过一种自由下落式混合，例如旋转的容器，或在微生物发酵环境中提供提升并混合MSW的水平设置的轴提供搅拌。在其他实施方式中，通过较简单的装置，例如螺旋钻提供搅拌。
[0060] 多种不同的装置可用于实现并将发酵期间的乳酸菌浓度保持为至少1.0x 10^10CFU(菌落形成单位)/L。如本文所使用，在分离不可降解的固体之前的发酵步骤期间，将乳酸菌浓度保持为这样的程度，以至于发酵中活的细菌细胞的平均浓度为发酵期间至少
1.0x 10^10CFU/L。发酵期间至少为1.0x 10^10CFU/L的平均值通常通过发酵之前和之后或期间一系列对采集样品的测量来显示。量度CFU/L通过表示为混合物的代表性样品中存在的CFU/总固体的量度来测定，然后通过混合物的总固体含量重量百分比的量度表示为/L的量度。5ml代表性样品的总固体百分比通过在室温下干燥以提供用于计算的基数来测定。使用定量PCR(qPCR)测定CFU。将悬浮在50重量％甘油中的样品材料的5ml等分试样悬浮在5ml灭菌过滤的H2O中。将等分试样在过滤器上过滤并从过滤的细胞块中提取DNA。提取DNA中的
16S rRNA基因拷贝数通过用通用的16S rRNA基因引物的qPCR分析来定量。假定每个活细胞平均有3.0个拷贝数的16S rRNA基因，基于这些数据计算细菌细胞数，并用分析样品的总固体含量来表示。古菌计数不包括在CFU/L的计数中。对应于乳酸菌的测量的活细胞计数的百分比基于由本领域熟知的16S rDNA分析提供的估计来测定。将发酵混合物的液体样品冷冻于20重量％甘油中并储存于-20℃以进行16S rDNA分析来鉴定微生物。这种分析是本领域众所周知的，且被广泛用于基于小核糖体亚单位的16S组分的原核生物的鉴定和系统发生的分析。该分析包括提取基因组DNA，用跨越高变区域V1到V3(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/
534R:ATTACCGCGGCTGCTGG；507bp长)的通用引物对制备扩增文库，用GS FLX适配子PCR标记，和测序以获得每个测试样品104.000-160.000的读取数。然后将所得序列在来自核糖体数据库项目(Cole等，2009)的rDNA数据库中用BlastN进行查询。该数据库包含长度为至少
1200bp的高质量序列以及与NCBI分类关系。目前的版本(RDP版本10，2012年9月19日更新)包含9162种细菌和375种古细菌序列。过滤BLAST结果以去除短和低质量的点击(序列一致性≥90％，对比覆盖率≥90％)。然后将通过该分析检测的细菌(其是乳酸菌，包括但不限于乳杆菌属)的百分比数应用于总测量的CFU/L作为LAB CFU/L的分级测量。例如，当在发酵混合物的代表性样品中测定2.0x 10^12CFU/L活的细菌总数，和当发酵混合物的代表性样品的16s RNA分析表明50％的检测的微生物是乳杆菌属，乳酸菌的浓度在测量时为至少1.0x
10^12CFU/L。
1.0x 10^10CFU/L。发酵期间至少为1.0x 10^10CFU/L的平均值通常通过发酵之前和之后或期间一系列对采集样品的测量来显示。量度CFU/L通过表示为混合物的代表性样品中存在的CFU/总固体的量度来测定，然后通过混合物的总固体含量重量百分比的量度表示为/L的量度。5ml代表性样品的总固体百分比通过在室温下干燥以提供用于计算的基数来测定。使用定量PCR(qPCR)测定CFU。将悬浮在50重量％甘油中的样品材料的5ml等分试样悬浮在5ml灭菌过滤的H2O中。将等分试样在过滤器上过滤并从过滤的细胞块中提取DNA。提取DNA中的
16S rRNA基因拷贝数通过用通用的16S rRNA基因引物的qPCR分析来定量。假定每个活细胞平均有3.0个拷贝数的16S rRNA基因，基于这些数据计算细菌细胞数，并用分析样品的总固体含量来表示。古菌计数不包括在CFU/L的计数中。对应于乳酸菌的测量的活细胞计数的百分比基于由本领域熟知的16S rDNA分析提供的估计来测定。将发酵混合物的液体样品冷冻于20重量％甘油中并储存于-20℃以进行16S rDNA分析来鉴定微生物。这种分析是本领域众所周知的，且被广泛用于基于小核糖体亚单位的16S组分的原核生物的鉴定和系统发生的分析。该分析包括提取基因组DNA，用跨越高变区域V1到V3(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/
534R:ATTACCGCGGCTGCTGG；507bp长)的通用引物对制备扩增文库，用GS FLX适配子PCR标记，和测序以获得每个测试样品104.000-160.000的读取数。然后将所得序列在来自核糖体数据库项目(Cole等，2009)的rDNA数据库中用BlastN进行查询。该数据库包含长度为至少
1200bp的高质量序列以及与NCBI分类关系。目前的版本(RDP版本10，2012年9月19日更新)包含9162种细菌和375种古细菌序列。过滤BLAST结果以去除短和低质量的点击(序列一致性≥90％，对比覆盖率≥90％)。然后将通过该分析检测的细菌(其是乳酸菌，包括但不限于乳杆菌属)的百分比数应用于总测量的CFU/L作为LAB CFU/L的分级测量。例如，当在发酵混合物的代表性样品中测定2.0x 10^12CFU/L活的细菌总数，和当发酵混合物的代表性样品的16s RNA分析表明50％的检测的微生物是乳杆菌属，乳酸菌的浓度在测量时为至少1.0x
10^12CFU/L。
[0061] 实现乳酸菌浓度为至少1.0x 10^10CFU/L通常非常简单。不管通风条件是需氧或厌氧，LAB通常将包含大比例的当MSW仅在37-50℃温度下孵育时进化的微生物群。参见例如Akao等，2007a；Akao等，2007b；Sakai等，2000；Sakai等，2004。因此，微生物发酵条件可以是需氧或厌氧。约1.0x 10^10CFU/L的活的LAB细菌数通常可以在乳酸发酵典型厨房废物约12小时内获得，无需添加酶活性。参见Sakai等，2000和Sakai等，2004。在随后呈现的实施例中鉴定的乳酸菌的传代加倍时间报道为约4到5小时。参见Liong和Shaw 2005。
[0062] 在一些实施方式中，引入的MSW流用废物中天然存在的微生物接种物简单接种，并任选在37到55℃、或40到55℃、或45到50℃的温度范围内和4.2-6.0的pH范围内的发酵条件下在作为食物来源的本地废物或本地废物的组分上“醒发”。
[0063] 因为LAB生成酸性代谢物，其继续生长通常包括要求调节pH以保持适当的生长条件。通常LAB喜欢4.2到6.0范围内的pH条件。在一些实施方式中，微生物发酵期间的pH调节可以通过微生物手段来提供，例如通过在微生物发酵混合物中包括将酸性产物转变为非酸性产物的酵母或细菌或其他微生物，如Nakaski等，1996和Nakasaki等2013所描述的方法来提供。
[0064] 在最短的可行时间框中实现生物分拣通常是有利的，也就是说，在分离不可降解的固体之前保持微生物发酵的持续时间尽可能短。这可以用特定速度通过提供引入的未分拣MSW流的初始接种来实现。在一些实施方式中，接种物可以简单地为再循环的工艺用水，其可以有利地加热至37-55℃的温度。在一些实施方式中，接种物本身将至少1.0x 10^10CFU/L的活LAB浓度赋予引入的MSW流。在一些实施方式中，冷冻干燥的细胞可以作为接种物直接添加。在一些实施方式中，来自给定位置的MSW的生物可降解组分可用作底物，在发酵器中在其上培养乳酸菌接种物并引入进入的未分拣MSW流。在一些实施方式中，进入的MSW流可进行加热灭菌，使得可以接种具有特定有利性质的乳酸菌的特殊菌株。
[0065] 在一些实施方式中，连续操作期间微生物发酵反应器中活LAB的浓度保持在至少1.0x 10^10CFU/L或至少2.0x 10^10CFU/L或至少3.0x 10^10CFU/L的水平，其中将进入的MSW流连续引入，且在分离不可降解的固体之前将发酵的MSW流连续去除，进行至少20小时，或至少50小时，或至少70小时。在一些实施方式中，微生物发酵可与利用分离的酶制剂的酶促水解同时进行。在这些实施方式中，分离不可降解的固体之前微生物发酵期间活LAB的水平可以低得多，为约5.0x 10^7CFU/L，或5.0c 10^7CFU/L-1.0x 10^10CFU/L。
[0066] 在一些实施方式中，通过提供微生物发酵的微生物群提供至少30FPU/L的微生物来源的纤维素酶活性。如本文所使用，术语微生物来源的纤维素酶活性是指不是通过已经添加至发酵混合物的分离的酶制剂直接提供的活性，而是指通过活生物提供的活性。在一些情况中，活生物可以通过大量分泌纤维分解酶提供纤维素酶活性。在其他情况中，活生物可以在与纤维素底物的相对局部接触中提供纤维素酶活性。微生物来源的纤维素酶活性通过如下方法测定：在活性测量期望的温度、pH和通风条件下将包含活细菌的样品与添加的清洁的纯纤维素底物(棉纸或滤纸)一起孵育24小时。从添加的纤维素底物转移到液相的固体块，校正的通过包含微生物的样品本身转移到液相的固体块的“背景”，和校正的在测试的反应条件下仅通过水从添加的纤维素底物转移到液相的固体块的“背景”提供微生物来源的纤维素酶活性的测量。然后在滤纸单元(FPU)中将该测量与在同等条件下通过具有已知的纤维素酶活性的纤维素酶制剂获得的活性相比较，如Ghose,T.K.(1987)，Measurement of cellulase activities.Pure&Appl.Chem.,59(2):p.257-268的方法所测定。[(通过包含微生物的样品获得的从纤维素底物转移到液相的固体块的样品-背景和水-背景百分比)除以(通过分离的酶制剂获得的从纤维素底物转移到液相的固体块的水-背景百分比)]乘以分离的酶制剂的已知FPU活性提供微生物来源的纤维素酶活性的测量。然后将该活性测量除以进行测量的反应体积，以提供表示为FPU/L的测量。本领域技术人员将容易理解可在测量之前包含微生物的样品可以已经被稀释，和样品来源中FPU/L的最终估计可涉及稀释的校正。在其中通过分离的酶制剂提供的FPU活性的一些组分与微生物来源的纤维素酶活性组合的情况中，测量的微生物来源的纤维素酶活性仅通过线性减去从微生物背景中分离的酶提供的活性来校正。以下给出计算实例：将20ml微生物接种物样品在1g添加的纤维素底物存在下孵育24小时。校正通过接种物样品本身释放的背景固体后，观察到12％纤维素质量的净总量从纤维素底物转移到液相。将添加了1g纤维素底物的20ml缓冲剂样品和预先测量的已知FPU活性为相当于5.7FPU/g纤维素的分离的纤维素酶制剂在同等条件下孵育24小时。观察到62％纤维素质量的净总量从纤维素底物转移到液相。将添加了1g纤维素底物的20ml水样品在同等条件下孵育24小时。观察到3％纤维素质量的净总量从纤维素底物转移到液相。将具有已知FPU活性的一些少量分离的酶制剂添加至发酵罐，从该发酵罐中以按发酵罐容量的总体积表示为8FPU/L的量回收微生物接种物。测量的微生物来源的纤维素酶活性通过下式给出：[(12％自我背景校正的转移-3％水背景转移)/(62％转移-3％水转移)]*(5.7FPU/0.020L)＝43.5FPU/L初始微生物-8FPU/L分离的酶贡献＝35.47FPU/L微生物来源的纤维素酶活性。
[0067] 在一些实施方式中，微生物来源的纤维素酶活性可通过专门的分泌纤维素酶的生物来提供，其已经包括在对引入的MSW流应用的接种物中。在一些实施方式中，微生物来源的纤维素酶活性可以达到至少50FPU/L或至少75FPU/L或至少100FPU/L或至少300FPU/L或至少500FPU/L或至少700FPU/L或至少1000FPU/L的水平。在一些实施方式中，向微生物发酵混合物中添加分离的酶制剂，包括淀粉酶制剂或其他的酶制剂是有利的。
[0068] 分离不可降解的固体之前的微生物发酵的持续时间通过微生物发酵反应器内的平均停留时间来测定。在一些实施方式中，分离可降解材料之前的微生物发酵中MSW流的平均停留时间是18小时或更短，或24小时或更短，或36小时或更短，或36小时-48小时，或48小时-60小时，或60小时-72小时，或72小时或更短。在一些实施方式中，本发明提供通过加工MSW的方法获得的生物可降解的浆料。
[0069] 通常以连续方式将发酵的MSW流从微生物发酵反应器中去除。即，将未分拣的MSW流连续引入反应器，并将部分水解、发酵的MSW流从反应器中连续去除。然而，在一些实施方式中，可以脉动的方式引入MSW流，其中注射一次MSW，然后暂停，随后注射MSW。类似地，在一些实施方式中，可以脉动的方式将部分水解、发酵的MSW流从反应器中去除，其中排出一次MSW，然后暂停，随后排出MSW，诸如此类。
[0070] 从微生物发酵反应器中去除后，使部分水解、发酵的MSW进行分离步骤，其中去除不可降解的固体以提供生物可降解组分的浆料。该分离步骤和后续加工可以通过多种不同的方式实现。
[0071] 在一些实施方式中，分离步骤分两步骤实现。首先，弹道分离器去除两股不可降解的材料流，产生包含塑料袋和其他通常没有形状的材料的“二维”(2D)级分、包含瓶子和具有固定形状的容器的“三维”(3D)级分和大量生物可降解组分的生物来源的液体浆料。在第二步骤中，将2D级分进一步用螺旋压榨机或类似装置压榨以进一步增加生物来源的浆料的产量。
[0072] 在一些实施方式中，将2D级分进一步进行洗涤，以进一步回收生物可降解的材料。因此该步骤中获得的洗涤水可以保持在发酵温度并用于润湿以及接种引入的未分拣MSW。
[0073] 在一些实施方式中，可以使用图1所述的处理方案。图1显示REnescience版本1示范装置的主要特征的示意图。将未分拣的MSW进行生物学分拣过程，其产生四种产品：适于生物甲烷生产或其他处理的生物来源的浆料、用于再循环的惰性物(玻璃和砂)和适于RDF生产以及适于回收金属、塑料和木材的无机材料的“二维”(2D)和“三维”(3D)级分。将来自城区的MSW原样收集在塑料袋中。将MSW运送至REnescience废物精炼厂，将其储存在筒仓中直到处理。取决于MSW的特性，可以在REnescience系统前面设置分拣步骤以清除太大的颗粒(超过500mm)。将未分拣的MSW流加热，其非水含量通过添加热的水性溶液来调节。在一些实施方式中，可以添加由分离的酶制剂提供的纤维素酶活性以促进MSW中生物可降解组分的快速降解。在一些实施方式中，在适当的非水含量将分离的酶制剂添加至热的MSW。在一些实施方式中，不添加分离的酶制剂，且微生物水解和发酵通过将发酵期间的乳酸菌保持在活的细菌细胞至少为1.0x 10^10CFU/L的水平来提供。添加或不添加酶的MSW可以在类似于WO2011/032557描述的微生物发酵反应器中孵育。当将MSW连续引入反应器并从反应器中连续去除部分降解的MSW时，获得某一平均停留时间。然后将从反应器中去除的部分降解的MSW进行两个不同的分离步骤。首先，可以使用通常用于分拣的弹道分离器(例如具有20-50mm的筛子)以产生生物来源的浆料流，以及3D不可降解的级分和2D不可降解的级分。
[0074] 在一些实施方式中，如图1所示，2D不可降解的级分可以利用螺旋压榨机进一步进行脱水，其中回收的额外生物来源的浆料又与从弹道分离器步骤获得的浆料混合。
[0075] 在一些实施方式中，如图1所示，所得生物来源的浆料可以利用一系列振动筛(例如，6-10mm，例如8mm的粗筛，然后是一种或多种更精细的2-6mm，例如3mm的筛子)进行进一步“精细”分离。这些粗筛通常主要分出不可降解的污染物。更精细的筛子，例如3mm筛子，通常分出较大的纤维，其包含大量生物可降解的材料。通过更精细的筛子后，在一些实施方式中，可以将所得的通常是可泵抽的(即液体)生物来源的浆料储存在大槽中。
[0076] 在一些实施方式中，可以将通过一个或多个筛系统保留的生物可降解材料再引入储存的生物来源的浆料中并在35-75℃温度下进行后发酵1-72小时，以实现材料的更完全降解。
[0077] 在一些实施方式中，如图1所示，可以将脱水的固体不可降解的2D级分进行逆流洗涤事件以清洁2D级分并回收否则将损失的额外的生物可降解材料。例如在一些实施方式中，水流可以如图1所示。可在简单的桶中用淡水洗涤从弹道分离器回收的3D不可降解的材料。因此该洗涤水可用作“清洁”水，其输入两个相同洗涤装置的第二个以提供逆流洗涤：“清洁”新水遭遇“最清洁的”废物，同时将更脏的水连续应用于引入的“较脏的”废物。在一些实施方式中，洗涤事件如下工作：脏的2D级分进入第一洗涤装置中的桶，其中废物与逆流洗涤水混合并机械混合。此外，脏的洗涤水可以用.04-.08mm的筛子进行筛过滤以去除通常主要包含生物可降解材料的纤维。砂和重材料也可通过沉降和通过各洗涤装置底部的螺旋输送机去除。去除的级分通常主要是砂/玻璃/重塑料/和其他无机物。第一次洗涤之后，可通过螺旋钻或其他装置将废物移至可与第一洗涤装置相同的第二洗涤装置中。在该实施方式中，来自第一洗涤装置的洗涤水通常具有1–4重量％的TS(总固体)，而来自第二洗涤装置的洗涤水通常具有0.5–3.0重量％的TS。
[0078] 在一些实施方式中，包含从MSW以及相关微生物回收的一些生物可降解材料的洗涤水可以储存在“缓冲”槽中。然后来自该“缓冲”槽的水性溶液可用于调节引入的MSW的非水含量。在一些实施方式中，来自“缓冲”槽的溶液可以通过应用蒸汽来加热，然后将加热溶液与引入的MSW混合以将其同时加热至适当的温度并调节非水含量。在一些实施方式中，来自“缓冲”槽的溶液本身在缓冲液槽中加热至35到55℃的温度。仅加热缓冲槽储存的洗涤水的行为足以诱导发酵和促进细菌生长，丰富溶液作为引入的MSW的“接种物”的能力，以促进微生物发酵。在一些实施方式中，可以将“缓冲”槽储存的加热的洗涤水搅拌、调节pH并“送入”通过一个或多个筛系统或通过所得生物来源的浆料或通过两者保留的生物可降解材料，以进一步促进细菌发酵和进一步增强作为引入的MSW的接种物的溶液的“功效”。
