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一种用于眼表治疗的生物羊膜及其制备方法

阅读：811发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种用于眼表治疗的生物羊膜及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开一种用于眼表治疗的生物羊膜及其制备方法。用于眼表治疗的生物羊膜是以羊膜为原料，经快速取材、快速裁切以及辐照灭菌步骤制成。本发明的有益技术效果是：(1)可有效保留羊膜各种天然活性成分；(2)有效保留羊膜各种天然活性成分的抗炎症抗瘢痕的天然功效；(3)在保留羊膜天然活性成分及这些成分的活性功效的同时，还能保证最终制备得到的生物羊膜的无菌水平及病毒灭活效果，确保了生物羊膜的生物安全性；(4)既满足组织损伤修复保护材料的需求，又可有效发挥治疗早期促进上皮化，同时避免了材料过早降解达不到治疗目的和过慢降解对正常组织产生不良刺激。，下面是一种用于眼表治疗的生物羊膜及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其特征在于，包括的步骤如下：
(1)快速取材
在1～3分钟内将胎盘之外的羊膜取得，将羊膜放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体1～10分钟内完成降温至2～10℃冷藏；
所述快速取材由羊膜取材装置实现，所述羊膜取材装置包括中空的漏斗状壳体和粗端大切刀，所述漏斗状壳体的粗端的安装粗端大切刀，所述粗端大切刀上设置可拆卸的保护罩；
(2)快速裁切
将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，在1～3分钟内裁剪为羊膜膜片，装入含有质量百分比浓度为50％～90％的甘油水溶液包装袋中；
所述快速剪切由冲压羊膜剪裁装置实现，所述羊膜裁切装置，包括平板载体和裁刀，所述裁刀均匀排列、固定在所述平板载体一侧表面上；
(3)辐照灭菌
将(2)步骤处理后的羊膜膜片，在-25～-4℃的低温保护条件下，采用电离辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品；
所述羊膜取材装置包括：中空的漏斗状壳体、细端小切刀和粗端大切刀，所述漏斗状壳体的粗端端部安装粗端大切刀，所述漏斗状壳体的细端设置细端小切刀，所述细端小切刀的侧壁设置开口；当下压时可使细端小切刀呈中心辐射状散开，通过旋转漏斗状壳体即可利用辐射状细端小切刀将胎盘上的羊膜与胎盘分离；在所述细端小切刀外侧设置可拆卸的固定带，用于固定所述细端小切刀；所述细端小切刀为若干刀片单元可拆卸的安装于漏斗状壳体细端的端部；相邻刀片单元之间设置开口；所述粗端大切刀上设置可拆卸的保护罩，所述保护套可将粗端大切刀完全嵌套覆盖，作为下压旋转细端小切刀时人员手握部位；
所述羊膜取材装置中，所述漏斗状壳体的长度为15～25cm；壁厚度为2～5mm；所述细端小切刀直径2～5cm，长度15～30cm，厚度0.2～0.5mm，用于供环切脐带周围羊膜之用；所述开口长度为15～30cm，用于下压旋转漏斗状壳体对脐带周围羊膜环切；所述粗端大切刀的直径15～30cm、长度1～2cm、厚度2～5mm，用于迅速裁切胎盘边缘之羊膜；
所述(2)步骤中采用新型羊膜裁剪装置裁剪羊膜膜片，所述羊膜裁切装置，包括平板载体和裁刀，若干所述裁刀排列固定在所述平板载体一侧表面上；所述裁刀的边长为11～
70mm，厚度为0.1～0.5mm。
2.按照权利要求1所述的一种用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述电离辐射是伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为20～30kGy，辐照后立即将生物羊膜产品置于-90～-10℃下冷藏保存。
3.按照权利要求1或者2所述的一种用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述裁刀的刀口形状为正方形、三角形、圆形、梯形或矩形；使用时手持平板将裁刀面向羊膜，迅速下压。

说明书全文

一种用于眼表治疗的生物羊膜及其制备方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及医用材料领域，具体涉及一种用于眼表治疗的生物羊膜及其制备方法。【背景技术】

[0002] 羊膜从细胞滋养层衍化而来，是人两层胎膜的内层，由上皮细胞层，基底膜和无血管基质组成。新鲜羊膜中包含多种胶原蛋白以及层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸等，这些活性物质可以促进上皮细胞的黏附移行，诱导上皮分化，防止上皮凋亡；羊膜细胞及基质中还包含多种生长因子，如神经生长因子(NGF)，肝细胞生长因子(HGF)，角质细胞生长因子(KGF)，转化生长因子-α(TGF-α)，转化生长因子-β1(TGF-β1)，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；此外，羊膜细胞及基质中还包含抑制血管生成、抗炎的蛋白以及一些天然蛋白酶抑制因子，这些因子成分能够促进上皮生长、抑制炎性反应、抑制纤维组织过度增生和新生血管形成。

