一种耐低温草菇菌株及其选育方法
阅读：1036发布：2020-11-24
专利汇可以提供一种耐低温草菇菌株及其选育方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种耐低温草菇菌株及其选育方法，通过出发菌株库的构建，草菇原生质体的制备、诱变，突变菌株库的构建，草菇原生质体灭活及融合，最终筛选出保持耐低温性且生长速度、菌落外观形态、 颜色 均无明显变化的重排菌株，即得到所述的耐低温草菇菌株，其 生物 保藏号为CCTCC NO：M2013207。本 发明 所述的耐低温草菇菌株能正常出菇，遗传 稳定性 好，菌丝在0℃条件下42h仍然有生命活 力 ，子实体10℃条件下可储藏28h，大大提高了草菇子实体的耐低温能力，解决了现有草菇子实体不耐低温储藏的难题，从而极大地提高了草菇产量与 质量 ，有效地扩大了草菇种植季节，提高了经济效益。，下面是一种耐低温草菇菌株及其选育方法专利的具体信息内容。
1.一种耐低温草菇菌株，其生物保藏号为=CCTCC NO:M2013207o
2.根据权利要求1所述的耐低温草菇菌株，其特征在于，所述耐低温草菇菌株菌落4d长满平板，初期为白色，中期从中心向边缘逐渐变淡黄色，后期颜色加深变红，培养基出现红铁锈色；菌株菌丝部分内生，气生菌丝较多，菌丝有隔，多分枝，菌丝直径4.0l〜11.98 μ m,菌丝长25.62〜320.08 μ m,菌丝细胞内多核，细胞之间未见锁状联合；能正常出菇，菌丝在0°C条件下42h仍然有生命活力，子实体10°C条件下可储藏28h。
3.如权利要求1或2所述的耐低温草菇菌株的选育方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)出发菌株库构建 收集到 16 株草菇菌株 V23、V9715、V9、V106、V97、V874、V5-2、VW、VG、VT-1、VT-2、V14、N03、VB2、V28、V5，构建多基因型出发菌株库； 2)原生质体制备 将16株出发菌株分别接种于PDA固体培养基上，32 ± 0.5 °C恒温培养3〜4d，取PDA固体培养基上生长旺盛的菌丝，接种于PDA液体培养基中，32±0.5°C条件下静止培养，每天早晚各摇动I次；将培养I〜3d的菌丝用无菌水洗涤干净后用灭菌滤纸吸去表面水分待用； 收集菌丝，按每150〜250mg菌丝加ImL酶液量进行酶解，酶解温度30±0.5°C，酶解时间1.5〜4h，酶解后将酶解液用灭菌的G3砂芯漏斗过滤，滤液以3000〜3500r/min离心lOmin，去除上清液，用0.6mol/L甘露醇溶液洗涤2〜3次，得到纯化后洁白的原生质体； 3)原生质体诱变 将每株出发菌株的纯化后原生质体均分为4份，分别进行电子束诱变、6tlCtj-Y诱变、紫外线诱变、EMS诱变，诱变后的原生质体再生培养； 4)变异菌株筛选 步骤3)诱变的草菇原生质体再生后，放置0±0.5°C条件下处理20〜26h，然后，放置32±0.5°C条件下培养，4d后选取没有冻死且复苏生长较快的单菌株接种于PDA固体培养基平板上，选菌丝较密、生长健壮的单菌株为初筛变异菌株；把初筛变异菌株转接5代，每代都进行0°C、24h耐低温实验，到第5代还保持耐低温性且菌丝较密、生长健壮的菌株为筛选出的最终变异菌株；每个出发菌株选出I株最终变异菌株用以构建基因组重排的突变菌株库； 5)原生质体灭活及融合 将突变菌株库里所有最终变异菌株的原生质体等量混合后分成相等的两份，一份进行热灭活，另一份进行紫外线灭活；将两种方法灭活的原生质体悬液混合，离心收集原生质体，去除上清液后将原生质体悬浮于渗透压稳定剂中，然后加入预热的PEG6000溶液，30〜34°C水浴保温60s后加入渗透压稳定剂终止融合，并离心洗涤，去除PEG6000融合剂，洗涤后的原生质体重新悬浮于渗透压稳定剂中，接种于PDA再生培养基上再生培养； 6)菌株4轮重排 原生质体融合后，再生培养3.5〜4.5d,收集全部再生菌落接种于PDA固体培养基上32±0.5°C恒温培养3.5〜4.5d,然后置于0°C下处理26〜30h,再置于32±0.5°C恒温培养，仍然能生长的菌株为Fl代重排菌株；将Fl代重排菌株全部收集，按上述同样方法制备原生质体、并进行原生质体融合、再生、低温处理，共进行4轮循环，每增加一代低温处理时间增加3〜4h，选出每代仍然能生长的重排菌株，分别标记为F1、F2、F3、F4代重排菌株； 7)重排菌株遗传稳定性鉴定 将F4代重排菌株连续转接培养5代，每代都进行0°C、40h低温处理，到第5代还保持耐低温性且生长速度、菌落外观形态、颜色均无明显变化的菌株为遗传性稳定的基因组重排菌株，即为耐低温草燕菌株； 8)出菇实验及分子生物学鉴定 检测重排菌株的出菇性能，选出出菇性较好的耐低温草菇菌株用RAPD法鉴定是否为基因组重排菌株，扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶中电泳120min，紫外灯下观察重排菌株与变异菌株电泳条带是否存在差异； 9)重排菌株耐低温 性鉴定 将栽培实验得到的耐低温草菇子实体放在保鲜袋中，于10°C低温条件下储藏，每间隔2h观察子实体有无软化，并切开，观察切面有无水浸现象，当子实体变软，切面出现水浸现象时则失去了商品性。