[0079] 不可降解的固体的分离和促进微生物发酵的方案可以通过多种手段实现。在一些实施方式中，可以将引入的MSW流送入微生物发酵反应器，然后一段时期的微生物发酵后，用螺旋压榨机直接进行压榨，分离生物来源的浆料，然后添加淡水，然后是第二次螺旋压榨机处理，产生从第二螺旋压榨机处理回收的稀释的生物来源的浆料，其可用于调节非水含量和提供引入的MSW流的接种。或在一些实施方式中，应用类似的方案将一些或全部生物来源的浆料直接用于调节引入的MSW流的非水含量。
[0080] 在一些实施方式中，可以将引入的MSW流送入微生物发酵反应器，然后一段时期的微生物发酵后，进行分离步骤例如弹道分离器或鼓式分离器或振动筛，回收一些生物来源的浆料，然后用螺旋压榨机压榨以回收额外的生物来源的浆料，其中一些浆料可以直接用于调节引入的MSW流的非水含量。
[0081] 在一些实施方式中，微生物发酵与酶促水解同时实现。酶促水解可以通过各种不同方式实现。在一些实施方案中，酶促水解可以通过分离的酶制剂实现。如本文所用，术语“分离的酶制剂”是指包含酶活性的制剂，该制剂是提取的、分泌的、或者是通过生物来源获得的，任选经部分或广泛纯化。
[0082] 各种不同的酶活性可以有利地用于实践本发明的方法。例如，就表1所示的MSW组成而言，至少在丹麦，显而易见的是，含纸张废物包含最大干重的生物材料单一组分。因此，对于本领域技术人员显而易见的是，对于典型的家庭废物，纤维素降解活性将是特别有利的。在含纸张废物中，纤维素被预先加工，并作为混合有木质素和半纤维素的木质纤维素生物质组分与其天然组分分离。因此，含纸张废物可以用相对“简单的”纤维素酶制剂有利地降解。
[0083] “纤维素酶活性”是指纤维素中1,4-B-D-糖苷键的酶促水解。在从细菌、真菌或其他来源获得的分离的纤维素酶制剂中，纤维素酶活性通常包含不同酶活性的混合物，包括分别催化1,4-B-D-糖苷键的内切和外切水解的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶(也叫纤维二糖水解酶)，以及将外切葡聚糖酶水解的低聚糖产物水解为单糖的B-葡萄糖苷酶。不溶性纤维素的完全水解通常需要不同酶之间的协同作用。
[0084] 作为一个实际问题，有利的是在一些实施方案中简单地使用市售的为木质纤维素生物质转化而优化的分离的纤维素酶制剂，因为这些酶制剂可以以相当低的成本买到。这些制剂当然适用于实施本发明的方法。术语“为木质纤维素生物质转化而优化”是指为了提高水解产量和/或降低将预处理的木质纤维素生物质水解为可发酵糖的酶消耗量的特定目的而选择和修饰酶混合物的产品开发过程。
[0085] 然而，市售的为水解木质纤维素生物质而优化的纤维素酶混合物通常包含高水平的其他专用的酶活性。例如，我们测定了市售的由NOVOZYMESTM以商标CELLIC CTEC2TM和CELLIC CTEC3TM提供的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂，和由GENENCORTM以商标ACCELLERASE 1500TM提供的相似制剂中存在的酶活性，发现这些制剂中的每一种包含超过200U/g的木聚糖内切酶活性，超过85U/g水平的木糖苷酶活性，超过9U/g水平的B-L-阿拉伯呋喃糖酶活性，超过15U/g水平的淀粉葡萄糖苷酶活性，和超过2U/g水平的a-淀粉酶活性。
[0086] 更简单的分离的纤维素酶制剂也可以有效用于实践本发明的方法。合适的纤维素酶制剂可以通过本领域熟知的方法从各种微生物中获得，包括好氧和厌氧细菌、白腐真菌、软腐真菌和厌氧真菌。如其整体通过引用明确结合于此的参考文献13，R.Singhania等,"Advancement and comparative profiles in the production technologies using solid-state and submerged fermentation for microbial cellulases,"Enzyme and Microbial Technology(2010)46:541-549所述，产生纤维素酶的生物通常产生合适比例的不同酶的混合物以适于木质纤维素底物的水解。优选的可用于木质纤维素生物质转化的纤维素酶制剂的来源包括真菌，比如木霉(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、镰刀菌(Fusarium)、腐质霉(Humicola)、黑曲霉(Aspergillus)和黄孢原毛(Phanerochaete)的种。
[0087] 除了纤维素酶活性，一些其他的在实践本发明方法中证实是有利的酶活性包括作用于食品废物的酶，如蛋白酶、葡糖淀粉酶、内切淀粉酶、蛋白酶、果胶酯酶、果胶裂解酶和脂肪酶，以及作用于花园废物的酶，如木聚糖酶和木糖苷酶。在一些实施方案中，有利地包括其他酶活性如海带多糖酶(laminarase)、角蛋白酶或漆酶。
[0088] 在一些实施方案中，可以直接接种表现出胞外纤维素酶活性的所选择微生物以同时进行酶促水解和微生物发酵，包括但不限于以下一种或多种嗜热的分解纤维素的生物可以单独或与其他生物一起接种：类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)，参见Asha等，2012；热纤梭菌(Clostridium thermocellum),参见Blume等，2013和Lv和Yu，2013；所选择的链霉菌属(Streptomyces)、小双孢菌属(Microbispora)和芽孢杆菌属(Paenibacillus)的种,参见Eida等，2012；Clostridium straminisolvens,参见Kato等，
2004；厚壁菌属(Firmicutes)、放线菌属(Actinobacteria)、变形菌属(Proteobacteria)和拟杆菌属(Bacteroidetes)的种,参见Maki等，2012；Clostridium clariflavum,参见Sasaki等，2012；与热纤梭菌(Clostridium thermocellum)和Clostridium
straminisolvens在系统发育和生理学上相关的新的梭菌属的种，参见Shiratori等，2006；
Clostridium clariflavum sp.nov.和Clostridium Caenicola,参见Shiratori等，2009；
嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus Thermoleovorans),参见Tai等，2004；Clostridium stercorarium,参见Zverlov等，2010；或一种或多种嗜热真菌嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)、Scytalidium thermophillum、Clostridium straminisolvens和弯曲高温单胞菌(Thermonospora curvata),参见Kumar等，2008综述。在一些实施方案中，可以接种表现出其他有用的胞外酶活性的微生物以同时进行酶促水解和微生物发酵，例如，蛋白和角蛋白降解真菌，参见Kowalska等，2010，或表现出胞外脂肪酶活性的乳酸菌，参见Meyers等，1996。
2004；厚壁菌属(Firmicutes)、放线菌属(Actinobacteria)、变形菌属(Proteobacteria)和拟杆菌属(Bacteroidetes)的种,参见Maki等，2012；Clostridium clariflavum,参见Sasaki等，2012；与热纤梭菌(Clostridium thermocellum)和Clostridium
straminisolvens在系统发育和生理学上相关的新的梭菌属的种，参见Shiratori等，2006；
Clostridium clariflavum sp.nov.和Clostridium Caenicola,参见Shiratori等，2009；
嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus Thermoleovorans),参见Tai等，2004；Clostridium stercorarium,参见Zverlov等，2010；或一种或多种嗜热真菌嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)、Scytalidium thermophillum、Clostridium straminisolvens和弯曲高温单胞菌(Thermonospora curvata),参见Kumar等，2008综述。在一些实施方案中，可以接种表现出其他有用的胞外酶活性的微生物以同时进行酶促水解和微生物发酵，例如，蛋白和角蛋白降解真菌，参见Kowalska等，2010，或表现出胞外脂肪酶活性的乳酸菌，参见Meyers等，1996。
[0089] 酶促水解可通过本领域公知的方法，采用一种或多种包括之前提及的那些的任一种的多种酶制剂的任何一种或多种的分离的酶制剂，或者通过用一种或多种所选择的能影响所需酶促水解的生物接种处理MSW来进行。在一些方案中，酶促水解采用有效量的一种或多种包含纤维素酶、β-葡萄糖苷酶酶、淀粉酶和木聚糖酶活性的分离的酶制剂来进行。量是其中所使用的酶制剂在18小时的水解反应时间内在所使用的条件下共同实现了MSW中存在的可降解的生物来源材料的至少40％干重的溶解的“有效量”。在一些实施方案中，使用一种或多种分离的酶制剂，其中各种酶活性的相对比例总体如下：使用酶活性混合物，以使其1FPU的纤维素酶活性与至少31CMC U的内切葡聚糖酶活性相关，以及1FPU的纤维素酶活性与至少7pNPG U的β-葡萄糖苷酶活性相关。本领域技术人员将容易地理解，CMC U是指羧甲基纤维素单位。一个CMC U活性在50℃和pH4.8的特定分析条件下，1分钟内释放1umol还原糖(以葡萄糖当量表示)。本领域技术人员将容易地理解pNPG U是指pNPG的单位。一个pNPG U活性在50℃和pH4.8下，每分钟从对硝基苯基-B-D-葡萄糖苷中释放1umol硝基苯酚。本领域技术人员还将容易地理解“滤纸单位”FPU提供了纤维素酶活性的度量。如文本所用，FPU是指采用全文通过引用明确并入本文的Adney,B.and Baker,J.,Laboratory Analytical Procedure#006,"Measurement of cellulase activity",August 12,1996,the USA National Renewable Energy Laboratory(NREL)中的方法测定的滤纸单位。
[0090] 在实践本发明的实施方案时，在开始酶促水解前调节MSW的温度可以是有利的。本领域众所周知，纤维素酶和其他酶通常表现出最佳温度范围。虽然从极端嗜热生物中分离的酶的实例当然是已知的，其最佳温度大约为60或甚至70℃，酶最佳温度范围通常落入35-55℃范围内。在一些实施方案中，酶促水解在30-35℃、或35-40℃、或40-45℃、或45-50℃、或50-55℃、或55-60℃、或60-65℃、或65-70℃、或70-75℃的温度范围内进行。在一些实施方案中，有利的是在至少45℃的温度下同时进行酶促水解和微生物发酵，因为这有利于阻碍MSW-伯恩病原菌的生长。例如参见Hartmann and Ahring 2006；Deportes等，1998；
Carrington等，1998；Bendixen等，1994；Kubler等，1994；Six和De Baerre等，1992。
Carrington等，1998；Bendixen等，1994；Kubler等，1994；Six和De Baerre等，1992。
[0091] 利用纤维素酶活性的酶促水解通常将纤维素材料糖化。因此，在酶促水解过程中，固体废物被糖化且液化，即，从固体形式转化为液体浆料。
[0092] 之前，利用酶促水解实现生物来源组分液化的加工MSW的方法已经预期将MSW加热到比酶促水解需要的温度高很多的温度的需要，尤其为了实现废物的“灭菌”，然后是必须的冷却步骤，以使经加热的废物回到适于酶促水解的温度。在实践本发明的方法时，将MSW简单地置于适于酶促水解的温度已经足够。在一些实施方案中，有利的是用热水简单地将MSW调节到合适的非水含量，以将MSW置于适合酶促水解的温度的方式实施。在一些实施方案中，通过在反应容器里加入热水量、或蒸汽，或通过其他加热方式加热MSW。在一些实施方案中，将MSW在反应容器里加热到高于30℃但低于85℃的温度、或到84℃或更低的温度、或到80℃或更低的温度、或到75℃或更低的温度、或到70℃或更低的温度、或到65℃或更低的温度、或到60℃或更低的温度、或到59℃或更低的温度、或到58℃或更低的温度、或到57℃或更低的温度、或到56℃或更低的温度、或到55℃或更低的温度、或到54℃或更低的温度、或到53℃或更低的温度、或到52℃或更低的温度、或到51℃或更低的温度、或到50℃或更低的温度、或到49℃或更低的温度、或到48℃或更低的温度、或到47℃或更低的温度、或到46℃或更低的温度、或到45℃或更低的温度。在一些实施方案中，将MSW加热到不高于进行酶促水解的最高温度以上10℃的温度。
[0093] 如在此所述，将MSW“加热到一个温度”是指在反应器中将MSW的平均温度升高到该温度。如本文所用，将MSW加热到的温度是在反应器中达到的MSW的最高平均温度。在一些实施方案中，最高平均温度可能不会在整个过程中维持。在一些实施方案中，加热反应器可包含不同的区域以使加热在不同温度的阶段发生。在一些实施方案中，加热可在进行酶促水解的同一反应器中实现。加热的目的是简单地使纤维素废物的大部分和工厂废物的很大一部分处于适合酶促水解的最佳环境。为了处于适合酶促水解的最佳条件，理想地，废物应具有适合酶促水解中采用的酶活性的温度和水含量。
[0094] 在一些实施方案中，有利的是在加热过程中搅拌以实现均匀加热的废物。在一些实施方案中，搅拌可包括自由落体混合，例如在具有基本上沿水平轴旋转的腔室的反应器中或具有旋转轴升降MSW的混合器中或具有水平轴或桨升降MSW的混合器中混合。在一些实施方案中，搅拌可包括振摇、搅拌或通过运送螺旋输送机输送。在一些实施方案中，在将MSW加热到所需温度后进行搅拌。在一些实施方案中，搅拌进行1-5分钟、或5-10分钟、或10-15分钟、或15-20分钟、或20-25分钟、或25-30分钟、或30-35分钟、或35-40分钟、或40-45分钟、或45-50分钟、或50-55分钟、或55-60分钟、或60-120分钟。
[0095] 酶促水解在加入分离的酶制剂时开始。或者，在不加分离的酶制剂而是采用表现出所需胞外酶活性的微生物的情况下，酶促水解在加入所需微生物时开始。
[0096] 在实践一些实施方式时，酶促水解与微生物发酵同时进行。同时发生的微生物发酵可采用各种不同方法实现。在一些实施方案中，简单地使MSW中天然存在的微生物在反应条件下生长，其中处理的MSW没有被预加热到足以产生“灭菌”效果的温度。典型地，MSW中存在的微生物包括适应局部环境的生物。同时进行微生物发酵的总体有益效果是比较强大的，意味着非常广泛种类的不同生物能够单独或共同地通过酶促水解MSW而有利于有机物捕获。不希望受理论束缚，我们认为共发酵微生物单独地对于没有被纤维素酶水解的食物废物的降解具有一些直接作用。同时，纤维素酶水解所释放的碳水化合物单体和低聚体特别易于被几乎任何微生物种消耗。这为纤维素酶提供有益的协同作用，可能通过酶活性产物抑制的释放，也可能因为不能立即显现的其他原因。微生物代谢的终产物在任何情况下通常都适于作为生物甲烷底物。因此，微生物代谢产物中酶促水解MSW的富集其本身已经导致生物甲烷底物质量的提高。乳酸菌尤其在自然中普遍存在，且通常在非水含量为10-45％的MSW在45-50％温度范围内酶促水解时观察到乳酸产生。在更高的温度下，可能其他天然存在的微生物种占优势，除乳酸之外的微生物代谢产物变得更加普遍。
[0097] 在一些实施方案中，可通过采用一种或多种微生物种直接接种来实现微生物发酵。本领域技术人员将容易理解，可以有利地选择用于接种以提供MSW的同时酶促水解和发酵的一种或多种细菌种，其中该细菌种能在所使用的酶活性的最适温度或其附近生长。
[0098] 接种水解混合物来诱导微生物发酵可以通过各种不同方法实现。