[0003] 羊膜移植在多种疾病、损伤治疗过程中所起到的良好作用在大量研究中都得到了证实。大量研究报道证明：羊膜中所含的这些丰富的活性物质、营养成分、各种生长因子，以及基底膜结构等特性是羊膜在组织工程领域得到广泛应用的基础。羊膜具有良好的生物相容性，异体移植后几乎不产生免疫排斥反应，因此羊膜可以作为一种理想的组织工程修复材料，针对不同的组织损伤，通过不同的方式处理，用于多种组织损伤的治疗和修复。

[0004] 由于新鲜羊膜和冷藏羊膜能够最大程度保留各种天然胶原及活性因子成分，因此临床使用效果较好。但这类羊膜未经病毒灭活处理，存在病毒传播隐患。目前国内羊膜产品，多为经过冻干、风(晾)干、脱细胞等多种复杂处理过程的产品。这些产品在反复冻融、干燥和脱细胞等工艺处理过程中，损失了大量有效成分，并且制备工艺存在多种诱导蛋白质变性因素(如冷冻保护剂及冻干保护剂的选择，冷冻速率的选择等)，容易造成蛋白质变性、羊膜各种理化性能降低，从而直接导致羊膜在手术中易撕裂，需要反复更换，延长手术时间；术后炎症反应强烈，羊膜快速降解。尤其是某些生产工艺经脱细胞、反复清洗等高强度处理，羊膜损失大量天然胶原及活性因子，对羊膜临床使用效果造成了极为不利的影响。

[0005] 公开号为US006152142A和US006326019B1的美国专利公开的羊膜产品是将剖腹产胎盘清洗干净后钝性分离去除绒毛膜，上皮向上平铺在硝酸纤维滤纸上，之后保存于DMEM︰甘油按1:1比例配制的保存液中，并于-80℃冰箱中冻存。所制备的羊膜未经脱细胞、干燥和灭菌处理，因此较好地保留了羊膜成分与结构的完整性；但长期深低温保存成本较高，并且其未对羊膜进行灭菌和病毒灭活处理，临床使用安全性得不到保障。

[0006] 专利申请号为201010113960.0的中国发明专利申请公开了一种在低温下(-20～4℃)使用基质胶对羊膜基质进行重建及修复，采用有色染料染色，铺膜、干燥后用钴60消毒，从而较好地保存了羊膜上皮及基底，但在低于零度条件下进行羊膜基质重建，最终干燥保存，不仅工艺复杂，而且羊膜结构会受到一定程度的破坏，机械性能降低，影响临床使用；羊膜制备过程中，经过多次漂洗，羊膜中有效成分随洗液大量流失，降低了临床使用效果。

[0007] 申请号为CN03150838.3、CN200480023933.7和200410075361.9的中国发明专利申请中公开了一种可常温保存的生物羊膜的制备方法，是将胎盘的绒毛膜钝性分离，清洗后铺在硝酸纤维素滤纸上，经冷冻干燥后包装，钴60辐照灭菌。所制备的羊膜，与上述专利方法类似，经过了冷冻干燥，在一定程度上对羊膜造成了破坏，使其变脆，在临床使用中容易撕裂；

[0008] 综上所述，如何保护羊膜结构的不被破坏，最大程度保留新鲜羊膜中的各类有效成分，并且保证其安全性，使其能够有效应用于临床，是制备生物羊膜应用于眼表治疗需要解决的关键问题。【发明内容】

[0009] 本发明的目的在于针对以上所述现有技术存在的不足，提供一种用于眼表治疗的生物羊膜，能完整保留新鲜羊膜的天然结构和活性成分，保留相同治疗效果，并确保生物羊膜无任何病毒传播隐患。

[0010] 本发明的另一目的是提供一种用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法。

[0011] 为了实现上述目的，本发明是这样实现的：用于眼表治疗的生物羊膜，以羊膜为原料，经快速取材、快速裁切以及辐照灭菌步骤制成，其厚度为0.02-0.1mm。

[0012] 一种用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，是以羊膜为原料，经快速取材、快速裁切以及辐照灭菌步骤，最终得到生物羊膜；其包括的具体步骤如下：

[0013] (1)快速取材

[0014] 在1～3分钟内将胎盘之外的羊膜取得，将新鲜羊膜放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体1～10分钟内完成降温至2～10℃冷藏，并于1小时内运输至洁净车间进行后续处理；