4.根据权利要求3所述的耐低温草菇菌株的选育方法，其特征在于，步骤2)中酶液的配制:将溶壁酶溶解于0.6mol/L甘露醇溶液中，配制成含I〜2#%溶壁酶的粗酶液，粗酶液在4000〜4500r/min低速离心10〜15min，取上清液经0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌后使用。
5.根据权利要求3所述的耐低温草菇菌株的选育方法，其特征在于，步骤3)中电子束诱变条件:电子加速器功率为10Kw，每秒能发射IOMev能量，诱变剂量为550〜650Gy，对应的致死率为67.81〜81.19%。
6.根据权利要求3所述的耐低温草菇菌株的选育方法，其特征在于，步骤3)中6tlCo-Y诱变条件:6°Co-Y诱变器为装源量为15万居里的钴源辐照装置，剂量率为10GY/min，诱变剂量为700〜800Gy，对应的致死率为70.42〜82.36%。
7.根据权利要求3所述的耐低温草菇菌株的选育方法，其特征在于，步骤3)中EMS诱变条件:用渗透压稳定剂配制的EMS溶液，加入离心收集到的原生质体中，混匀，诱变剂EMS的诱变浓度为0.25%〜2%，在32±0.5°C条件下处理Ih，草菇原生质体致死率为53.76〜.90.87%。
8.根据权利要求3所述的耐低温草菇菌株的选育方法，其特征在于，步骤3)中紫外线诱变条件:15w的紫外灯，培养皿距灯管30cm，灯预热20min后，打开皿盖进行照射，诱变时间为35〜45s，对应的致死率为62.18〜80.23%。
9.根据权利要求3所述的耐低温草菇菌株的选育方法，其特征在于，步骤5)中热灭活:将最终变异菌株的原生质体悬液一份移入无菌试管中，置于50°C恒温水浴4.5〜5.5min进行热灭活；紫外线灭活:另一份最终变异菌株的原生质体悬液移入无菌平皿中，置于已预热稳定的30w紫外灯下，垂直距离为30cm，照射95〜105s，进行紫外线灭活。
10..根据权利要求3所述的耐低温草菇菌株的选育方法，其特征在于，步骤5)中PEG6000溶液用0.6mol/L的甘露醇溶液配制，PEG6000浓度为32〜38wt%，pH为6.8〜.7.2，其中添加CaCl2,使Ca2+浓度为0.0lmol/L。
一种耐低温草菇菌株及其选育方法
技术领域
背景技术
[0002]草燕[Volvariella volvacea (Bull, ex Fr.) Sing.]起源于中国，又称中国燕，分类上属于担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，伞菌目，鹅膏菌科，草菇属。草菇是一种喜湿、喜温的草腐真菌，生产周期短，成本低，在热带和亚热带高温多雨地区广为栽培。草菇以鲜销为主，鲜食口感较好，味道鲜美、肉质细腻，具有丰富的营养和保健作用，深受人们喜欢。但草菇子实体采收后，在常温下仍进行旺盛的生理代谢活动。在生理上，草菇的开伞问题是食用菌中最为突出的，它不论是在菇床上还是采收后，菌柄会以2〜3cm/h的速度迅速生长，3〜4h内就开伞、变色、变质老化，降低了营养价值并大大缩短了货架期。因此，采收后的草菇子实体急需低温储存，以抑制其旺盛的生理代谢活动。然而，在低温5〜10°C条件下，草菇子实体会变软、自溶液化，以致腐化变质而丧失食用价值，从而失去了商品价值；所以，草菇子实体储存问题是草菇生产的关键制约因素。
[0003] 草菇为同宗结合真菌，生活史复杂，且菌丝间无锁状联合，杂种选择缺乏遗传标记，这给草菇常规育种带来很大困难。为了培育出子实体耐低温储藏的草菇菌种，现有方法有:1)通过对常规菌株进行自然低温驯化，多次重复出菇比较试验，从中筛选出耐低温草菇菌株。该选育方法建立在菌株自然变异的基础上，自然变异由于变异率极低且变异方向不确定，因此该选育方法具有盲目性且成功率较低；2)用诱变的方法筛选耐低温突变草菇菌株，虽然筛选到耐低温的突变菌株并不困难，但还达不到生产上应用的要求；3)用基因枪把抗冷蛋白基因导入草菇，希望构建耐低温的草菇工程菌，但至今也没能构建出可用于生产的理想菌株。因此，草菇不耐低温问题仍然是食用菌界一个难题。
[0004]目前，对草菇遗传背景还缺乏了解，且所筛选到的耐低温草菇菌株多为通过诱变选育得到的，如再继续采用常规诱变育种手段则难以获得明显的效果。因此，耐低温草菇菌株的选育成为当前草菇研究的首要任务。
[0005] 基因组重排(Genome shuffling)技术是近几年新发展起来的一种微生物育种方法，该技术通过定向进化技术使菌株的基因组得到随机重排而达到选育目的，具有不需要事先知道供试微生物的遗传背景也可以对其进行遗传育种的突出优点，使之成为了一种极其高效的微生物育种方法。目前，国内外目前尚未见应用基因组重排技术选育草菇耐低温菌株的报道。