[0099] 在一些实施方案中，有利的是在加入酶活性或加入表现出胞外纤维素酶活性的微生物之前、之后或同时接种MSW。在一些实施方案中，有利的是采用一种或多种包括但不限于以下一种或多种、或其遗传修饰变体的LAB种：胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸杆菌(Lactobacillus lactis)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约古特乳杆菌(Lactobacillus jugurti)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、肉乳杆菌(Lactobacillus carnis)、栖鱼乳杆菌(Lactobacillus piscicola)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus maltaromicus)、假胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus pseudoplantarum)、敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)、巴伐利亚乳杆菌(Lactobacillus bavaricus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、Lactobacillus uamanashiensis、淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、分歧乳杆菌(Lactobacillus divergens)、干酪乳杆菌阿拉伯糖亚种(Lactobacillus alactosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、同型腐酒乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfrancisco)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillus ponti、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、融合乳杆菌(Lactobacillus confuses)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardi)、克菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、Lactobacillus vaccinostericus、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、赖氏乳杆菌(Lactobacillus leichmanni)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、Lactobacillus salicinus、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、Lactobacillus suebicus,口乳杆菌(Lactobacillus oris)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、面包乳杆菌(Lactobacillus panis)、解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、Lactobacillus similis、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、黏膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、猪肠道乳杆菌(Lactobacillus sobrius)、Lactobacillus frumenti、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、葡聚糖乳球菌(Lactococcus dextranicum)、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、霍氏乳球菌(Lactococcus hordniae)、棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)、双乙酰乳酸链球菌(Streptococcus diacetylactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranicum)、乳脂明串珠菌(Leuconostoc cremoris)、酒明串珠菌(Leuconostoc oenos)、副肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudoesenteroides)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、冷明串珠菌(Leuconostoc gelidum)、檬酸明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、有害片球菌(Pediococcus damnosus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、啤酒片球菌(Pediococcus cervisiae)、小片球菌(Pediococcus parvulus)、嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、中间型片球菌(Pediococcus intermedius)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、和费氏丙酸盐杆菌(Propionibacterium freudenreichii)，或接种随后发现的LAB种或接种来自肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)或肉杆菌(Carnobacterium)的对产生乳酸的代谢过程表现出有用能力的其他种。
[0100] 本领域技术人员将容易地理解用于接种的细菌制剂可包含不同生物的集合。在一些实施方案中，可以采用在任何给定地理区域存在且适于在来自该区域MSW中生长的天然存在的细菌。如本领域众所周知，LAB普遍存在且通常包含MSW中任意天然存在的细菌群体的主要成分。
[0101] 在一些实施方案中，可以通过持续回收用于从不可降解固体中回收残余有机材料的洗涤水或加工液而用天然存在的细菌接种MSW。随着洗涤水或加工液的回收，其逐渐获得更高的微生物水平。在一些实施方案中，微生物发酵具有降低pH效应，尤其是当代谢物包含短链羧酸/脂肪酸例如甲酸盐、乙酸盐、丁酸盐、丙酸盐或乳酸盐时。因此在一些实施方案中，有利地监控并调节同时进行的酶促水解和微生物发酵混合物的pH。当洗涤水或加工液用于在酶促水解之前提高进入废物的水含量，在以分离的酶制剂或表现出胞外纤维素酶活性的微生物方式加入酶活性之前进行接种是有利的。在一些实施方案中，适于在来自特定区域的MSW上生长的天然存在的细菌可以在MSW上或通过酶促水解MSW获得的液化有机组分上培养。在一些实施方案中，然后可以将培养的天然存在细菌作为接种体单独或补充加入到采用回收的洗涤水或加工液的接种中。在一些实施方案中，可以在加入分离的酶制剂之前或同时，或在预水解开始一段时间后加入细菌制剂。
[0102] 在一些实施方案中，可以为接种培养特定的菌株，包括经过特殊修饰或“训练”以使其在酶促水解反应条件下生长和/或强化或去强化特定代谢过程的菌株。在一些实施方案中，有利地用被鉴定为能够以邻苯二甲酸盐为唯一碳源生存的细菌菌株接种MSW。这些菌株包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰变体：Chryseomicrobium intechense MW10T、Lysinibaccillus fusiformis NBRC157175、Tropicibacter phthalicus、戈登氏菌属JDC-2(Gordonia JDC-2)、Arthrbobacter JDC-32、枯草芽孢杆菌3C3(Bacillus subtilis3C3)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteronii)、丛毛单胞菌E6(Comamonas sp E6)、戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)、Rhodoccoccus jostii、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)、Arthobacter keyseri、芽孢杆菌007(Bacillus sb 007)、节杆菌PNPX-4-2(Arthobacter sp.PNPX-4-2)、Gordonia namibiensis、Rhodococcus phenolicus、假单胞菌PGB2(Pseudomonas sp.PGB2)、假单胞菌Q3(Pseudomonas sp.Q3)、假单胞菌1131(Pseudomonas sp.1131)、假单胞菌CAT1-8(Pseudomonas sp.CAT1-8)、假单胞菌(Pseudomonas sp.Nitroreducens)、节杆菌AD38(Arthobacter sp AD38)、戈登氏菌属CNJ863(Gordonia sp CNJ863)、Gordonia rubripertinctus、氧化节杆菌(Arthobacter oxydans)、Acinetobacter genomosp和醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)。参见例如Fukuhura等，2012；Iwaki等，2012A；Iwaki等，2012B；Latorre等，2012；Liang等，2010；Liang等，2008；Navacharoen等，2011；Park等，2009；Wu等，2010；Wu等，2011。在很多商业聚氯乙烯制品中被用作增塑剂的邻苯二甲酸盐是可滤去的，而且根据我们的经验，其经常以不合需要的水平存在于液化的有机组分中。在一些实施方案中，可以有利地采用通过本领域熟知的方法遗传修饰过的菌株以强化代谢过程和/或去强化其他代谢过程，包括但不限于消耗葡萄糖、木糖或阿拉伯糖的过程。
[0103] 在一些实施方案中，用鉴定为能够降解木质素的细菌菌株接种MSW是有利的。这种菌株包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰的变体：丛毛单胞菌B-9(Comamonas sp B-9)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)、柠檬酸菌FJ581023(Citrobacter sp FJ581023)、纽伦堡潘多拉菌(Pandorea norimbergensis)、无枝酸菌ATCC39116(Amycolatopsis sp ATCC 39116)、Streptomyces viridosporous、红球菌(Rhodococcus jostii)和鞘氨醇单胞菌SYK-6(Sphingobium sp.SYK-6)。参见例如Bandounas等，2011；Bugg等，2011；Chandra等，2011；Chen等，2012；Davis等，2012。根据我们的经验，MSW通常包含相当大量的一般在AD后作为未消化残留物被回收的木质素。
[0104] 在一些实施方案中，用能够产生醋酸盐的细菌菌株接种MSW是有利的，包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰的变体：瘤胃聚乙酸菌(Acetitomaculum ruminis)、Anaerostipes caccae、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、解脂厌氧弧菌(Anaerovibrio lipolytica)、Bacteroides coprosuis、Bacteroides propionicifaciens、溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanolyticus)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、没食子双歧杆菌(Bifidobacterium gallicum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、溶纤维丁酸弧菌
(Butyrivibrio fibrisolvens)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、尿酸发酵梭菌(Clostridium acidurici)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricium)、少纤维二糖梭菌(Clostridium cellobioparum)、Clostridium formicaceticum、溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)、Clostridium lochheadii、甲基戊烯梭菌(Clostridium methylpentosum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、丙酸盐梭菌(Clostridium propionicum)、腐化梭菌(Clostridium putrefaciens)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、破伤风形梭菌(Clostridium tetanomorphum)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、东方脱硫肠状菌
(Desulfotomaculum orientis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、反刍真杆菌(Eubacterium ruminantium)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、多对毛螺菌(Lachnospira multiparus)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、Pelobacter acetylenicus、没食子酸居泥杆菌(Pelobacter acidigallici)、马赛居泥杆菌(Pelobacter massiliensis)、Prevotella ruminocola、费氏丙酸盐杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、Ruminococcus champanellensis、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、Sporomusa
paucivorans、溶淀粉琥珀酸单胞菌(Succinimonas amylolytica)、溶葡聚糖琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolven)、大伴生单胞菌(Syntrophomonas wolfei)、Syntrophus aciditrophicus、Syntrophus gentianae、伯氏螺旋体(Treponema bryantii)和Treponema primitia。
(Butyrivibrio fibrisolvens)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、尿酸发酵梭菌(Clostridium acidurici)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricium)、少纤维二糖梭菌(Clostridium cellobioparum)、Clostridium formicaceticum、溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)、Clostridium lochheadii、甲基戊烯梭菌(Clostridium methylpentosum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、丙酸盐梭菌(Clostridium propionicum)、腐化梭菌(Clostridium putrefaciens)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、破伤风形梭菌(Clostridium tetanomorphum)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、东方脱硫肠状菌
(Desulfotomaculum orientis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、反刍真杆菌(Eubacterium ruminantium)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、多对毛螺菌(Lachnospira multiparus)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、Pelobacter acetylenicus、没食子酸居泥杆菌(Pelobacter acidigallici)、马赛居泥杆菌(Pelobacter massiliensis)、Prevotella ruminocola、费氏丙酸盐杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、Ruminococcus champanellensis、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、Sporomusa