[0015] (2)快速裁切

[0016] 将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，在1～3分钟内裁剪为羊膜膜片，装入含有质量百分比浓度为50％～90％的甘油水溶液包装袋中，密封；

[0017] (3)辐照灭菌

[0018] 将(2)步骤处理后的羊膜膜片，在-25～-4℃的低温保护条件下，采用电离辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品；采用低温保护进行辐照灭菌，既能达到无菌医疗器械产品的无菌水平要求，又能同时灭活各种病毒，并且能最大程度保护生物羊膜的活性，尽可能维持其天然的抗炎症、抗瘢痕和引导上皮化的能力，使其最终得以有效应用于眼表损伤治疗。

[0019] 所述电离辐射可以是伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为20～30kGy，辐照后立即将生物羊膜产品置于-90～-10℃下冷藏保存。

[0020] 所述(1)步骤中采用羊膜取材装置进行取材，所述羊膜取材装置包括中空的漏斗状壳体和粗端大切刀，所述漏斗状壳体的粗端的安装粗端大切刀，所述粗端大切刀上设置可拆卸的保护罩，可将粗端大切刀完全嵌套覆盖。可在极短时间内完成羊膜的取材，避免羊膜长时间暴露于常温条件造成羊膜活性的降低，保证羊膜抑制瘢痕降低炎症的功效；也可有效避免剥离时对羊膜造成的损伤及破坏。

[0021] 所述(2)步骤中采用羊膜裁剪装置裁剪羊膜膜片，所述羊膜裁切装置，包括平板载体和裁刀，若干所述裁刀排列固定在所述平板载体一侧表面上；所述裁刀的边长为11～70mm，厚度为0.1～0.5mm。可以在极短时间内将所取羊膜迅速裁剪为所需大小形状，进一步有效避免羊膜长时间暴露于常温条件造成羊膜活性的降低，保证羊膜植入后的抗瘢痕抗炎症的能力。

[0022] 所述羊膜膜片的长度为10～70mm，宽度为10～70mm的矩形或正方形，也可裁剪为类似大小的梯形、圆形、三角形羊膜膜片。

[0023] 本发明得到的生物羊膜，在确保生物羊膜的生物安全性的同时，有效保留及发挥羊膜的天然活性功能，应用于眼表损伤时可引导上皮生长，抑制新生血管长入角膜，后期抑制瘢痕形成，可有效形成长期物理屏障保护创面，具有极好的临床应用前景。

[0024] 上述羊膜取材装置，可使胎盘之外的羊膜迅速裁切取得，减少羊膜取材所需操作时间。本发明之羊膜裁切装置，通过多个均匀排列的小型裁刀冲压裁切羊膜，可迅速将羊膜裁切为所需规格及大小，大大减少羊膜裁切所需操作时间。经本发明人验证，在操作人员具有长时间羊膜裁剪经验的条件下，采用手工操作利用普通刀具对所取得的一张羊膜进行裁切，需要1～2小时才能裁切完成，而且较难保证所裁切羊膜的大小均一满足要求。

[0025] 与现有产品相比，本发明的有益技术效果是：

[0026] (1)整体工艺处理强度低，采用低温保护处理，可有效保留羊膜各种天然活性成分，包括胶原、生长因子、抗炎因子等；对本发明生物羊膜进行上述成分的检测，结果表明本发明制备的生物羊膜与新鲜羊膜的各种天然活性成分含量相差较小，说明本发明制备方法能够有效保留羊膜的各种天然成分；

[0027] (2)采羊膜取材装置和羊膜裁切装置，可在最短的时间内完成羊膜从取材到灭菌的整个过程处理(灭菌前操作时间最短可为1～2小时)，并采用低温保护辐照灭菌有效保留羊膜各种天然活性成分的抗炎症抗瘢痕的天然功效；通过生物羊膜进行相关体外体内实验检测，结果表明本发明制备的生物羊膜具有与新鲜羊膜同等的生物活性；

[0028] (3)在保留羊膜天然活性成分及这些成分的活性功效的同时，还能保证最终制备得到的生物羊膜的无菌水平及病毒灭活效果，保证了生物羊膜作为医疗器械使用的基本要求得以满足，确保了生物羊膜的生物安全性；低温保护辐照灭菌方法经辐照灭菌病毒灭活工艺验证，可完全保证各类病毒(如HIV、HBV、HCV、梅毒等)灭活，极大地提高了临床使用的安全性；

[0029] (4)用于眼表损伤修复的生物羊膜，降解速度与损伤修复速度相匹配，既满足组织损伤修复保护材料的需求，又可有效发挥治疗早期促进上皮化，后期抑制瘢痕形成的治疗功效，同时避免了材料过早降解达不到治疗目的和过慢降解对正常组织产生不良刺激。【附图说明】