发明内容
[0006] 本发明提供了一株耐低温草菇菌株及其选育方法，采用基因组重排技术选育出耐低温草菇菌株，明显提高其子实体耐低温能力，解决现有技术中草菇低温储藏难题，并且有效地扩大草菇种植季节，提高草菇产量与质量，提高经济效益。
[0007] 本发明所述的草 菇(Volvariella volvacea) SVF-4，其生物保藏号为CCTCC NO:M2013207，保藏日期为2013年5月15日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为武汉市武昌区珞珈山武汉大学，邮编:430072。
[0008] 本发明所述的耐低温草菇菌株，菌落4d长满平板，初期为白色，中期从中心向边缘逐渐变淡黄色，后期颜色加深变红，培养基出现红铁锈色；菌株菌丝部分内生，气生菌丝较多，菌丝有隔，多分枝，菌丝直径4.01〜IL 98 μ m，菌丝长25.62〜320.08 μ m,菌丝细胞内多核，细胞之间未见锁状联合；耐低温草菇菌株能正常出菇，菌丝在0°C条件下42h仍然有生命活力，子实体10°C条件下可储藏28h。
[0009] 本发明所述的耐低温草菇菌株的选育方法，具体包括如下步骤:
[0010] (I)出发菌株库构建
[0011]收集到 16 株草菇菌株(V23、V9715、V9、V106、V97、V874、V5-2、VW、VG、VT-l、VT-2、V14、N03、VB2、V28、V5)，构建多基因型出发菌株库。
[0012] (2)原生质体制备
[0013] 把出发菌株分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上，32±0.5°C恒温培养3〜4d，取PDA固体培养基上生长旺盛的菌丝，接种于PDA液体培养基中，32±0.5°C条件下静止培养，每天早晚各摇动I次；将培养I〜3d的菌丝用无菌水洗涤干净后用灭菌滤纸吸去表面水分待用。
[0014] 收集菌丝，按每150〜250mg菌丝加ImL酶液量进行酶解，酶解温度30±0.5°C,酶解时间1.5〜4h，酶解后将酶解液用灭菌的G3砂芯漏斗过滤，滤液以3000〜3500r/min离心lOmin，去除上清液，用0.6mol/L甘露醇溶液洗涤2〜3次，得到纯化后洁白的原生质体。.
[0015] 酶液配制:将溶壁酶(购自广东微生物研究所，为一种能溶解真菌细胞壁的粗酶冻干粉)溶解于0.6mol/L甘露醇溶液中，配制成含I〜2#%溶壁酶的粗酶液，粗酶液在4000〜4500r/min低速离心10〜15min，取上清液经0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌后使用。
[0016] (3)原生质体诱变
[0017] 将每株出发菌株的纯化后原生质体均分为4份，分别进行电子束诱变、6tlCtj-Y诱变、紫外线诱变、EMS (甲基黄酸乙脂)诱变，诱变后的原生质体再生培养。
[0019] 60Co-Y诱变条件=6ciCtj-Y诱变器为装源量为15万居里的钴源辐照装置，剂量率为10GY/min，诱变剂量为700〜800Gy，对应的致死率为70.42〜82.36%。
[0020] EMS诱变条件:用渗透压稳定剂配制的EMS溶液，加入离心收集到的原生质体中，混匀，诱变剂EMS的诱变浓度为0.25〜2%，在32±0.5°C条件下处理lh，草菇原生质体致死率为53.76〜90.87% ；[0021 ] 紫外线诱变:15w的紫外灯，培养皿距灯管30cm，灯预热20min后，打开皿盖进行照射，诱变时间为35〜45s，对应的致死率为62.18〜80.23%。
[0022] (4)变异菌株筛选
[0023] 步骤(3)诱变的草菇原生质体再生后，放置0±0.5°C条件下处理20〜26h，然后，放32±0.5°C条件下培养，4d后选取没有冻死且复苏生长较快的单菌株接种于PDA固体培养基平板上，选菌丝较密、生长健壮的单菌株为初筛变异菌株。[0024] 把初筛变异菌株转接5代，每代都进行耐低温实验(0°C，24h)，到第5代还保持耐低温性且菌丝较密、生长健壮的菌株为筛选出的最终变异菌株。每个出发菌株选出I株最终变异菌株用以构建基因组重排的突变菌株库。
[0025] (5)原生质体灭活及融合
[0026] 将突变菌株库里所有最终变异菌株的原生质体等量混合后分成相等的两份，一份进行热灭活，另一份进行紫外线灭活。
[0027] 热灭活:将最终变异菌株的原生质体悬液一份移入无菌试管中，置于50°C恒温水浴4.5〜5.5min进行热灭活。
[0028] 紫外线灭活:另一份最终变异菌株的原生质体悬液移入无菌平皿中，置于已预热稳定的30w紫外灯下，垂直距离为30cm，照射95〜105s，进行紫外线灭活。
[0029] 将两种方法灭活的原生质体悬液混合，离心收集原生质体，去除上清液后将原生质体悬浮于渗透压稳定剂中，然后加入30°C预热的PEG6000融合剂，30〜34°C水浴保温60s后加入渗透压稳定剂终止融合，并离心洗涤，去除PEG6000融合剂。洗涤后的原生质体重新悬浮于渗透压稳定剂中，接种于PDA再生培养基上再生培养。