paucivorans、溶淀粉琥珀酸单胞菌(Succinimonas amylolytica)、溶葡聚糖琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolven)、大伴生单胞菌(Syntrophomonas wolfei)、Syntrophus aciditrophicus、Syntrophus gentianae、伯氏螺旋体(Treponema bryantii)和Treponema primitia。
[0105] 在一些实施方案中，用能够产生丁酸盐的细菌菌株接种MSW是有利的，包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰的变体：发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、穗状丁酸弧菌(Butyrivibrio crossotus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、亨氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungatei)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricium)、产纤维二糖梭菌(Clostridium cellobioparum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、无害梭菌(Clostridium innocuum)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、蛋白溶解梭菌(Clostridium
proteoclasticum)、球孢梭菌(Clostridium sporosphaeroides)、共生梭菌(Clostridium symbiosum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、酪丁酸梭菌(Clostridium
tyrobutyricum)、规则粪球菌(Coprococcus eutactus)、陪伴粪球菌(Coprococcus comes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、巴氏真杆菌(Eubacterium barkeri)、两形真杆菌(Eubacterium biforme)、溶纤维真杆菌(Eubacterium cellulosolvens)、圆柱状真杆菌(Eubacterium cylindroides)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、庞大真杆菌(Eubacterium hadrum)、Eubacterium halii、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、念珠状真杆菌(Eubacterium moniliforme)、氧化还原真杆菌(Eubacterium oxidoreducens)、细枝真杆菌(Eubacterium ramulus)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、砂优杆菌(Eubacterium saburreum)、多曲真杆菌(Eubacterium tortuosum)、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、普拉梭杆菌(Fusobacterium prausnitzii)、Peptostreptoccoccus vaginalis、Peptostreptoccoccus tetradius、瘤胃假丁酸弧菌(Pseudobutyrivibrio ruminis)、Pseudobutyrivibrio xylanivorans、盲肠罗斯氏菌(Roseburia cecicola)、肠炎罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)、Roseburia hominis和布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)。
proteoclasticum)、球孢梭菌(Clostridium sporosphaeroides)、共生梭菌(Clostridium symbiosum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、酪丁酸梭菌(Clostridium
tyrobutyricum)、规则粪球菌(Coprococcus eutactus)、陪伴粪球菌(Coprococcus comes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、巴氏真杆菌(Eubacterium barkeri)、两形真杆菌(Eubacterium biforme)、溶纤维真杆菌(Eubacterium cellulosolvens)、圆柱状真杆菌(Eubacterium cylindroides)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、庞大真杆菌(Eubacterium hadrum)、Eubacterium halii、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、念珠状真杆菌(Eubacterium moniliforme)、氧化还原真杆菌(Eubacterium oxidoreducens)、细枝真杆菌(Eubacterium ramulus)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、砂优杆菌(Eubacterium saburreum)、多曲真杆菌(Eubacterium tortuosum)、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、普拉梭杆菌(Fusobacterium prausnitzii)、Peptostreptoccoccus vaginalis、Peptostreptoccoccus tetradius、瘤胃假丁酸弧菌(Pseudobutyrivibrio ruminis)、Pseudobutyrivibrio xylanivorans、盲肠罗斯氏菌(Roseburia cecicola)、肠炎罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)、Roseburia hominis和布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)。
[0106] 在一些实施方案中，用能够产生丙酸盐的细菌菌株接种MSW是有利的，包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰的变体：解脂厌氧弧菌(Anaerovibrio lipolytica)、Bacteroides coprosuis、Bacteroides propionicifaciens、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricium)、甲基戊烯梭菌(Clostridium methylpentosum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、丙酸盐梭菌(Clostridium propionicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、Prevotella ruminocola、费氏丙酸盐杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、Ruminococcus champanellensis、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)和大伴生单胞菌(Syntrophomonas wolfei)。
[0107] 在一些实施方案中，用能够产生乙醇的细菌菌株接种MSW是有利的，包括但不限于以下的任意一种或多种，或其遗传修饰的变体：甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、溶纤维拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanolyticus)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、贝氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricium)、产纤维二糖梭菌(Clostridium cellobioparum)、Clostridium lochheadii、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、热硫化氢梭菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)、热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、多对毛螺菌(Lachnospira multiparus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、浸麻芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、Pelobacter acetylenicus、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、Thermoanaerobacter mathranii、伯氏螺旋体(Treponema bryantii)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
[0108] 在一些实施方案中，不同微生物的组合，任选包括细菌和/或真菌的不同种，可用于实现同时进行的微生物发酵。在一些实施方案中，选择合适的微生物以在预期反应条件下提供所需代谢结果，然后用高剂量水平接种以超过天然存在的菌株。例如，在一些实施方案中，采用同型发酵乳酸产生菌接种可能是有利的，因为它在所产生的生物甲烷底物中能够提供高于异型发酵乳酸产生菌所能提供的最终产甲烷能力。
[0109] 在一些实施方案中，本发明提供一种处理城市固体废物(MSW)的方法，包括以下步骤：
[0110] (i)在35-75℃的温度下提供非水含量为5-40％的MSW，
[0111] (ii)在35-75℃的温度下使MSW的生物可降解部分进行微生物发酵和酶促水解，导致废物的生物可降解部分的部分液化和微生物代谢产物聚集，然后
[0112] (iii)从不可生物降解的固体中分拣废物的液化生物可降解部分以产生特征在于包含溶解的挥发性固体的生物可降解浆料，其中至少25重量％的挥发性固体包含任意组合的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐，任选然后
[0113] (iv)厌氧消化该生物液体以产生生物甲烷。
[0114] 同时存在的酶促水解和微生物发酵进行一段时间之后，以非含水量为10-45％提供的MSW被转化，生物来源或“可发酵”组分变成液化的，且微生物代谢产物在水相中积聚。同时存在的酶促水解和微生物发酵进行一段时间后，废物中液化的可发酵部分与不可发酵的固体分离。液化材料一旦与不可发酵的固体分离，就是我们所说的“生物可降解浆料”。在一些实施方案中，这种生物可降解浆料中至少40％的非水含量包含溶解的挥发性固体，或至少35％、或至少30％、或至少25％。在一些实施方案中，生物可降解浆料中至少25重量％的溶解的挥发性固体包含乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐、和/或丙酸盐的任意组合，或至少30％、或至少35％、或至少40％。在一些实施方案中，至少70重量％的溶解的挥发性固体包含乳酸盐，或至少60％、或至少50％、或至少40％、或至少30％、或至少25％。
[0115] 在一些实施方案中，分离MSW中不可发酵的固体和液化的可降解部分以产生生物可降解浆料，其特征在于包含溶解的挥发性固体，其至少25重量％含有乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意组合，所述分离在酶促水解开始之后进行少于16小时，或少于18小时、或少于20小时、或少于22小时、或少于24小时、或少于30小时、或少于34小时、或少于36小时、或36-48小时、或48-60小时、或60-72小时。
[0116] 废物中液化的可降解部分与不可降解固体的分离可以通过各种手段实现。在一些实施方案中，这可采用至少两种不同的分离操作的任意组合来实现，包括但不限于螺旋压力机操作、弹道分离器操作、振动筛操作或其它本领域已知的分离操作。在一些实施方案中，与废物中生物可降解部分分离的不可降解固体平均包含至少约20％干重的经处理MSW，或至少25％、或至少30％。在一些实施方案中，与经处理废物中可降解部分分离的不可降解固体平均包含至少20％干重的可回收材料，或至少25％、或至少30％、或至少35％。在一些实施方案中，通过至少两种分离操作的分离产生的生物可降解的浆料含有至少0.15kg挥发性固体/kg处理的MSW或至少0.10。本领域技术人员将容易地理解MSW中固有的生物来源组成是可变的。尽管如此，0.15kg挥发性固体/kg处理的MSW的数据反映了典型的未分拣MSW中生物来源材料至少80％干重的总捕获。每kg处理的MSW生物可降解的浆料中捕获的挥发性固体kg的计算可以在测定总产量和处理的总MSW的一段时间内估计。对于给定时期，所获得的生物来源的浆料的平均产量可以计算为＝kg浆料/H；MSW的平均生产率计算为＝kg MSW/H；分析浆料的平均VS含量且结果表示为总质量的VS％；kg VS计算为kg浆料/H*VS％＝kg VS/H；则kg VS/H/kg MSW/H＝kg VS/kg MSW。
[0117] 在一些实施方案中，在完成MSW中不可降解固体和液化的可发酵部分的分离以产生生物可降解的浆料之后，该浆料可在不同条件包括不同温度或pH下进行后发酵。
[0118] 如本文所用的术语“溶解的挥发性固体”是指如下计算的简单测量：将50ml离心管中的生物可降解的浆料样品在6900g离心10分钟以产生沉淀和上清液。倒出上清液，沉淀的湿重以占最初液体样品总重量的百分比表示。上清液样品在60℃干燥48小时以测定干物质含量。从干物质测量中减去550℃熔炉燃烧后残留的灰来测定上清液样品中挥发性固体的含量，并作为溶解的挥发性固体以质量百分比％表示。60℃干燥48小时以测定沉淀中干物质含量。通过从干物质测量中减去550℃熔炉燃烧后残留的灰来测定上清液样品的挥发性固体含量，并表示为溶解的挥发性固体的质量百分比％。通过在60℃干燥48小时来测定沉淀的干物质含量。的沉淀的液体部分(1-沉淀的干物质)表示为沉淀的质量百分比。估计沉淀的液体部分的组成类似于上清液。因此样品中溶解的挥发性固体的总量是上清液中溶解的挥发性固体和(沉淀中液体部分的质量百分比)x(上清液中溶解的挥发性固体)之和。
[0119] 在一些实施方案中，本发明提供用于生物甲烷生产的组合物和方法。关于处理MSW的方法的实施方案的之前详细讨论，包括涉及所获得的生物可降解浆料的组成特征的细节，可任选应用于提供用于生物甲烷生产的方法和组合物的实施方案。在一些实施方式中，任何涉及所获得的生物可降解浆料的组成特征的细节可通过以下方法来获得：将经过微生物发酵的未分拣的MSW进行不可降解固体的分离以产生生物可降解浆料，然后所述浆料在35-75℃、或40-55℃、或45-50℃的温度范围，4.2-6.0的pH范围下连续发酵1-72小时。在一些实施方式中，该连续发酵以如下方式补充：可以将通过筛子或其他系统回收的生物可降解材料(这种材料在技术上不是初始回收的生物可降解浆料的一部分)添加至浆料。
[0120] 厌氧消化中涉及的微生物群落的代谢动力学非常复杂。参见Supaphol等，2010；Morita和Sasaki 2012；Chandra等，2012。在典型的生产甲烷生物气体的厌氧消化(AD)中，由微生物介导的生物过程完成四个主要的步骤-将生物大分子水解为构成单体或其他代谢物；酸化，其中产生短链烃酸和醇；乙酸化，其中将可用的营养物异化为乙酸、氢和二氧化碳；和甲烷化，其中乙酸和氢通过专用的古细菌异化为甲烷和二氧化碳。水解步骤通常是限速的。参见Delgenes等，2000；Angelidaki等，2006；Cysneiros等2011。
[0121] 因此，通过某种形式的预处理提前水解来制备生物甲烷生产的底物是有利的。在一些实施方案中，本发明方法结合了MSW的微生物发酵和酶促水解，这不仅作为最终生物甲烷生产的快速生物预处理，也作为从未分拣MSW中分拣可降解有机组分的方法。
[0122] 用含有MSW中源分类的有机组分的固体生物甲烷底物进行的生物预处理已有报导。参见Fdez-Guelfo等，2012；Fdez-Guelfo等，2011A；Fdez-Guelfo等，2011B；Ge等，2010；Lv等，2010；Borghi等，1999。厌氧消化中最终甲烷产量的提高被报道为复杂生物聚合物的降解增加和挥发性固体的溶解增加的结果。然而，通过这些之前报导的方法实现的挥发性固体的溶解水平和其转化成挥发性脂肪酸的水平甚至不接近本发明方法所实现的水平。例如，Fdez-Guelfo等，2011A报道了通过对MSW中预分拣的有机部分的各种生物预处理实现挥发性固体溶解度的10-50％的相对提高，这对应于挥发性固体的7-10％的最终绝对溶解水平。相比之下，本发明的方法生产的液体生物甲烷底物包含至少40％溶解的挥发性固体。
[0123] 也报道过两阶段厌氧消化系统，其中第一阶段过程水解生物甲烷底物，其包括MSW中源分拣的有机组分和其他特定生物来源的底物。在通常是嗜热的第一厌氧阶段，高链聚合物降解产生挥发性脂肪酸。随后是在物理上分离的反应器中进行第二阶段厌氧阶段，其中甲烷化和乙酸化占主导地位。所报道的两阶段厌氧消化系统通常使用源分拣的、特定的、总固体少于7％的生物来源底物。参见Supaphol等，2011；Kim等，2011；Lv等，2010；Riau等，2010；Kim等，2004；Schmit和Ellis 2000；Lafitte-Trouque和Forster 2000；Dugba和Zhang
1999；Kaiser等，1995；Harris和Dague 1993。最近，报道了一些两阶段AD系统，其使用源分拣的、特定的、总固体高达10％的生物来源底物。参见Yu等，2012；Lee等，2010；Zhang等，
2007。当然，没有任何报道过的两阶段厌氧消化系统预期使用未分拣MSW作为底物，更不用说用来生产高固体的液体生物甲烷底物。两阶段厌氧消化是为了转化固体底物，向第一阶段反应器中持续送入额外的固体，并从一阶段反应器中持续去除挥发性脂肪酸。
1999；Kaiser等，1995；Harris和Dague 1993。最近，报道了一些两阶段AD系统，其使用源分拣的、特定的、总固体高达10％的生物来源底物。参见Yu等，2012；Lee等，2010；Zhang等，
2007。当然，没有任何报道过的两阶段厌氧消化系统预期使用未分拣MSW作为底物，更不用说用来生产高固体的液体生物甲烷底物。两阶段厌氧消化是为了转化固体底物，向第一阶段反应器中持续送入额外的固体，并从一阶段反应器中持续去除挥发性脂肪酸。
[0124] 在一些实施方案中，产生生物甲烷的方法包括以下步骤：
[0125] (i)提供通过微生物发酵预处理的液体生物甲烷底物，使得至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，所述溶解的挥发性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意组合，
[0126] (ii)将该液体底物转移到厌氧消化系统中，然后
[0127] (iii)进行该液体底物的厌氧消化以产生生物甲烷。
[0128] 在一些实施方案中，本发明提供通过微生物发酵和水解城市固体废物(MSW)或预处理的木质纤维素生物质产生的液体生物甲烷底物，所述生物甲烷底物包含经酶促水解和微生物发酵的MSW，或包含经酶促水解和微生物发酵的预处理的木质纤维素生物质，其特征在于
[0129] -至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，该溶解的挥发性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意组合。
[0130] 在一些实施方案中，本发明提供通过微生物发酵和水解城市固体废物(MSW)产生的有机液体生物气体底物，其特征在于
[0131] -至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，该溶解的挥发性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意组合。
[0132] 在一些实施方案中，本发明提供产生生物气体的方法，包括以下步骤：
[0133] (i)提供通过微生物发酵预处理的液体生物气体底物，使得至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，所述溶解的挥发性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意组合，
[0134] (ii)将该液体底物转移到厌氧消化系统中，然后
[0135] (iii)进行该液体底物的厌氧消化以产生生物甲烷。
[0136] 如本文所用，术语“厌氧消化系统”是指包含在控制的通风条件下操作的一个或多个反应器的发酵系统，其中甲烷气体在构成该系统的每个反应器中产生。产生甲烷气体的程度是在“厌氧消化系统”中发酵混合物的水相中代谢产生的溶解甲烷的浓度在所用条件下是饱和的，且甲烷气体从该系统中释放。
[0137] 在一些实施方案中，“厌氧消化系统”是固定的过滤系统。“固定的过滤厌氧消化系统”是指将厌氧消化群体固定在(任选在生物膜内)物理支持基质上的系统。
[0138] 在一些实施方案中，液体生物甲烷底物包含至少8重量％总固体、或至少9％总固体、或至少10％总固体、或至少11％总固体、或至少12％总固体、或至少13％总固体。如本文所用的“总固体”是指可溶的和不可溶的固体两者，且事实上是指“非水含量”。总固体通过在60℃干燥直到获得恒定重量来测量。
[0139] 在一些实施方案中，MSW的微生物发酵在抑制产甲烷菌产生甲烷的条件下进行，例如，pH为6.0或更低、或pH小于5.8、或pH小于5.6、或pH小于5.5。在一些实施方案中，液体生物甲烷底物包含小于饱和浓度的溶解甲烷。在一些实施方案中，液体生物甲烷底物包含小于15mg/L溶解甲烷，或小于10mg/L、或小于5mg/L。
[0140] 在一些实施方案中，在厌氧消化产生生物甲烷前，通过蒸馏、过滤、电渗析、特异性结合、沉淀或本领域已知的其他方法从液体生物甲烷底物中除去溶解的挥发性固体的一种或多种组分。在一些实施方案中，在厌氧消化产生生物甲烷前从液体生物甲烷底物中除去乙醇或乳酸盐。
[0141] 在一些实施方案中，将固体底物如MSW或来自预处理木质纤维素生物质的纤维部分同时进行酶促水解和微生物发酵以产生通过过微生物发酵预处理的液体生物甲烷底物，使得至少40重量％的非水含量以溶解的挥发性固体存在，所述溶解的挥发性固体包含至少25重量％的乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、乳酸盐和/或丙酸盐的任意组合。在一些实施方案中，具有上述性质的液体生物甲烷底物通过热压器过程同时进行酶促水解和微生物发酵从未分拣MSW获得的液化的有机材料产生。在一些实施方案中，预处理的木质纤维素生物质与酶促水解和生物发酵的MSW混合，任选以这样的方式以使MSW衍生的生物液体的酶活性为木质纤维素底物的水解提供酶活性以产生来源于MSW和预处理的木质纤维素生物质两者的复合液体生物甲烷底物。
[0142] “软木质纤维素生物质”是指除了含有纤维素、半纤维素和木质素的木材的植物生物质。可以采用任何合适的软木质纤维素生物质，包括例如至少小麦秸秆、玉米秸秆、玉米棒、空果串、水稻秸秆、燕麦秸秆、大麦秸秆、油菜秸秆、黑麦秸秆、高粱、甜高粱、大豆秸秆、柳枝稷、百慕大群岛草和其它草、甘蔗渣、甜菜浆、玉米纤维或其任意组合的生物质。木质纤维素生物质包括其他的木质纤维素材料例如纸张、新闻用纸、纸板、或其他城市或办公废物。木质纤维素生物质可作为来源于不同原料的材料的混合物使用，可以是新鲜的、部分干燥的、完全干燥的或其任意组合。在一些实施方案中，本发明的方法使用至少约10kg生物质原料来实施，或至少100kg、或至少500kg。
[0143] 在进行酶促水解和微生物预处理之前，木质纤维素生物质一般应用本领域已知的方法预处理。在一些实施方案中，生物质通过水热预处理。“水热预处理”是指利用水，以包含高温液体或蒸汽或两者的热的液体、蒸汽或高压蒸汽的形式，在120℃或更高的温度下，添加或者不添加酸或其他化学物质的情况下“煮”生物质。在一些实施方案中，木质纤维素生物质原料通过自发水解预处理。“自发水解”是指在预处理期间通过半纤维素水解释放的乙酸进一步催化半纤维素水解的预处理过程，且应用于任何在pH3.5-9.0进行的木质纤维素生物质水热预处理。
[0144] 在一些实施方案中，经水热预处理的木质纤维素生物质分为液体部分和固体部分。“固体部分”和“液体部分”是指在固/液分离中经预处理的生物质的分馏。分离的液体统称为“液体部分”。含有相当大量的不溶性固体含量的残余部分称为“固体部分”。固体部分或液体部分或两者的组合可用于实施本发明的方法或生产本发明的组合物。在一些实施方案中，固体部分可被洗涤。
[0145] 实施例1.不用分离的酶制剂补充纤维素酶活性下通过MSW的微生物水解和发酵获得的生物来源的浆料中生物可降解的捕获
[0146] 在丹麦哥本哈根阿玛加尔资源中心(ARC)的REnescience示范工厂进行实验。图1显示工厂主要特征的示意图。ARC REnescience废物冶炼厂的概念是将MSW分拣成四种产品。适于生物甲烷生产或其他过程的生物来源的浆料、、用于回收的惰性物质(玻璃和沙)和适于RDF生产或回收金属、塑料和树木的无机材料的2D以及3D部分。
[0147] 用塑料袋原样收集来自大城市的MSW。将MSW运送到REnescience废物冶炼厂并储存于筒仓中直至加工。根据MSW的特征，在REnescience系统前可以安装分拣步骤以去除过大的颗粒(大于500mm)。
[0148] 如图1所示，将未分拣的MSW流加热且其非水含量通过添加热的水性溶液来调节。在REnescience工艺的之前版本中，我们依赖分离的酶制剂提供的纤维素酶活性来促进生物可降解组分的快速降解。我们之前在适当的非水含量向热的废物添加分离的酶制剂。然后之前将添加了酶的废物在类似于WO2011/032557描述的称为“酶反应器”中孵育，所述反应器的特征在于在基本上水平的轴上旋转的腔室，其内表面配备有形成螺旋阵列的附加装置，将MSW从输入端连续移动至输出端。取决于反应器填充的程度，和取决于反应器的尺寸，可以控制MSW在反应器内的平均“停留时间”。反应器可以配备有加热元件，这样可以保持适当的温度。
[0149] 当将MSW连续引入反应器中并从反应器中连续去除部分降解的MSW时，获得某一平均停留时间。然后将从反应器中去除的部分降解的MSW进行两个不同的分离步骤。首先，使用具有40mm筛子的弹道分离器以产生生物来源的浆料流，以及3D不可降解的级分和2D不可降解的级分。其次，2D不可降解的级分可以利用螺旋压榨机进一步进行脱水，其中回收的额外的生物来源浆料又与从弹道分离器步骤获得的浆料混合。
[0150] 然后所得生物来源的浆料可以利用两个振动筛进行进一步“精细”分离，第一个具有8mm筛子，其主要分出不可降解的污染物。第二个具有3mm筛子的振动筛通常分出较大的包含大量生物可降解材料的纤维。通过3mm筛子后，将所得生物来源的浆料储存在配备有装料槽的大槽中，允许精确记录给定时期内所得生物来源的浆料的质量。
[0151] 然后将脱水的固体2D级分进行逆流洗涤事件以清洁2D级分并回收否则将损失的额外的生物可降解材料。然后在桶中将脱水的固体2D级分进行两阶段逆流洗涤事件以清洁2D级分并回收否则将损失的额外的生物可降解的材料。细节提供于图1，其显示系统中的水流。可用淡水在简单的桶中洗涤从弹道分离器回收的3D不可降解材料。然后该洗涤水可用作“清洁”水，其输入两个相同洗涤装置的第二个以提供逆流洗涤：“清洁”新水遭遇“最清洁”废物，同时将更脏的水连续应用于引入的“较脏的”废物。洗涤事件如下工作：脏的2D级分进入第一洗涤装置中的桶，其中废物与逆流洗涤水混合并机械混合。此外，脏的洗涤水可以用.04-.08mm的筛子进行筛过滤以去除通常主要包含生物可降解材料的纤维。砂和重材料也可通过沉降和通过各洗涤装置底部的螺旋输送机去除。去除的级分通常主要是砂/玻璃/重塑料/和其他无机物。第一次洗涤之后，通过螺旋钻将废物移至与第一洗涤装置相同的第二洗涤装置中。来自第一洗涤装置的洗涤水通常具有1–4重量％的TS，而来自第二洗涤装置的洗涤水通常具有0.5–3.0重量％的TS。
[0152] 包含从MSW以及相关微生物回收的一些生物可降解材料的洗涤水可以储存在“缓冲”槽中。然后来自该“缓冲”槽的水溶液之前用于调节引入的MSW的非水含量。之前我们通常首先通过应用蒸汽加热来自“缓冲”槽的溶液，然后将加热溶液与引入的MSW混合以将其同时加热至适当的温度以及调节非水含量。
[0153] 如该实施例1随后呈现的实施例中所解释，我们之前确定接种由再循环的洗涤水提供的引入的MSW增强利用分离的纤维素酶制剂在酶促水解的帮助下获得的所谓生物可降解的捕获。“生物可降解的捕获”是指生物来源的浆料中捕获的挥发性固体的质量，其通常表示为kg VS(挥发性固体)/kg经处理的MSW。
[0154] 在该实验中，我们设法测试如果我们不应用任何分离的酶制剂，而仅应用天然存在于MSW中的微生物接种物，生物可降解的捕获将如何有效，从而实现通过微生物水解和发酵的快速降解。
[0155] 为此目的，我们安装了“缓冲”槽，从所述槽中抽出再循环洗涤水溶液以调节引入的MSW的非水含量，所述槽具有热交换器系统以用作温度保持45℃的发酵罐，从而促进细菌生长。“缓冲”槽配备有有效的搅拌系统，其包含配备有附着于轮轴的两组翼片的中心设置的垂直轮轴。两组翼片达到三分之二的槽直径并附着于相当于从槽底部的四分之一距离和从槽底部的四分之三距离的轮轴高度。为避免以可能损害微生物的方式加热从缓冲槽/发酵罐中抽出的“接种物”，我们使用与应用分离的酶制剂时所使用的常规程序不同的程序来加热引入的MSW。
[0156] 该实施例中记录的十七(17)天的试验分成如表2所示的五个部分。
[0157] 表2.微生物水解和发酵试验的时程
[0158]
[0159] 将从丹麦哥本哈根获得的未分拣的MSW连续装载到REnescience示范工厂。所使用的分离的酶制剂是优化用于转化木质纤维素生物量的可商购的纤维素酶制剂并由NOVOZYMESTM以商品名CELLIC CTEC 3TM提供。对于使用分离的纤维素酶制剂的时期，为每公斤引入的MSW添加相当于9g酶制剂的量(0.9重量％)。
[0160] 其中添加商业酶制剂的两个时期的操作设定如下：
[0161] -将进入的MSW流以280kg MSW/h的速度引入酶反应器；
[0163] -以相当于约670FPU的纤维素酶活性/L润湿的MSW的水含量的0.9重量％将CTEC 3TM引入进入的MSW流；
[0164] -在约50℃运转酶反应器以实现约18小时的平均停留时间，其中用CaCO3将pH调节至4.5–5。
[0165] 在“保持”时期期间，停止反应器。在该时期结束时，从酶反应器中去除约2000kg内容物，然后进行“不含酶”时期的连续操作。
[0166] 称为“上升时间”的不含酶时期是指其中剩余CTEC3从系统中去除的时期。
[0167] 不含酶时期(即“上升时间”和“仅微生物发酵”)的操作设定如下：
[0168] -将进入的MSW流以130kg MSW/h的速度引入酶反应器/微生物发酵罐；
[0169] -通过添加包含从缓冲槽/发酵罐抽出的再循环洗涤水溶液的接种物调节引入的MSW流的非水含量，所述接种物保持在45℃并用上述以约30rpm运转的搅拌器连续搅拌，所述接种物中已添加底物以促进细菌生长和纤维素酶表达，包括约1重量％的酵母提取物、约1重量％的混合的葡萄糖/蔗糖和约1重量％的微晶纤维素(商品名AVICELTM)。以260L水/h的速度通过保持在约45℃的热水器抽出该“接种物”；
[0170] 在约45℃运转酶反应器/微生物发酵罐(注意解释停留时间)以实现约36小时的平均停留时间，其中用CaCO3将pH调节至4.5-5。
[0172] -通过称为"EC12B"的3mm筛子后获得的生物来源的浆料；
[0173] -8mm筛子保留的材料；
[0174] -3mm筛子保留的材料；
[0175] -应用于洗涤水的纤维筛子1保留的材料；
[0176] -应用于洗涤水的纤维筛子2保留的材料；
[0177] -清洗纤维筛子后取样的洗涤水；
[0178] -2D不可降解的级分；
[0179] -3D不可降解的级分；
[0180] -来自两个洗涤装置的惰性底部级分。
[0181] 用储存槽上的装料槽测量生物来源的浆料的产量。淡水输入流用流量计测量。其他级分以可以计算在内的任何给定时期的总质量流的方式在天平上单独称重。
[0182] 为分析内容物的目的，还在选定时间点从EC12B、从缓冲槽/发酵罐和从酶反应器/微生物发酵反应器获得样品。煮沸这些样品以停止微生物和酶活性。
[0183] 图2显示微生物代谢物乳酸盐、醋酸盐和乙醇之和，表示为在不同的时间点获得的生物来源的浆料样品中克/升的浓度。如同所示，在添加纤维素酶活性的第一个时期期间，在1-153小时，微生物代谢物的水平逐渐上升直到在约35g/L时变成相对稳定。在仅用微生物发酵时期期间，在250-319小时，代谢物水平稍微有点低，但稳定在约27-30g/L。在添加纤维素酶活性的第二个时期期间，在319-390小时，代谢物水平似乎相对于添加纤维素酶活性的第一个时期增加至35-40g/L。
[0184] 一方面，这些结果表明，包括一些用微生物发酵补充的纤维素酶活性可能是有利的。另一方面，这些结果也表明所使用的接种物足以促进仅使用微生物发酵的MSW的快速降解。
[0185] 图3显示不同时期的以kg TS(总固体)/kg MSW表示的生物可降解的捕获。通常有机捕获根据挥发性固体(VS)来测定。取得这些样品，结果可以提交后提供。这里呈现TS方面的结果，包括灰含量。