[0030] PEG6000融合剂用渗透压稳定剂配制，PEG6000浓度为32〜38wt%，pH为6.8〜7.2，其中添加CaCl2,使Ca2+浓度为0.01mol/L。
[0031] (6)菌株4轮重排
[0032] 原生质体融合后，涂布于PDA再生培养基上32±0.5°C恒温培养3.5〜4.5d。收集全部再生菌落接种于PDA固体培养基上32 ± 0.5°C恒温培养3.5〜4.5d,然后置于0°C下处理26_30h,再置于32±0. 5°C恒温培养,仍然能生长的菌株为Fl代重排菌株；之后,将Fl代重排菌株全部收集，按上述同样方法制备原生质体，进行第二轮融合、再生、(TC条件下处理30-34h，所得仍然能生长的菌株即为第二轮耐低温融合子，命名为F2代重排菌株。原生质体融合、再生、低温处理共进行4轮循环，每增加一代低温处理时间增加3〜4h。选出每代仍然能生长的重排菌株，分别标记为F1、F2、F3、F4代重排菌株。
[0033] (7)重排菌株遗传稳定性鉴定
[0034] 将F4代重排菌株连续转接培养5代，每代都进行低温处理(0°C，40h)，到第5代还保持耐低温性且生长速度、菌落外观形态、颜色均无明显变化的菌株为遗传性稳定的基因组重排菌株，即为本发明的耐低温草燕菌株。
[0035] (8)出菇实验及分子生物学鉴定
[0036] 检测重排菌株的出菇性能；选出出菇性能较好的菌株用RAPD(随机扩增多态性DNA标记)法鉴定是否为基因组重排菌株。本发明共设计了 36个随机引物，从36个随机引物中挑选扩增效果好、多态性高、稳定较强的两个引物对样品进行扩增，所选引物序列具体如下:引物 1:GAAACGGGTG，引物 2:TCGGCGATAG。
[0037] 扩增产物在2.0 %琼脂糖凝胶中电泳120min，紫外灯下观察重排菌株与变异菌株电泳条带是否存在差异、拍照。
[0038] (9)重排菌株耐低温性鉴定
[0039] 将按常规栽培实验得到的重排草菇子实体放在保鲜袋中，于10°C低温条件下储藏，每间隔2h观察子实体有无软化，并切开观察切面有无水浸现象，当子实体变软，切面出现水浸现象时则失去了商品性。[0040] 本发明所用培养基及溶液的配制方法:(i)PDA液体培养基:马铃薯200g，沸水中煮15min，8层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，补加水至1000mL。(ii)PDA固体培养基:向上述PDA液体培养基中加入I %的琼脂粉后灭菌；(iii)PDA再生培养基:PDA液体培养基中加甘露醇，使其浓度为0.6mol/L,再加I %的琼脂粉；(iv)渗透压稳定剂均为0.6mol/L的甘露醇溶液。
[0041] 根据本发明方法选育出的耐低温草菇菌株，能正常出菇，菌丝在0°C条件下42h仍然有生命活力，比出发菌株提高了 169.23〜342.11% (出发菌株中0°C致死时间最长为菌株V23，具体为15.6h ;最短为菌株N03，具体为9.5h) ;10°C条件下，子实体可储藏28h，比出发菌株提高了 75.00〜154.51% (出发菌株中，子实体10°C储藏时间最长为菌株V23，具体为16.0h ;最短为菌株N03，具体为11.0h) ο
[0042] 本发明的有益效果:
[0043] 本发明米用基因组重排技术选育出耐低温草燕菌株，其能正常出燕，遗传稳定性好，菌丝在(TC条件下42h仍然有生命活力，并且，10°C条件下，其子实体可储藏28h，大大提高草菇子实体的耐低温能力，解决了现有草菇子实体不耐低温储藏的难题，从而极大地提高了草菇产量与质量，有效地扩大了草菇种植季节，提高了经济效益。附图说明
[0044] 图1为本发明实施`例1的耐低温草燕菌株SVF-4的平板培养观察图；
[0045] 图2为本发明实施例1的耐低温草菇菌株SVF-4的菌丝显微图(400倍);
[0046] 图3为本发明实施例1的耐低温草菇SVF-4的出菇观察图；
[0047] 图4为耐低温草菇SVF-4的RAPD鉴定结果(I为V23的突变体，2为V9715的突变体，3为V9的突变体，4为V106的突变体，5为V97的突变体，6为V874的突变体，7为V5-2的突变体，8为VW的突变体，9为VG的突变体，10为VT-1的突变体，11为VT-2的突变体，12为V14的突变体，13为N03的突变体，14为VB2的突变体，15为V28的突变体，16为V5的突变体，17为耐低温菌株SVF-4)；
[0048] 图5为本发明实施例1的耐低温草菇子实体低温储藏结果，A为V23子实体，B为耐低温草菇SVF-4子实体；
[0049] 图6为本发明实施例2的耐低温草菇VF2出菇观察图；