[0186] 图3(A)显示通过称为"EC12B"的3mm筛子后获得的生物来源的浆料样品中以kg TS/kg MSW表示的生物可降解的捕获。对于给定时期，通过称为"EC12B"的3mm筛子后获得的生物来源浆料的平均产量可以计算为＝kg浆料/H；MSW的平均生产率计算为＝kg MSW/H；分析浆料的平均VS含量且结果表示为总质量的VS％；kg VS计算为kg浆料/H*VS％＝kg VS/H；则kg VS/H/kg MSW/H＝kg VS/kg MSW。在仅用微生物发酵时期期间，在250-319小时，校正附图以便不计数添加至缓冲槽/发酵罐的专用底物质量。如同所示，在添加纤维素酶活性的第一个时期期间，在1-153小时，通过3mm筛子后获得的生物来源浆料中生物可降解的捕获水平为约0.21-0.25kg TS/kg MSW。在仅用微生物发酵时期期间，在250-319小时，通过3mm筛子后获得的生物来源浆料中“有机捕获”水平明显减少至约0.10到0.15kg TS/kg MSW。在添加纤维素酶活性的第二个时期期间，在319-390小时，通过3mm筛子后获得的生物来源浆料中生物可降解的捕获水平类似于添加纤维素酶活性的第一个时期，为约0.21-0.25kg TS/kg MSW。
[0187] 图3(B)显示以kg TS/kg MSW表示的“总生物可降解的捕获”，其合并通过称为"EC12B"的3mm筛子后获得的生物来源的浆料样品中获得的TS以及通过3mm筛子和通过应用于洗涤水的纤维筛子1和2保留的纤维级分中获得的TS。在仅用微生物发酵时期期间，在250-319小时，校正附图以便不计数添加至缓冲槽/发酵罐的专用底物质量。如同所示，在添加纤维素酶活性的第一个时期期间，在1-153小时，“总生物可降解的捕获”仅略高于液体中的生物可降解捕获。在仅用微生物发酵时期期间，在250-319小时，“总生物可降解的捕获”较之仅液体中的生物可降解捕获极大增加，至与添加纤维素酶活性实现的基本上相同的水平。在添加纤维素酶活性的第二个时期期间，在319-390小时，“总生物可降解的捕获”类似于添加纤维素酶活性的第一个时期所观察到的。
[0188] 这些结果表明，尽管在分离不可降解的固体之前，在短的停留时间期间添加的纤维素酶活性明显促进MSW的更加完全的降解，仅微生物发酵可以在类似的短的停留时间期间提供足够的MSW降解，以允许基本上相等的MSW的生物分拣中“生物可降解的捕获”。
[0189] 分离不可降解的固体之后，利用添加的商业纤维素酶活性获得的生物来源的浆料不保留太多活性，这是尤其重要的。这种效果可能起因于与已“收获”并以CTEC3TM提供的遗传工程改造的分泌产品相比，通过现实生活中的活生物分泌的活性的情况下纤维素酶催化的方式基本上不同。示范工厂之前的试验中，我们检查了上述的各种级分，尝试鉴定添加的商业纤维素酶活性的命运。通过称为"EC12B"的3mm筛子后获得的生物来源的浆料中观察到的纤维素酶活性(FPU)水平通常比在分离不可降解的材料之前酶反应器中观察到的那些低0.5％。
[0190] 相反，可以预期仅用微生物发酵获得的生物来源的浆料保留非常高水平的微生物来源的纤维素酶活性，达到这样的程度以至于它保留高水平的活细胞。
[0191] 因此，与依赖CTEC3TM的降解相反，微生物发酵允许在生物甲烷生产或其他用途之前的生物来源浆料的简单方便的后发酵。在后发酵中，将通过各种筛子保留的“生物可降解的捕获”与生物来源的浆料混合并允许在适当的温度继续发酵。
[0192] 分析在微生物发酵期间在选定时间点获得的生物来源的浆料样品中的溶解固体。从干物质测量中减去550℃熔炉燃烧后残留的灰来测定上清液样品中挥发性固体的含量，并作为溶解的挥发性固体以质量百分比％表示。60℃干燥48小时以测定沉淀中的干物质含量。沉淀的液体部分(1-沉淀的干物质)表示为沉淀的质量百分比。估计沉淀的液体部分的组成类似于上清液。因此样品中溶解的挥发性固体的总量是上清液中溶解的挥发性固体和(沉淀中液体部分的质量百分比)x(上清液中溶解的挥发性固体)之和。分析的结果显示于表3。乳酸盐、醋酸盐和乙醇浓度显示为总重量％。
[0193] 表3.生物来源的浆料的分析
[0194]
[0195] 如同所示，作为总挥发性固体的百分比，仅采用微生物发酵获得的生物来源的浆料中溶解固体含量始终为40-50％。这表明仅微生物发酵足以基本上降解MSW以使生物可降解的含量容易用例如本文所述的生物分拣操作回收。上述所得的浆料在微生物发酵期间的所有时期均是可泵抽的。
[0196] 实施例2.微生物来源的纤维素酶活性和其他通过微生物接种物表达的MSW降解活性的表征
[0197] 在实施例1所述的试验期间，在245小时抽出来自缓冲槽/发酵槽(微生物接种物)的液体样品。尽管在完全洗掉残留的CTEC3活性之前略微取出该样品，在该点上以最坏的情况估计缓冲槽/发酵罐中残留的CTEC活性不可能大于8FPU/L。从抽出样品的时间直到开始实验，过去5.5小时。将20ml微生物接种物添加至1g干燥底物。底物是来自100％新纸浆(LOMELETTERTM)，即来自典型废物和完全典型废物的纤维素级分的棉纸。典型废物采用新鲜产品制备以包含城市固体废物的“有机”级分(定义为纤维素、动物和植物级分)(如基于Riber等.2009的Jensen等,2010所制备)。完全典型废物的组成如下：
[0198]
[0200] 将典型废物以等分试样储存于-20℃并在4℃解冻过夜。典型废物的干物质含量为28.4％(添加3.52g典型废物以产生1g干物质(DM))。此外，对于每种底物，以32mg/g干物质的剂量将CELLIC CTEC3TM(VDNI0009,NOVOZYMES A/S,Bagsvaerd,Denmark)(CTec3)应用于底物中，以与通过微生物接种物获得的水解程度相比。
[0201] CTEC3的纤维素酶活性通过Ghose,T.K.,Measurement of cellulase activities.Pure&Appl.Chem.,1987.59(2):p.257-268报道的方法预先测量，发现为
179FPU/g酶制剂。因此用于这些实验的剂量对应于约5.7FPU/g DM或以反应体积表示，为约
286FPU/L。
179FPU/g酶制剂。因此用于这些实验的剂量对应于约5.7FPU/g DM或以反应体积表示，为约
286FPU/L。
[0202] 为了在添加CTEC3的反应期间将pH调节并保持为5，应用乙酸钠缓冲液(0.05M)来将总体积补足到20g。各反应进行三次，且各底物的一次反应与仅添加缓冲液同时孵育(底物空白)。
[0203] 在置于设置为45℃的加热箱(Binder,GmBH,Tuttlingen,Germany)中的Stuart旋转器SB3(以4RPM转动)上孵育反应24小时。然后从孵卵器移除管并拍照。由于样品的物理结构似乎部分溶解，用手剧烈振摇管约2秒并再次拍照。
[0204] 然后在4℃将管以1350g离心10分钟。然后倾倒上清液，将上清液和沉淀在60℃加热箱中干燥2天。记录干燥材料的重量并用于计算干物质的分布。基于这些数字计算样品中干物质的转化率。作为对照，在不含底物的情况下孵育微生物接种物的样品(干物质含量为4.54％±0.06)以评价固体的背景释放(33.9％±0.8)。来自通过微生物接种物添加的底物的固体转化率通过从微生物接种物本身中减去固体对液体级分的贡献来校正。这些样品中相对高的背景可能过高估计了包含添加底物的样品中观察到的背景。该高背景可能包括在实验期间不存在额外的食物源的情况下恢复可溶形式的细胞块的相当大的贡献，与活生物形式相反，其容易在这些实验条件下沉淀。对于所有底物，添加微生物接种物导致高于固体的背景释放的固体释放，表明通过微生物接种物部分水解底物。
[0205] 图4显示纤维素底物和典型MSW通过微生物接种物在CTEC3辅助下的对比降解。如同所示，在清洁的纤维素底物例如棉纸的情况下，在给定的剂量水平，CTEC3明显提供更广泛的降解。将棉纸的对比降解用作纤维素酶活性的估计，微生物接种物显示的活性是通过CTEC3显示的活性的大约1/6。因此在24小时的孵育时间框内，通过微生物接种物表达的微生物来源的纤维素酶活性可估计为(1/6)*(286FPU/L)或约48FPU/L。
[0206] 应注意其中提供微生物来源的纤维素酶活性的精确机制是未知的。不希望被理论束缚，在我们看来与底物接触以对于供体生物是有效的“局部”和在孵育期间有效形成的方式诱导纤维素酶活性的表达。在这是正确的程度上，微生物来源的纤维素酶活性主要将“跟随”活细胞。
[0207] 也表明CTEC3样品提供典型MSW的更广泛的降解。然而，这里，底物空白降解是高的，提示一些微生物活性也可能对CTEC3降解有贡献。
[0208] 讽刺的是，尽管以FPU/L表示的纤维素酶活性本身的水平低得多，微生物接种物实现了与利用CTEC3获得的水平相当的典型MSW的纤维素级分的降解水平。
[0209] 图5显示振摇向其添加典型MSW的纤维素级分作为底物的三个管后拍摄的照片，显示在孵育结束时的对比外观。如同所示，在比较CTEC3和接种物样品时纤维素级分的降解确实大致相当。参见Schmidt和Padukone 1997，之前已经报道在利用分离的纤维素酶制剂同时水解的乳酸发酵中，水平高达25FPU/g DM的常见纤维素酶活性消化光纸印刷的杂志纸张和其他涂层纸以及新闻纸的效率小于其消化清洁纸的一半。这里显示的结果提示除纤维素酶活性之外的一些酶活性可以通过微生物接种物或其有助于降解典型MSW的纤维素级分的后代表达。
[0210] 实施例3.LAB细菌数的表征
[0211] 在实施例1所述的试验期间，在235到319小时期间的多个时间点去除来自缓冲槽/发酵槽(微生物接种物)的样品和通过称为"EC12B"的3mm筛子后获得的生物来源的浆料样品。
[0212] 移除来自样品的等分样品并通过在室温下干燥(以避免损害DNA含量)来测定干物质含量。在50ml管中获得未解冻样品，然后用添加的50重量％甘油来冷冻。
[0213] 通过定量PCR(qPCR)测定细胞计数。将5ml甘油悬浮的细胞悬浮于5ml灭菌过滤的H2O中。在过滤器上过滤等分试样并测定固体浓度。利用FastDNATM试剂盒(MP BIOMEDICALSTM)从过滤的细胞块中提取DNA。提取DNA中的16S rRNA基因拷贝数通过qPCR分析用通用的16S rRNA基因引物来定量。该方法仅量化细菌而不量化古菌。假定平均3.0拷贝数的16S rRNA基因/活细胞，基于这些数据计算细菌细胞数。然后将计算的细菌细胞数与样品中干物质(总固体)浓度相关。计算的CFU/g DM用于估计CFU/L，其中在该时期期间微生物接种物平均为3.95重量％DM，和其中生物来源的浆料平均为11.98重量％DM。
[0214] 样品的细菌数/g干物质连同CFU/L的估计数一起显示于表4。
[0215] 表4.微生物接种物和生物来源的浆料中的活细菌数
[0216]
[0217] 这些结果明清楚表明活细菌细胞跟随生物来源的浆料。因此，可预期生物来源的浆料本身可以为通过各种筛子收集的生物可降解的纤维的后发酵以及为在最初分离不可降解的固体时浆料中保留的不溶解固体提供有效的接种物并将提供微生物来源的纤维素酶活性。
[0218] 这些结果表明通过细菌接种物诱导的微生物水解和发酵导致水解和发酵期间相对稳定的生长以及预期所获得的生物来源的浆料可以为具有在各种筛子上回收的纤维的后发酵提供适当的接种物。
[0219] 通常预期LAB将包含主要比例的当MSW仅在37-50℃温度下孵育时进化的微生物群。参见例如Akao等，2007a；Akao等，2007b；Sakai等，2000；Sakai等，2004。可以在乳酸发酵典型厨房废物约12小时内常规获得约1.0x 10^10CFU/L的活的LAB细菌数，无需添加酶活性。参见Sakai等，2000和Sakai等，2004。在实施例3随后呈现的实施例中鉴定的乳酸菌的传代加倍时间为约4到5小时。参见Liong和Shaw 2005。
[0220] 代表乳酸菌的样品中的活细菌比例可以从实施例4描述的16s RNA测量来明确测定。然而，这些结果将在提交后获得。在涉及用再循环洗涤水接种引入的MSW的REnescience示范工厂的所有之前的实验性试验中，当样品用甘油适当地冷冻以保护生物时，乳酸菌种作为优势菌出现，总是包含大于90％的来自酶反应器/微生物发酵反应器和来自生物来源的浆料样品中检测的总生物。因此，当我们估计乳酸菌种(其可能不是唯一存在的LAB)包含至少90％的活细胞，在水解和发酵期间，实施例1中的酶反应器/微生物发酵反应器内水相中的LAB水平保持为至少2.1x 10^10CFU/L。
[0221] 实施例4.在实施例1中提供水解和发酵的微生物的鉴定
[0222] 在测试中，、在添加CTEC3的第一个时期期间的101和125小时、在“不含CTEC3的上升时间”结束时的245小时、在仅用微生物发酵期间的269小时，和在添加CTEC3的第二时期期间的341和365小时取出通过称为"EC12B"的8mm筛子后获得的生物来源的浆料样品和来自称为"EA02"的缓冲槽/发酵罐的液体(微生物接种物)样品以及来自热水器"LB01"的样品。
[0223] 将该液体样品在20％甘油中冷冻，并储存于-20℃以便进行16S rDNA分析，从而鉴定微生物。该分析是本领域众所周知的，且广泛应用于基于核糖体小亚基的16S组件的原核生物的鉴定和系统发育分析。将干冰上的冷冻样品运送至进行16S rDNA分析(GATC_Biotech)的GATC Biotech AB,Solna,SE。
[0224] 该分析包括 ：提取基因组DNA ，用跨越高变区域V1到V3(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/534R:ATTACCGCGGCTGCTGG；507bp长)的通用引物对制备扩增文库，用GS FLX适配子PCR标记，在基因组测序仪FLX仪器上测序以获得每个样品104.000-
160.000的读取数。然后将所得序列在来自核糖体数据库项目(Cole等，2009)的rDNA数据库中用BlastN进行查询。该数据库包含长度为至少1200bp的高质量序列以及NCBI分类关系。
目前的版本(RDP版本10，2012年9月19日更新)包含9162种细菌和375种古细菌序列。过滤BLAST结果以去除短和低质量的点击(序列一致性≥90％，对比覆盖率≥90％)。
160.000的读取数。然后将所得序列在来自核糖体数据库项目(Cole等，2009)的rDNA数据库中用BlastN进行查询。该数据库包含长度为至少1200bp的高质量序列以及NCBI分类关系。
目前的版本(RDP版本10，2012年9月19日更新)包含9162种细菌和375种古细菌序列。过滤BLAST结果以去除短和低质量的点击(序列一致性≥90％，对比覆盖率≥90％)。
[0225] GATC登记的样品项目编号是NG-7116。结果将在提交后获得。实施例5.同时进行的微生物发酵促进了使用分离的酶制剂的未分拣MSW的酶促水解的有机捕获
[0226] 用来自于实施例9所描述的测试的生物可降解的浆料样品进行实验室规模的反应。
[0227] 用于实验室规模反应的典型MSW底物采用新鲜产生以包含城市固体废物的有机部分(定义为纤维素、动物和植物部分)来制备(如基于Riber等，2009的Jensen等，2010所述制备)。
[0228] 将典型MSW以等分试样储存于-20℃且在4℃解冻过夜。在50ml离心管中进行反应，总反应体积是20g。将典型MSW添加至5％干物质(DM)(以在60℃2天后剩余的干物质含量测量)。
[0229] 用于水解的纤维素酶是Cellic CTec3(VDNI0003,Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)(CTec3)。为了调节并将pH维持为5，加入柠檬酸盐缓冲液(0.05M)使总体积为20g。
[0230] 在置于烘箱(Binder GmBH,Tuttlingen,Germany)中的Stuart Rotator SB3(转速为4RPM)上培养反应24小时。平行设置阴性对照以评估培养期间从底物释放的干物质背景。培养后，在4℃以1350g离心试管10分钟。然后倒出上清液，取1ml用于HPLC分析，剩余上清液和沉淀在60℃干燥2天。记录干物质重量并用于计算干物质的分布。典型MSW中DM的转化基于这些数字计算。用装备有折射指数检测器( RI-101)和250nm UV检测器的
UltiMate 3000HPLC(Thermo Scientific Dionex)测量有机酸和乙醇的浓度。在Rezex RHM单糖柱(Phenomenex)上在80℃用5mM H2SO4作为洗脱液以0.6ml/min的流速进行分离。用Chromeleon软件程序(Dionex)分析结果。
UltiMate 3000HPLC(Thermo Scientific Dionex)测量有机酸和乙醇的浓度。在Rezex RHM单糖柱(Phenomenex)上在80℃用5mM H2SO4作为洗脱液以0.6ml/min的流速进行分离。用Chromeleon软件程序(Dionex)分析结果。
[0231] 为评估同时进行的发酵和水解的效果，在反应中加入2ml/20g来自于实施例5描述的测试的生物液体(取样于十二月15日和16日)，添加或者不添加CTec3(24mg/g DM)。
[0232] MSW中的DM转化
[0233] 将上清液中发现的固体含量占总干物质的百分比测定为固体的转化。图5表明了MSW空白、分离的酶制剂、单独接种微生物、和微生物接种与酶的组合中的转化。结果表明与空白反应(MSW空白)中释放的干物质背景相比，加入来自实施例5的EC12B导致明显更高的干物质转化(Students t检验p<0.0001)。与只用CTec3水解的反应和只加入EC12B的反应相比，加入EC12B样品诱导的同时进行的微生物发酵和采用CTec3的酶水解导致了明显更高的干物质转化率。
[0234] 葡萄糖、乳酸盐、乙酸盐和EtOH的HPLC分析
[0235] 上清液中测定的葡萄糖和微生物代谢物(乳酸盐、乙酸盐和乙醇)的浓度如图6所示。如图所示，在典型MSW空白中这些的背景浓度低，乳酸含量可能来自典型MSW中固有的细菌，因为用于产生底物的材料不可能被灭菌或加热杀菌。加入CTec3的效果导致了上清液中葡萄糖和乳酸的增加。在同时加入来自实施例9的EC12B生物液体和CTec3的反应中发现了葡萄糖和细菌代谢物的最高浓度。因此同时进行的发酵和水解改进了典型MSW中干物质的转化，且增加了液体中细菌代谢物的浓度。
[0236] 参考文献：Jacob Wagner Jensen,Claus Felby,Henning GeorgNanna Dreyer Enzymatic processing of municipal
solid waste.Waste Management.12/2010；30(12):2497-503。
solid waste.Waste Management.12/2010；30(12):2497-503。
[0237] Riber,C.,Petersen,C.,Christensen,T.H.,2009.Chemical composition of material fractions in Danish household waste.Waste Management 29,1251–1257。
[0238] 实施例6.同时进行的微生物发酵促进了使用分离的酶制剂的未分拣MSW的有机捕获
[0239] 用未分拣MSW在专门设计的如图8所示的批式反应器中进行测试以证实实验室规模实验中获得的结果。该实验测试为了实现同时进行微生物发酵和酶促水解而加入包含获自实施例7细菌的生物液体的接种微生物的效果。测试使用未分拣MSW进行。
[0240] 用于小规模试验的MSW是REnescience研究开发的重点。为使试验结果有价值，要求废物是代表性的且可再生的。
[0241] 在2012年三月从Nomi I/S Holstebro收集废物。废物是来自于各个地区的未分拣城市固体废物(MSW)。将废物切成30x30mm的碎片用于小规模试验以及代表样品的收集。通过将切碎废物亚采样到22升桶中对切碎废物运用抽样理论。在–18℃的冷藏箱中储存该桶直到使用。“真正的废物”由收集的八桶废物组成。再混合这些桶的内容物并再次取样以确保尽可能低的重复间的可变性。
[0242] 在相似的水、温度、转速和机械效果条件下处理所有样品。使用六个箱子：三个没有接种，三个有接种。通过添加水将试验期间的非水含量指定为15％非水含量。计算接种材料中的干物质，在接种箱里新加入的水更少。在每个箱子里加入6kg MSW，和84g商购的纤维素酶制剂CTEC3。在接种箱里加入2升接种物，相应地减少加入的水。
[0243] 分别采用添加20％NaOH以提高pH和72％H2SO4以降低pH以保持接种箱的pH为5.0和非接种箱的pH为4.2。非接种箱的较低pH有助于确保固有的细菌不会繁殖。我们之前表明，在MSW水解中使用酶制剂CTEC3Tm，在pH4.2-pH5.0没有区分活性的差异。在能提供恒定旋转搅拌的实验反应器中50℃下继续反应3天。
[0244] 在反应结束时，通过筛子和含有通过同时酶促水解和微生物发酵MSW产生的液化物质的生物液体清空箱子。
[0245] 测定干物质(TS)和挥发性固定(VS)。
[0246] 干物质(DM)法：
[0247] 样品于60℃干燥48小时。干燥前后样品重量用于计算DM百分比。
[0248] 样品DM(％)：样品干重/湿重(g)×100
[0249] 挥发性固体法：
[0250] 计算挥发性固体，以DM百分比减去灰含量表示。样品的灰含量通过在燃烧炉中550℃燃烧预干燥样品至少4小时来检测。然后，如下计算灰：
[0251] 样品干物质中的灰百分比：样品灰重量(g)/样品干重(g)×100
[0252] 挥发性固体百分比：(1-样品灰百分比)×(样品DM百分比)
[0253] 结果如下所示。如所示，接种箱中获得的生物液体获得了更高的总固体含量，表明同时进行的微生物发酵和酶促水解优于单独的酶促水解。
[0254]
[0255]
[0256]
[0257] 实施例7.同时进行的微生物发酵促进了采用分离的酶制剂的未分拣MSW的酶促水解的有机捕获
[0258] 在丹麦哥本哈根阿玛加尔资源中心(ARC)的REnescience示范工厂进行实验。图1显示了工厂主要特征的示意图。ARC REnescience废物冶炼厂的概念通常如实施例1中所述。
[0259] 如本实施例测试的REnescience技术包括三个步骤。第一步是用热水温和加热(预处理，如图4所示)MSW 20-60分钟到40-75℃的温度范围。该加热和混合阶段打开塑料袋并提供可降解组分的充分碎浆，以在添加酶前制备更均匀的有机相。在加热过程中调节温度和pH使其最适于酶促水解所用的分离酶制剂。如图1所示，加入的热水可以是干净的自来水或在洗缸中首次使用并在温和加热中再循环的洗涤水。
[0260] 第二步是酶促水解和发酵(液化，如图4所示)。在REnescience处理的第二步骤加入酶以及可选的选定的微生物。在最适于酶性能的温度和pH下连续进行酶促液化和发酵，停留时间约为16小时。通过这种水解和发酵，将MSW的生物来源部分液化为在不可降解材料间有高干物质的生物液体。pH通过加入CaCO3控制。
[0261] 如本实施例中实施的REnescience技术的第三步骤是将生物液体与不可降解部分分开的分离步骤。在弹道分离器、洗缸和液压器中进行该分离。弹道分离器将酶处理的MSW分离成生物液体、2D不可降解材料部分和3D不可降解材料部分。3D部分(物理上三维物体如罐头和塑料瓶)不与大量生物液体结合，因此单一的洗涤步骤足以清洁3D部分。2D部分(例如纺织品和箔)与大量生物液体结合。因此，使用螺旋压力机加压、洗涤和再次加压2D部分以优化生物液体的回收并获得“干净”和干燥的2D部分。从生物液体中筛除沙和玻璃这样的惰性物质。所有在洗缸中使用的水都可以再循环、加热并作为热水用于第一步骤中的加热。
[0262] 本实施例中记录的试验分为三个部分，如表5所示。
[0263] 表5
[0264] 时间(小时) Rodalon 温和加热的自来水/洗涤水27–68 + 自来水
86–124 - 自来水
142-187 - 洗涤水
86–124 - 自来水
142-187 - 洗涤水
[0265] 在7天的试验中，将获自丹麦哥本哈根的未分拣MSW以335kg/h连续装载到REnescience示范工厂。在温和加热中，在进入温和加热反应器前加入536kg/h水(自来水或洗涤水)，加热到约75℃。调节MSW温度至约50℃，通过加入CaCO3调节pH至约4.5。
[0267] 在液化反应器中加入约14kg Cellic Ctec3(可从Novozymes商购的纤维素酶制剂)/MSW湿吨。将温度维持在45-50℃的范围，通过加入CaCO3调节pH至4.2-4.5的范围。酶反应器的停留时间是约16小时。
[0268] 在弹道分离器、液压器和洗缸的分离系统中，将所得生物浆料与不可降解材料分开。
[0269] 选择性地将洗涤水倒掉、记录有机含量、或再循环并在温和加热中再次用于湿进料MSW。洗涤水的再循环具有用50℃反应条件下生长的生物比最初存在的生物完成更高水平的细菌接种的效果。在所使用的过程方案中，首先将再循环的洗涤水加热到约70℃，在这种情况下，为将进料MSW置于适合酶促水解的温度而加热到约50℃。特别对于乳酸菌，加热到70℃已经被证实提供选择性和“诱导性”的耐热表达。
[0270] 在选定的时间点从以下位置获得样品：
[0271] –通过小筛的生物液体，其称为“EC12B”；
[0272] –储罐中的生物液体；
[0273] –乳清筛之后的洗涤水；
[0274] -2D部分；
[0275] -3D部分；
[0276] –来自于两个洗涤单元的底部惰性部分。
[0277] 采用储罐上的负载细胞测量生物可降解浆料的生产。采用流量计测量输入流，采用负载细胞测量回收的或抽干的洗涤废物。
[0278] 如下检查细菌数：用SPO(蛋白胨盐溶液)将选择的生物液体样品稀释10倍，将1ml稀释液以播种深度涂在牛肉提取物琼脂(3.0g/L牛肉提取物(Fluka,Cas.:B4888)、10.0g/L胰蛋白胨(Sigma,cas.no.:T9410)、5.0g/L NaCl(Merck,cas.no.7647-14-5)、15.0g/L琼脂(Sigma,cas.no.9002-18-0))。分别在有氧和无氧环境中在50℃培养板。在合适的容器中进行的无氧培养通过Anoxymat吹气和加入iltfjernende letter(AnaeroGen from Oxoid,cat.no AN0025A)维持厌氧。16小时后计数有氧克隆数，并于24小时后再次计数。64-72小时后量化厌氧生长的细菌。
[0279] 图9表明了EC12B生物可降解的浆料样品的总挥发性固体含量，以kg/kg处理的MSW表示。通过将三个独立的实验阶段中的每一个视为独立的时间段在实验期间的不同时间点获得点估计。因此，阶段1(Rodalon)期间的点估计以相对于阶段1期间的质量平衡和物料流表示。如图5所示，在由于工厂困难而长期停止后启动的阶段1期间，观察到生物可降解的浆料中捕获的总固体稳步下降，与RodalonTM的轻微抗菌效果一致。在阶段2期间，总捕获固体回到略高水平。在阶段3期间，再循环为进料MSW提供有效的“接种”，生物可降解的浆料kg VS/kg上升到相当高的约12％的水平。
[0280] 对于如图9所示的10个时间点上的每一个点，取生物液体(EC12B)样品并用HPLC测定总固体、挥发性固体、溶解的挥发性固体、和假定的细菌代谢物乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、和丙酸盐的浓度。包括甘油浓度的这些结果如下表6所示。所有给出的百分比均为重量百分比。
[0281] 表6.生物可降解的浆料样品的分析
[0282]
[0283] 对于在10个时间点的每个点上取样的生物可降解的浆料样品，图10表明了有氧条件下的活菌计数(以计数/ml表示)和以溶解的挥发性固体表示的“细菌代谢物”(指乙酸盐、丁酸盐、乙醇、甲酸盐、和丙酸盐的总和)的重量百分比。如同所示，细菌代谢物的重量百分比随着细菌活性的提高而明显提高，而且与生物液体中增加的固体捕获相关。
[0284] 实施例8.有助于实施例7中的同时进行的发酵的微生物鉴定
[0285] 分析来自实施例7的生物液体样品的微生物组成。
[0286] 通过将样品中存在的微生物种的16S rRNA基因序列与已良好表征的种(参照种)的16S rRNA基因序列比对来鉴定样品中存在的微生物种。种鉴定的一般截止值与参照种16S rRNA基因序列具有97％相似性。如果相似性低于97％，它很可能是不同的种。
[0287] 得到的序列在NCBI数据库中用BlastN进行查询。该数据库包含长度至少为1200bp的高质量序列以及与NCBI分类关系。仅包括BLAST点击≥95％一致性的序列。
[0288] 将取样的生物可降解的浆料直接转移用于分析，在提取DNA前不冷冻。
[0289] 总共鉴定了7个细菌种(图11)且鉴定了7个古细菌种。在细菌种的某些情况下，亚种无法确定(嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、猪肠道乳杆菌(L.sobrius)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、L.frumenti,发酵乳杆菌(L.fermentum)、L.fabifermentans、胚芽乳杆菌(L.plantarum)、戊糖乳杆菌(L.pentosus))。
[0290] 实施例9.采用同时微生物发酵和使用分离的酶制剂酶促水解未分拣MSW进行有机捕获的详细分析
[0291] 采用实施例1和实施例7中描述的REnescience示范工厂详细研究采用同时微生物发酵和酶促水解未分拣MSW进行的总有机捕获。
[0292] 通过Econet表征来自哥本哈根的废物以确定其含量。
[0293] 分析废物分析以测定含量和变化。将MSW大样品运送到进行废物分析的Econet A/S。将初级样品缩小为约50-200kg的子样品。将该子样品通过受过训练的人员分拣为15个不同的废物部分。记录每个部分的重量并计算分布。
[0294] 表7.废物组分占总量的(％)，在300小时测试期间用ECOnet分析
[0295]
[0296]
[0297] 废物的组成经常变化，表7所显示的是在300小时内收集的不同样品的废物分析结果。在作为影响可捕获有机材料含量的所有部分的尿片、塑料和纸板包装和食物废物中观察到最大变化。
[0298] 在“300小时测试”的整个过程中，平均“捕获”生物可降解材料以kg VS/kg处理的MSW表示，为0.156kg VS/kg送入的MSW。
[0299] 当工厂处于稳定运行期间，在实验过程中的各个时间点取生物可降解的浆料的代表性样品。通过HPLC分析样品以测定如实施例7所述的挥发性固体、总固体和溶解的固体。结果如下表8所示。
[0300] 表8生物液体样品分析
[0301]
[0302] 实施例10.有助于实施例9中同时进行的发酵的微生物鉴定
[0303] 注意：在该实施例中，用于分析微生物鉴定的材料样品不用甘油冷冻。所得结果与高乳酸盐水平中观察到的结果和其中添加甘油冷冻样品的所有其他测试中获得的所有其他结果不一致，且认为是不准确的。
[0304] 从实施例9所述测试期间于2012年12月15日和16日取出生物可降解的浆料“EC12B”样品并储存于-20℃以便于为鉴定样品中的微生物进行的16S rDNA分析。16S rDNA分析基于核糖体小亚基的16S组件而广泛应用于原核生物的鉴定和系统发育分析。将干冰上的冷冻样品运送至进行16S rDNA分析(GATC_Biotech)的GATC Biotech AB,Solna,SE。该分析包括：提取基因组DNA，用跨越高变区域V1到V3的通用引物对(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/534R:ATTACCGCGGCTGCTGG；507bp长)制备扩增子文库，用GS FLX适配子PCR标记，在基因组测序仪FLX仪器上测序以获得每个样品104.000-160.000的读取数。
然后将所得序列在来自核糖体数据库项目(Cole等，2009)的rDNA数据库中用BlastN进行查询。该数据库包含长度为至少1200bp的高质量序列以及与NCBI分类关系。目前的Release(RDP Release10，2012年9月19日更新)包含9162种细菌和375种古细菌序列。过滤BLAST结果以去除短和低质量的点击(序列一致性≥90％，对比覆盖率≥90％)。
然后将所得序列在来自核糖体数据库项目(Cole等，2009)的rDNA数据库中用BlastN进行查询。该数据库包含长度为至少1200bp的高质量序列以及与NCBI分类关系。目前的Release(RDP Release10，2012年9月19日更新)包含9162种细菌和375种古细菌序列。过滤BLAST结果以去除短和低质量的点击(序列一致性≥90％，对比覆盖率≥90％)。
[0305] 一共鉴定了226个不同的细菌。
[0306] EC12B样品中的优势菌是一种产丙酸盐的细菌Paludibacter propionicigenes WB4(Ueki等，2006)，其占总鉴定细菌的13％。图11显示了鉴定的13种优势菌(Paludibacter propionicigenes WB4、Proteiniphilum acetatigenes、欧洲放线菌(Actinomyces europaeus)、Levilinea saccharolytica、Cryptanaerobacter phenolicus、Sedimentibacter hydroxybenzoicus、植物发酵梭菌ISDg菌株(Clostridium
phytofermentans ISDg)、Petrimonas sulfuriphila、乳酸发酵梭菌(Clostridium lactatifermentans)、Clostridium caenicola、Garciella itratireducens、局限脱卤杆菌DSM 9455(Dehalobacter restrictus DSM 9455)、Marinobacter lutaoensis)的分布。
phytofermentans ISDg)、Petrimonas sulfuriphila、乳酸发酵梭菌(Clostridium lactatifermentans)、Clostridium caenicola、Garciella itratireducens、局限脱卤杆菌DSM 9455(Dehalobacter restrictus DSM 9455)、Marinobacter lutaoensis)的分布。
[0307] 在属水平上比较鉴定的细菌表明，梭菌(Clostridium)、Paludibacter、Proteiniphilum、放线菌(Actinomyces)和Levilinea(均为厌氧菌)代表了大约一半鉴定的属。乳杆菌(Lactobacillus)属占鉴定细菌的2％。优势菌种P.propionicigenes WB4在EC12B样品中属于第二大优势属(Paludibacter)。
[0308] EC12B样品中的优势病原菌是链球菌(Streptococcus spp.)，其占总鉴定细菌的0.028％。在生物液体中未发现任何孢子形成的病原菌。
[0309] 链球菌是实施例9的生物液体中存在的唯一病原菌。链球菌具有(非孢子形成)的最高的耐温性和D值，表明在给定温度下将活链球菌细胞数减少十倍所需的时间量高于Déportes等(1998)报道的MSW中任何其他病原菌。这些结果表明实施例9中所用条件能够将REnescience过程分拣期间的MSW消毒至只有链球菌存在的水平。
[0310] 生物间对营养物的竞争，和在过程中温度的升高将明显降低病原生物的数量，且如上所述消除REnescience过程中分拣MSW中病原体的存在。其他因素如pH、aw、耐氧量、CO2、NaCl、和NaNO2也影响生物液体中病原菌的生长。以上提及因素之间的相互作用可能减少过程中降低活细胞数量所需的时间和温度。