[0050] 图7为耐低温草菇VF2的RAPD鉴定结果(I为V23的突变体，2为V9715的突变体，3为V9的突变体，4为V106的突变体，5为V97的突变体，6为V874的突变体，7为V5-2的突变体，8为VW的突变体，9为VG的突变体，10为VT-1的突变体，11为VT-2的突变体，12为V14的突变体，13为N03的突变体，14为VB2的突变体，15为V28的突变体，16为V5的突变体，17为耐低温菌株VF2)；
[0051] 图8为本发明实施例2的耐低温草菇子实体低温储藏结果，A为V23子实体，B为耐低温草燕VF2子实体；
[0052] 图9为本发明实施例3的耐低温草菇VF3出菇观察图；
[0053] 图10为耐低温草菇VF3的RAPD鉴定结果(I为V23的突变体，2为V9715的突变体，3为V9的突变体，4为V106的突变体，5为V97的突变体，6为V874的突变体，7为V5-2的突变体，8为VW的突变体，9为VG的突变体，10为VT-1的突变体，11为VT-2的突变体，12为V14的突变体，13为N03的突变体，14为VB2的突变体，15为V28的突变体，16为V5的突变体，17为耐低温菌株VF3)；
[0054] 图11为本发明实施例3的耐低温草菇子实体低温储藏结果，A为V23子实体，B为耐低温草菇VF3子实体。
具体实施方式
[0055] 以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
[0056] 实施例1
[0057] (I)出发菌株库构建
[0058] 16 株草菇菌株(V23、V9715、V9、V106、V97、V874、V5-2、VW、VG、VT-1、VT-2、V14、N03、VB2、V28、V5)，构建了多基因型出发菌株库，构建的出发菌株库基因型丰富，包括了目前生产上应用的基因类型。16株出发菌株的来源参见表I。
[0059] 表I出发菌株及其来源
[0060]
[0062] (2)原生质体制备
[0063] 将16株出发菌株分别接种于PDA固体培养基上,32±0.5°C恒温培养3〜4d,取PDA培养基上生长旺盛的菌丝，接种于PDA液体培养基中，32±0.5°C条件静止培养，每天早晚各摇动I次。将培养2d的菌丝用无菌水洗涤干净后用灭菌滤纸吸去表面水分待用。溶壁酶(购自广东微生物研究所，为一种能溶解真菌细胞壁的粗酶冻干粉)用0.6mol/L甘露醇溶液溶解，使溶壁酶的质量浓度为1.5%，溶解后的粗酶液4000r/min低速离心15min，取上清液经0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌后使用。按每200mg湿菌丝加ImL酶液量进行酶解，酶解温度为30±0.5°C，酶解时间为3h，酶解后将酶解液用灭菌的G3砂芯漏斗过滤，滤液以3400r/min离心lOmin，去除上清液，用0.6mol/L甘露醇溶液洗涤2次，得到纯化后洁白的原生质体。
[0064] (3)原生质体诱变
[0065] 将每株出发菌株的纯化后原生质体均分为4份，分别进行电子束诱变、6°C。- Y诱变、紫外线诱变、EMS诱变，诱变后的原生质体再生培养。
[0066] I)电子束诱变及6°C。- Y诱变
[0067] 2份纯化后的原生质体分别用0.6mol/L甘露醇溶液溶解，取ImL置于2.5mL PE离心管中密封，分别进行电子束诱变及6°C。- Y诱变。
[0068] 电子束诱变仪器为日本IHI公司生产的高能电子直线加速器，该电子加速器功率为lOKw，每秒能发射IOMev能量，诱变剂量为600Gy，对应的致死率为78.48%；60Co-Y诱变器为装源量为15万居里的钴源辐照装置，剂量率为10GY/min，诱变剂量为750Gy，对应的致死率为79.49%。
[0069] 诱变结束后将原生质体用渗透压稳定剂稀释，用吸管吹打成悬液，用血球计数板计数，调整细胞浓度为I X IO5个/mL，用移液管吸取0.1mL,涂布于PDA再生培养基上，在32 ±0.5°C条件下再生培养。
[0070] 2)紫外线诱变
[0071] I份纯化后的原生质体 用血球计数板计数,调整细胞浓度为IXlO5个/mL,用移液管吸取0.1mL,涂布于PDA再生培养基上，用15w的紫外灯进行诱变。培养皿距灯管30cm，灯预热20min后，打开皿盖进行照射，诱变时间为40s，对应的致死率为70.27%。诱变结束后，PDA再生培养基平板用黑纸包严，置32±0.5°C下培养。为预防光复活，以上操作均在红光下进行。
[0072] 3) EMS 诱变
[0073] I份纯化后的原生质体离心(3400r/min, IOmin)收集,用渗透压稳定剂配制EMS体积浓度比为I %的EMS溶液，与离心收集的原生质体混匀，在32 ±0.5°C条件下处理lh，草菇原生质体致死率为71.20% ;然后用渗透压稳定剂洗涤2〜3次，用渗透压稳定剂重新悬浮原生质体，用血球计数板计数，调整调整细胞浓度为I X IO5个/mL,用移液管吸取0.1mL,涂布于PDA再生培养基上，在32 ±0.5°C条件下培养。
[0074] (4)变异菌株筛选
[0075] 诱变的草菇原生质体再生后，放置0±0.5°C条件下处理24h，然后放32±0.5°C条件下培养，4d后选取没有冻死且复苏生长较快的单菌株接种于PDA固体培养基平板上，选菌丝较密、生长健壮的单菌株为初筛变异菌株。
[0076] 把初筛变异菌株转接5代，每代都进行耐低温实验(0°C，24h)，到第5代还保持耐低温性且菌丝较密、生长健壮的菌株为最终筛选出的变异菌株。从由每个出发菌株中选出I株变异菌株进行原生质体融合。
[0077] (5)原生质体灭活及融合[0078] 变异菌株的原生质体等量混合后分成相等的两份，一份进行热灭活，另一份进行紫外线灭活。
[0079] 热灭活:变异菌株的原生质体用吸管吹打悬浮，悬液各取ImL移入无菌试管中，置于50°C恒温水浴中，分别保温处理5min进行热灭活。紫外线灭活:变异菌株的原生质体悬液各取ImL移入直径为6cm的无菌平皿中，置于已预热稳定的30w紫外灯下,垂直距离为30cm，照射100s，进行紫外线灭活。
[0080] 将两种方法灭活的原生质体悬液混合，3000r/min离心lOmin，收集原生质体，去除上清液后将原生质体悬浮于0.2mL渗透压稳定剂中，然后加入30°C预热的PEG6000融合剂1.8mL,调整PEG6000融合剂pH为7，PEG6000终浓度为35wt %，32°C水浴保温60s后加入5mL渗透压稳定剂终止融合，并离心洗涤，去除融合剂。洗涤后的原生质体重新悬浮于渗透压稳定剂中，PDA再生平板再生培养。PEG融合剂用渗透压稳定剂配制，其中添加Ca2+(0.0lmol/L CaCl2)。
[0081] (6)菌株4轮重排
[0082] 变异菌株的原生质体灭活、融合后，再生平板培养法再生，32±0.5°C恒温培养4d。收集全部再生菌落接种于PDA培养基上32±0.5°C恒温培养4d，然后置于0°C下处理28h，再置于32±0.5°C恒温培养,仍然能生长的菌株为Fl代重排菌株；之后,将Fl代重排菌株全部收集，制备原生质体，并按同样方法进行第二轮融合、再生、(TC条件下处理32h，所得菌株即为第二轮耐低温融合子，即F2代重排菌株。原生质体融合、再生、低温处理共进行4轮循环，每增加一代低温处理时间增加4h。选出每代的重排菌株，分别标记为F1、F2、F3、F4代重排菌株。
[0083] (7)重排菌株遗传稳定性鉴定
[0084] 草菇重排菌株的遗传稳定性分析:将F4代重排菌株连续转接培养5代，每代都进行低温处理(0°C，40h)，到第5代耐低温性不变、生长速度不变且菌丝较密、健壮的菌株为最终筛选出的遗传性稳定的基因组重 排菌株，即得到耐低温草菇菌株。
[0085] (8)重排菌株出菇实验及分子生物学鉴定
[0086]用常规的栽培实验来检测重排菌株的出菇性能。栽培种接种到以棉籽壳为主的栽培料上，在常规的管理条件下3〜5d菌丝可布满料面，再经过2〜3d的管理，在培养料面上出现大量草菇菌丝扭结团，少数的菌丝扭结团可发育成针头状的草菇原基，草菇原基生长很快，经2〜3d即可发育形成蛋形草菇，可采摘。选出菇性较好的I株标记为SVF-4，出菇结果参见图3。
[0087] RAPD法鉴定SVF-4是否为基因组重排菌株，鉴定步骤为:采用CTAB法提取SVF-4与变异草菇菌株基因组DNA，采用核酸蛋白测定仪测定DNA浓度，1.3%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。从30个随机引物中挑选扩增效果好、多态性高、稳定较强的引物I和引物2对样品进行扩增。引物序列具体如下:引物1:GAAACGGGTG，引物2:TCGGCGATAG。反应体系总体积为 15 μ L，I XBuffer, 0.2mmol.L MNTPs, 1.5mmoI.L 1 的 Mg2+, 0.8pmol.μ L 1 弓丨物，90ng模板DNA，0.4U DNA聚合酶，最后用双蒸水补至15 μ L。反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，45。。复性70s，72。。延伸2min，共42个循环；最后在72°C条件下延伸IOmin,结束后4°C保存。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳30〜50min，紫外灯下观察菌株SVF-4与变异菌株电泳条带是否存在差异。[0088] 鉴定结果为:RAPD标记显示:耐低温草菇菌株SVF-4与变异草菇菌株基因组有明显差异，表明选出的菌株SVF-4为基因组重排菌株，具体结果参见图4。
[0089] (9)重排菌株耐低温性鉴定
[0090] 将栽培实验得到的草菇SVF-4子实体放在保鲜袋中于10°C低温条件下储藏，每间隔2h观察子实体有无软化。出发菌株中最耐低温的V23出现子实体切面有水浸现象、子实体变软的储藏时间为16h，重排菌株子实体出现此现象时的储藏时间为28h，比V23耐低温性提高了 75.00%。当储藏16h时，V23出现软化、水浸现象，而重组菌株VFl仍然具有较好的商品性，具体参见图5。