[0311] 实施例11.通过同时微生物发酵和使用分离的酶制剂酶促水解获自遥远地理位置的未分拣MSW进行有机捕获的详细分析
[0312] 采用实施例7中描述的REnescience示范工厂处理从荷兰进口的MSW。发现该MSW含有以下组成：
[0313] 表Y：废物组分占总量的(％)，在van Gansewinkel测试中采用ECOnet分析。
[0314]
[0315] 该材料进行如实施例7和实施例9中描述的同时酶促水解和微生物发酵并在工厂运行中测试3天。在各个时间点获得生物可降解的浆料样品并表征。结果如表9所示。给出的百分比均为重量百分比。
[0316] 表9.生物液体的分析
[0317]
[0318] 根据干燥期间损失的乳酸盐用9％校正溶解的VS。
[0319] 实施例12.采用获自同时微生物发酵和使用分离的酶制剂酶促水解未分拣MSW的生物液体的生物甲烷生产
[0320] 将实施例9描述的实验中获得的生物可降解的浆料冷冻于20升桶内并储存于-18℃以备后用。采用两个相同的充分准备的固定过滤厌氧消化系统测试该材料的生物甲烷生产，所述系统包含固定在过滤支持物上的生物膜内的厌氧消化群体。
[0321] 初始样品是在反应器内采集的进料和液体。用DR2800分光光度计通过HACH LANGE试管测试测定VFA、tCOD、SCOD和氨浓度，并每天用HPLC测定具体的VFA。还通过重量法测定TSVS测量。每天采集用于GC分析的气体样品。通过测量进料罐的顶空体积和反应器的流出物排放量进行进料速度的证实。过程期间的取样通过用注射器采集液体或流出物进行。
[0322] 采用两个消化系统观察到10周的稳定的生物气体生产，对应于0.27-0.32L/g CO2。
[0323] 在两个系统中的一个中断浆料进料且监测到回到基线，如图13所示。水平线2表示稳定的气体生产水平。垂直线3表示中断进料的时间点。如同所示，稳定运行数月后，在垂直线3和4所示的时间段期间仍有残留的被转化的弹性材料。垂直线4之后的时间段表示回到基线或“下降”。基线期后，在垂直线1所示的点再次开始进料。垂直线1之后的时间段表示提高到稳定状态的气体生产或“上升”。
[0324] 从生物液体生产气体的参数(包括如所述测量的“上升”和“下降”)如下所示。
[0325]
[0326] *上升时间是从首次进料直到气体产生增加并稳定的时间。上升时间表明进料中易转化有机物的水平。
[0327] **下降时间是从最后进料直到气体产生稳步下降的时间。下降时间表明来自易转化有机物的气体生产。
[0328] ***燃尽时间是在下降时间之后直到气体产生完全在基线水平的时间。燃尽时间表明来自缓慢转化的有机物的气体生产。
[0329] ****按背景气体生产的2L/天校正。
[0330] 实施例13.采用具有和不具有同时进行的微生物发酵，使用分离的酶制剂酶促水解未分拣MSW获得的生物可降解浆料的对比生物甲烷生产
[0331] 采用实施例8所述的固定过滤厌氧消化系统比较实施例6的“高乳酸盐”和“低乳酸盐”生物可降解的浆料的生物甲烷生产。如实施例11所述获得测量结果并测定“上升”和“下降”时间。
[0332] 图14显示了“高乳酸盐”生物液体的“上升”和“下降”。水平线2表示稳定的气体生产水平。垂直线1表示进料开始的时间点。垂直线1之后的时间段表示提高到稳定状态的气体生产或“上升”。垂直线3表示中断进料的时间点。垂直线3到垂直线4所示的时间段表示回到基线或“下降”。
[0333] 图15显示了“低乳酸盐”生物液体的相同特性，其中相关点如图14所述。
[0334] 来自“高乳酸盐”和“低乳酸盐”生物液体的气体生产的比较参数(包括如所述测量的“上升”和“下降”)如下所示。
[0335] “上升”/“下降”时间的不同表明生物降解能力的容易度不同。最快的可生物转化的生物质最终将具有最高的生物气体生产应用中的总有机转化率。并且，“较快的”生物甲烷底物更适于非常快速厌氧消化系统例如固定过滤消化器的转化。
[0336] 如同所示，“高乳酸盐”生物液体在生物甲烷生产中表现出快得多的“上升”和“下降”时间。
[0337]
[0338]
[0339] *上升时间是从首次进料直到气体产生增加并稳定的时间。上升时间表明进料中易转化有机物的水平。
[0340] **下降时间是从最后进料直到气体产生稳步下降的时间。下降时间表明来自易转化有机物的气体生产。
[0341] ***燃尽时间是在下降时间之后直到气体产生完全在基线水平的时间。燃尽时间表明来自缓慢转化的有机物的气体生产。
[0342] ****按背景气体生产的2L/天校正。
[0343] 实施例14.采用通过同时微生物发酵和采用分离的酶制剂酶促水解水热预处理的小麦秸秆获得的生物可降解的浆料的生物甲烷生产
[0344] 预处理(参数)小麦秸秆，分成纤维部分和液体部分，然后单独洗涤纤维部分。然后将5kg经洗涤的纤维在含有Cellic CTEC3剂量和从实施例7获得的由生物可降解的浆料组成的发酵微生物的卧式旋转鼓反应器内培养。将小麦秸秆在50℃下进行同时水解和微生物发酵3天。
[0345] 然后采用实施例11所述的固定过滤厌氧消化系统测试该生物液体的生物甲烷生产。如实施例11所述获得测量结果的“上升”时间。
[0346] 图16显示了水解的小麦秸秆生物液体的“上升”特征。水平线2表示稳定的气体生产水平。垂直线1表示进料开始的时间点。垂直线1之后的时间段表示提高到稳定状态的气体生产或“上升”。
[0347] 来自小麦秸秆水解的生物液体的气体生产参数如下所示。
[0348] 如同所示，预处理的木质纤维素生物质也可容易地用于实践本发明的生物气体生产方法和产生新型生物甲烷底物。
[0349]
[0350]
[0351] *上升时间是从首次进料直到气体产生增加并稳定的时间。上升时间表明进料中易转化有机物的水平。
[0352] **下降时间是从最后进料直到气体产生稳步下降的时间。下降时间表明来自易转化有机物的气体生产。
[0353] ***燃尽时间是在下降时间之后直到气体产生完全在基线水平的时间。燃尽时间表明来自缓慢转化的有机物的气体生产。
[0354] ****按背景气体生产的2L/天校正。
[0355] 实施例15.通过选择的生物同时微生物发酵和酶促水解MSW
[0356] 用特定单培养细菌对典型MSW(如实施例5所述)在实验室规模内同时进行微生物发酵和酶促水解反应，操作流程如实施例5所述。反应条件和酶剂量如表10所示。
[0357] 用活菌株淀粉乳杆菌(DSMZ No.20533)和丙酸丙酸杆菌(propionibacterium acidipropionici)(DSMZ No.20272)(DSMZ,不伦瑞克,德国)(储存于4℃16小时直至使用)作为接种物以测定其对于含或不含CTec3的典型MSW的干物质转化中的效果。产生的主要代谢物分别是乳酸和丙酸。采用HPLC过程检测这些代谢物的浓度(如实施例5所述)。
[0358] 因为丙酸丙酸杆菌是厌氧菌，用气态氮净化该菌株反应所用的缓冲液，并将活培养物接种至也用气态氮净化的移动厌氧箱(Atmos Bag,Sigma Chemical CO,St.Louis,MO,US)内的反应管中。含有P.propionici的反应管在转移到培养箱前关闭。用1ml P.propionici或L.amylophilus接种该反应。
[0359] 表10所示结果明确表明产生了预期的代谢物；用P.acidipropionic接种的反应中检测到丙酸，而包含含或不含CTec3的典型MSW的对照中没有检测到丙酸。仅加入典型MSW的对照反应中的乳酸浓度几乎与仅加入L.amylophilus的反应相同。对照反应中的乳酸生产归因于典型MSW中固有的细菌。由于典型废物的单个组分是冷冻的但在制备典型MSW前没有经过任何进一步灭菌的新鲜产品，预期了某些背景细菌。当同时加入L.amylophilus和CTec3时，乳酸浓度几乎翻倍(表10)。
[0360] 水解后将DM释放到上清液的积极效果通过与CTec3同时加入L.amylophilus或P.propionici的反应中较高的DM转化来证实(与仅加入CTec3的反应相比增加了30-33％)。
[0361] 表10.实验室规模测试的单独或同时进行酶促水解的细菌培养物。显示了温度、pH、和CTec3的剂量96mg/g。在含或不含CTec3的缓冲液中平行进行MSW对照反应以评估反应中细菌代谢物的背景(除了进行一次的MSW对照外，显示了4个反应的平均值和标准方差)。
[0362] Nd.未检测，低于检测限。
[0363]
[0364] 实施例16.有助于实施例11的同时进行的发酵的微生物鉴定
[0365] 在实施例11所述测试期间取出生物液体“EC12B”样品和再循环水“EA02”样品(于3月21日和22日取样)。将该液体样品在10％甘油中冷冻，并储存于-20℃以便于为鉴定样品中的微生物进行的16S rDNA分析，该16S rDNA分析基于其核糖体小亚基的16S组件而广泛应用于原核生物的鉴定和系统发育分析。将干冰上的冷冻样品运送至进行16S rDNA分析(GATC_Biotech)的GATC Biotech AB,Solna,SE。该分析包括：
[0366] 提取基因组DNA，用跨越高变区域V1到V3的通用引物对(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/534R:ATTACCGCGGCTGCTGG；507bp长)制备扩增文库，用GS FLX适配子PCR标记，在基因组测序仪FLX仪器上测序以获得每个样品104.000-160.000的读取数。然后将所得序列在来自核糖体数据库项目(Cole等，2009)的rDNA数据库中用BlastN进行查询。该数据库包含长度为至少1200bp的高质量序列以及与NCBI分类关系。目前的Release(RDP Release 10，2012年9月19日更新)包含9162种细菌和375种古细菌序列。过滤BLAST结果以去除短和低质量的点击(序列一致性≥90％，对比覆盖率≥90％)。
[0367] 在样品EC12B-21/3、EC12B-22/3和EA02B 21/3、EA02-22/3中一共鉴定了452、310、785、594个不同的细菌。
[0368] 分析清楚地表明，在种水平上，迄今为止淀粉乳杆菌是最优势菌，占检测的全部微生物的26％-48％。EC12B样品中的微生物是相似的，13种优势菌(淀粉乳杆菌DSM11664、德氏乳杆菌属德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii)、噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、德氏乳杆菌属紫檀亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp indicus)、Lactobacillus similis JCM 2765、德氏乳杆菌属乳酸亚种DSM20072(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis DSM20072)、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、加氏乳杆菌(Lactobacillus hamster)、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pontis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri))的分布比较两个不同取样日事实上相同。
[0369] EA02样品与EC12B相似，尽管L.amylolyticus优势较弱。13种优势菌(淀粉乳杆菌DSM11664、德氏乳杆菌属德氏亚种、噬淀粉乳杆菌、德氏乳杆菌属乳酸亚种DSM20072、Lactobacillus similis JCM2765、德氏乳杆菌属紫檀亚种、类胚芽乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、加纳魏斯氏菌(Weissella ghanensis)、寡糖发酵乳杆菌LMG22743(Lactobacillus oligofermentans LMG 22743)、贝宁魏斯氏菌(Weissella beninensis)、Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811,Weissella soli、类胚芽乳杆菌)的分布也很相似，除了在13种优势细菌种中有适冷假单胞菌14-3(Pseudomonas extremaustralis 14-3)的存在。之前从南极州的临时池塘分离出EA02(21/3)中发现的该假单胞菌，且其应能够从辛酸盐和葡萄糖产生聚羟基脂肪酸酯(PHA)(Lopez等，2009；Tribelli等，2012)。
[0370] 在属水平上比较结果表明，乳杆菌(Lactobacillus)占样品中鉴定细菌的56-94％。再一次，EC12B和EA02的两个取样日之间属的分布极其相似。有趣的是，在EA 02样品中，魏斯氏菌(Weisella)、明串珠菌(Leuconostoc)和假单胞菌(Pseudomonas)属大量存在(1.7-22％)，但在EC12B样品中却只占较小构成部分(>0.1％)。魏斯氏菌(Weisella)和明串珠菌(Leuconostoc)与乳杆菌一样都属于乳杆菌目。
[0371] 实施例11所述检测期间取样的EC12B和EA02中优势病原菌分别占鉴定的总细菌的0.281-0.539％和0.522-0.592％。EC12B样品中的优势病原菌是气单胞菌(Aeromonas spp.)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、布鲁氏菌(Brucella sp.)、枸橼酸杆菌(Citrobacter spp.)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfrigens)、Klebsiells sp.、变形杆菌(Proteus sp.)、普罗威登斯菌(Providencia sp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、沙雷氏菌(Serratia sp.)、志贺菌(Shigellae spp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(参见图3)。在实施例11中描述的EC12B和EA02中未检测到孢子形成的病原菌。
EC12B和EA02中检测到的病原菌总量随时间下降，EC12B中的总细菌数在一天内几乎消失。
EC12B和EA02中检测到的病原菌总量随时间下降，EC12B中的总细菌数在一天内几乎消失。
[0372] Déportes等(1998)概述了已知在MSW中存在的病原菌。表11显示了实施例7、9和11所述的MSW中存在的病原菌(Déportes等(1998)和16S rDNA分析)。除Déportes等(1998)描述的病原菌外，从实施例11所述测试期间取样的EC12B和EA02中还发现Proteua sp.和普罗威登斯菌(Providencia sp.)。然而，这里不存在实施例9的生物液体中唯一存在的病原菌，链球菌。这表明在实施例11的EC12B和EA02中存在其他细菌群体，这可能归因于生物间对营养物的竞争以及将更促进其他细菌群体的生长的在过程期间温度的略微下降。
[0373] 表12.实施例7、9和11中存在的病原体综述
[0374]
[0375] 菌株鉴定和DSMZ保藏
[0376] 将3月21日和22日从实施例7所述测试期间取出的EA02样品送到生物持续性诺北欧中心(NN中心)(赫斯霍尔姆，丹麦)涂板以鉴定并获得分离细菌的单一培养。在到达NN中心后，将样品于50℃培养过夜，然后在不同板上(GM17,胰蛋白大豆培养基和牛肉提取物(GM17琼脂:48.25g/L m17琼脂高温灭菌20分钟后加入葡萄糖至最终浓度为0.5％,胰蛋白大豆琼脂:30g/L胰蛋白大豆培养基,15g/L琼脂,添加15g/L琼脂的牛肉培养基(国立血清研究所，哥本哈根，丹麦))涂板，并于50℃有氧生长。一天后，肉眼检查板，将选定的克隆再次涂到相应板上并送到DSMZ进行鉴定。
[0378] 鉴定的样品
[0379] 样品ID：13-349沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)源自于(EA02-21/3),DSM 27312
[0380] 样品ID：13-352短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)源自于(EA02-22/3),DSM 27314
[0381] 样品ID：13-353枯草芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis sp.subtilis)源自于(EA02-22/3),DSM 27315
[0382] 样品ID：13-355地衣杆菌(Bacillus licheniformis)源自于(EA02-21/3),DSM 27316
[0383] 样品ID：13-357牛放线菌(Actinomyces bovis)源自于(EA02-22/3),DSM 27317[0384] 未鉴定的样品
[0385] 样品ID：13-351源自于(EA02-22/3),DSM 27313
[0386] 样品ID：13-362A源自于(EA02-22/3),DSM 27318
[0387] 样品ID：13-365源自于(EA02-22/3),DSM 27319
[0388] 样品ID：13-367源自于(EA02-22/3),DSM 27320
[0389] 参考文献
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