[0091] 本实施例选育的耐低温草菇菌株SVF-4 (平板培养观察图如图1所示，菌丝显微图如图2所示)，菌落4d长满平板，初期为白色，中期从中心向边缘逐渐变淡黄色，后期颜色加深变红，培养基出现红铁锈色；菌株菌丝部分内生，气生菌丝较多，菌丝有隔，多分枝，菌丝直径4.01〜IL 98 μ m，菌丝长25.62〜320.08 μ m,菌丝细胞内多核，细胞之间未见锁状联合；能正常出菇，菌丝在0°C条件下42h仍然有生命活力，子实体10°C条件下可储藏28h。
[0092] 实施例2
[0093] (I)出发菌株库构建
[0094] 出发菌株库的构建同实施例1。
[0095] (2)原生质体制备
[0096] 原生质体制备方法同实施例1。与实施例1参数不同之处为:菌丝液体培养时间为Id ;菌丝酶解时每150mg菌丝加ImL酶液量进行酶解，酶解时间为1.5h ;滤液离心速度为3500r/min。`
[0097] (3)原生质体诱变及变异菌株筛选
[0098] 将每株出发菌株的纯化后原生质体均分为4份，分别进行电子束诱变、6°C。- Y诱变、紫外线诱变、EMS诱变，诱变后筛选耐低温变异菌株，具体步骤与实施例1相同。与实施例I参数不同之处为:紫外线诱变剂量为35s，对应的致死率为62.18%;EMS浓度为2% (v/V)，对应的致死率为90.87%;电子束辐照剂量为550Gy，对应的致死率为67.81%; 60Co- Y射线辐照剂量为800Gy，对应的致死率为82.36%。
[0099] (4)原生质体灭活及融合
[0100] 变异菌株的原生质体等量混合后分成相等的两份，一份进行热灭活，另一份进行紫外线灭活。热灭活:变异菌株的原生质体悬液各取ImL移入无菌试管中，置于50°C恒温水浴中，分别保温处理4.5min进行热灭活。紫外线灭活:变异菌株的原生质体悬液各取ImL移入直径为6cm的无菌平皿中，置于已预热稳定的30w紫外灯下，垂直距离为30cm，照射105s,进行紫外线灭活。将两种方法灭活的原生质体悬液混合,3000r/min离心IOmin,收集原生质体，去除上清液后将原生质体悬浮于0.2mL渗透压稳定剂中，然后加入30°C预热的PEG融合剂1.8mL，调整融合剂pH为6.8，整PEG终浓度为38 %，30°C水浴保温60s后加入5mL渗透压稳定剂终止融合，并离心洗涤，去除融合剂。洗涤后的原生质体重新悬浮于渗透压稳定剂中，PDA再生平板再生培养。PEG用渗透压稳定剂配制，其中添加Ca2+(0.0lmol/LCaCl2)。
[0101] (5)菌株4轮重排
[0102] 变异菌株的原生质体灭活、融合后，再生平板培养法再生，32±0.5°C恒温培养3.5d。收集全部再生菌落接种于PDA培养基上32±0.5°C恒温培养4.5d，然后置于(TC下处理26h,再置于32±0.5°C恒温培养,仍然能生长的菌株为Fl代重排菌株；之后,将Fl代重排菌株全部收集，制备原生质体，并按同样方法进行第二轮融合、再生、(TC条件下处理30h，所得菌株即为第二轮耐低温融合子，即F2代重排菌株。原生质体融合、再生、低温处理反复进行4轮循环，每增加一代低温处理时间增加4h。选出每代的重排菌株，分别标记为F1、F2、F3、F4代重排菌株。
[0103] (6)重排菌株遗传稳定性鉴定
[0104] 将F4代重排菌株连续转接培养5代，每代都进行低温处理(0°C，40h)，到第5代耐低温性不变、生长速度不变且菌丝较密、健壮的菌株为最终筛选出的遗传性稳定的基因组重排菌株，即得到耐低温草菇菌株。
[0105] (7)重排菌株出菇实验及分子生物学鉴定
[0106]用栽培实验来检测重排菌株的出菇性能，方法同实施例1，在培养料面上出现大量草菇菌丝扭结团，少数的菌丝扭结团可发育成针头状的草菇原基，草菇原基生长很快，经2〜3d即可发育形成蛋形草菇，可采摘；选出菇性良好的I个菌株标记为VF2，其出菇结果如图6所示。用RAPD标记法鉴定，RAPD标记显示:菌株VF2与变异草菇菌株基因组有明显差异，表明选出的菌株VF2为基因组重排菌株，鉴定结果见图7，鉴定方法同实施例1。
[0107] (8)重排菌株耐低温性鉴定
[0108] 将栽培实验得到的草菇VF2子实体放在保鲜袋中于10°C低温条件下储藏，每间隔2h观察子实体有无软化。出发菌株中最耐低温的草菇菌株V23出现 子实体切面有水浸现象、子实体变软的储藏时间为16h，重排菌株子实体出现此现象时的储藏时间为26h，比出发菌株V23耐低温性提高了 62.5%。当储藏16h时，V23出现软化、水浸现象，而重组菌株VF2仍然具有较好的商品性，如图8所示。
[0109] 本实施例选育的耐低温草菇菌株VF2菌落5d长满平板，初期为白色，中期从中心向边缘逐渐变淡黄色，后期颜色加深变红，培养基出现红铁锈色；菌株VF2菌丝部分内生，气生菌丝较多，菌丝有隔，多分枝，菌丝直径4.52〜12.13 μ m,菌丝长23.83〜342.51 μ m，菌丝细胞内多核，细胞之间未见锁状联合；能正常出菇，菌丝在0°C条件下40h仍然有生命活力，子实体10°C条件下可储藏26h。
[0110] 实施例3
[0111] (I)出发菌株库构建
[0112] 出发菌株库的构建同实施例1。
[0113] (2)原生质体制备
[0114] 原生质体制备方法同实施例1。与实施例1参数不同之处为:菌丝液体培养时间为3d ;菌丝酶解时每250mg菌丝加ImL酶液量进行酶解，酶解时间为4h ;滤液离心速度为3000r/min。
[0115] (3)原生质体诱变及变异菌株筛选
[0116] 将每株出发菌株的纯化后原生质体均分为4份，分别进行电子束诱变、6ciCtj-Y诱变、紫外线诱变、EMS诱变，诱变后筛选耐低温变异菌株，具体步骤与实施例1相同。与实施例I参数不同之处为:紫外线诱变剂量为45s，对应的致死率为80.23%;EMS浓度为0.25%(v/v)，对应的致死率为53.76% ;电子束辐照剂量为650Gy，对应的致死率为81.19% ；60Co- Y射线辐照剂量为700Gy，对应的致死率为70.42%。
[0117] (4)原生质体灭活及融合
[0118] 变异菌株的原生质体等量混合后分成相等的两份，一份进行热灭活，另一份进行紫外线灭活。热灭活:变异菌株的原生质体悬液各取ImL移入无菌试管中，置于50°C恒温水浴中，分别保温处理5.5min进行热灭活。紫外线灭活:变异菌株的原生质体悬液各取ImL移入直径为6cm的无菌平皿中，置于已预热稳定的30w紫外灯下,垂直距离为30cm,照射95s,进行紫外线灭活。将两种方法灭活的原生质体悬液混合,3000r/min离心IOmin,收集原生质体，去除上清液后将原生质体悬浮于0.2mL渗透压稳定剂中，然后加入30°C预热的PEG融合剂1.8mL,调整融合剂pH为7.2，整PEG终浓度为32%，34°C水浴保温60s后加入5mL渗透压稳定剂终止融合，并离心洗涤，去除融合剂。洗涤后的原生质体重新悬浮于渗透压稳定剂中，PDA再生平板再生培养。PEG用渗透压稳定剂配制，其中添加Ca2+(0.0lmol/L CaCl2)。
[0119] (5)菌株4轮重排
[0120] 变异菌株的原生质体灭活、融合后，再生平板培养法再生，32±0.5°C恒温培养4.5d。收集全部再生菌落接种于PDA培养基上32±0.5°C恒温培养3.5d，然后置于(TC下处理30h，再置于32±0.5°C恒温培养，仍然能生长的菌株为Fl代重排菌株；之后，将Fl代重排菌株全部收集，制备原生质体，并按同样方法进行第二轮融合、再生、(TC条件下处理33h，所得菌株即为第二轮耐低温融合子，即F2代重排菌株。原生质体融合、再生、低温处理反复进行4轮循环，每增加一代低温处理时间增加3h。选出每代的重排菌株，分别标记为F1、F2、F3、F4代重排菌株。
[0121] (6)重排菌株遗传稳定性鉴定
[0122] 将F4代重排菌株连续转接培养5代，每代都进行低温处理(0°C，40h)，到第5代耐低温性不变、生长速度不变且菌丝较密、健壮的菌株为最终筛选出的遗传性稳定的基因组重排菌株，即得到耐低温草菇菌株。
[0123] (7)重排菌株出菇实验及分子生物学鉴定
[0124]用栽培实验来检测重排菌株的出菇性能，方法同实施例1，在培养料面上出现大量草菇菌丝扭结团，少数的菌丝扭结团可发育成针头状的草菇原基，草菇原基生长很快，经2〜3d即可发育形成蛋形草菇，可采摘；选出菇性良好的I个菌株标记为VF3，其出菇结果如图9所示。用RAPD标记法鉴定，RAPD标记显示:重排菌株VF3与变异草菇菌株基因组有明显差异，表明选出的VF3为基因组重排菌株，鉴定结果见图10，鉴定方法同实施例1。
[0125] (8)重排菌株耐低温性鉴定
[0126] 将草菇子实体VF3放在保鲜袋中于10°C低温条件下储藏，每间隔2h观察子实体有无软化。出发菌株中最耐低温的草菇菌株V23出现子实体切面有水浸现象、子实体变软的储藏时间为16h，重排菌株子实体出现此现象时的储藏时间为25.5h，比出发菌株V23耐低温性提高了 59.37%。当储藏16h时，V23出现软化、水浸现象，而重组菌株仍然具有较好的商品性，如图11所不。
[0127] 本实施例选育的耐低温草菇菌株VF3菌落4d长满平板，初期为白色，中期从中心向边缘逐渐变淡黄色，后期颜色加深变红，培养基出现红铁锈色；菌株VF3菌丝部分内生，气生菌丝较多，菌丝有隔，多分枝，菌丝直径4.37〜10.52 μ m,菌丝长23.27〜316.84 μ m，菌丝细胞内多核，细胞之间未见锁状联合；能正常出菇，菌丝在0°c条件下38h仍然有生命活力，子实体10°C条件下可储藏25.5h。
[0128] 本发明挑选出出菇性能、耐低温性能最好的I株耐低温草菇菌株，即实施例1选育出的菌株SVF-4进行生物保藏，其生物保藏号为CCTCC NO:M2013207，保藏日期为2013年5月15日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编:430072o.
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