[0030] 图1是羊膜取材装置的立体结构示意图；

[0031] 图2是羊膜冲压裁剪装置的立体结构示意图；

[0032] 图3是本发明制备得到的生物羊膜与新鲜羊膜主要成分定量检测对比结果图；

[0033] 图4是本发明制备得到的生物羊膜与新鲜羊膜缝合强度检测对比结果图；

[0034] 图5是本发明制备得到的生物羊膜与新鲜羊膜体外降解性能检测对比结果图；

[0035] 图6是本发明制备得到的生物羊膜体外细胞毒性检测结果图；

[0036] 图7是本发明制备得到的生物羊膜体外淋巴细胞增殖检测结果图；

[0037] 图8是本发明制备得到的生物羊膜用于兔眼表化学烧伤修复结果图。【具体实施方式】

[0038] 以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细的描述说明。

[0039] 实施例1

[0040] 用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其步骤如下：

[0041] (1)快速取材

[0042] 采用羊膜取材装置在1分钟内快速取得胎盘之外的羊膜，将所取新鲜羊膜迅速放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体1分钟内完成降温至10℃冷藏，并于1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

[0043] (2)快速裁切

[0044] 将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用羊膜裁剪装置在1分钟内将羊膜裁剪为长度为70mm，宽度70mm的正方形羊膜膜片，再将裁剪得到的羊膜膜片装入含有少量质量百分比浓度为50％的甘油水溶液包装袋中，密封。

[0045] (3)辐照灭菌

[0046] 将(2)步骤处理后的羊膜，在-25℃的低温保护条件下，采用20kGy高能电子束辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品。辐照后立即将生物羊膜产品置于-90℃下冷藏保存。

[0047] 本实施例制备得到的生物羊膜具有良好的生物相容性，体外细胞毒性及体外淋巴细胞增殖实验检测结果显示如图6和图7所示，生物羊膜无体外细胞毒性，无刺激或抑制淋巴细胞的免疫原性，作为眼表治疗具有良好的安全性保证。

[0048] 实施例2

[0049] 用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其步骤如下：

[0050] (1)快速取材

[0051] 采用羊膜取材装置在3分钟内快速取得胎盘之外的羊膜，将所取新鲜羊膜迅速放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体10分钟内完成降温至2℃冷藏，并于1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

[0052] (2)快速裁切

[0053] 将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用本公司发明的冲压羊膜裁剪装置，在3分钟内将羊膜裁剪为长度为10mm，宽度为15mm的矩形羊膜膜片，再将裁剪得到的羊膜膜片装入含有少量质量百分比浓度为60％的甘油水溶液包装袋中，密封。

[0054] (3)辐照灭菌；

[0055] 将(2)步骤处理后的羊膜，在-4℃的低温保护条件下，采用30kGy伽马射线辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品；辐照后立即将生物羊膜产品置于-10℃下冷藏保存。

[0056] 本实施例制备得到的生物羊膜，可有效保留羊膜各类天然有效成分，经试剂盒定量检测，结果显示生物羊膜所保留的各类活性成分，如图3所示，与新鲜羊膜相比无明显差异，作为眼表治疗具有良好的临床应用前景。

[0057] 实施例3

[0058] 用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其步骤如下：

[0059] (1)快速取材

[0060] 采用羊膜取材装置在2分钟内快速取得胎盘之外的羊膜，将所取新鲜羊膜迅速放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体5分钟内完成降温至6℃冷藏，并于1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

[0061] (2)快速裁切

[0062] 将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用本公司发明的冲压羊膜裁剪装置，在2分钟内将羊膜裁剪为直径为50mm的圆形羊膜膜片，再将裁剪得到的羊膜膜片装入含有少量质量百分比浓度为90％的甘油水溶液包装袋中，密封。

[0063] (3)辐照灭菌；

[0064] 将(2)步骤处理后的羊膜，在-16℃的低温保护条件下，采用25kGy伽马射线辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品；辐照后立即将生物羊膜产品置于-25℃下冷藏保存。

[0065] 本实施例制备得到的生物羊膜，可有效保留羊膜天然胶原结构，保留新鲜羊膜较好的机械性能及降解性能，对新鲜羊膜及本实施例制备得到的生物羊膜采用拉力测定仪进行缝合强度检测，采用体外降解实验检测不同降解时间点的降解产物含量，结果表明本实施例制备得到的生物羊膜缝合强度及体外降解性能与新鲜羊膜无显著差异(参见图4和图5)，具有良好的临床应用前景。

[0066] 实施例4

[0067] 用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其步骤如下：

[0068] (1)快速取材

[0069] 采用(1)羊膜取材装置在3分钟内快速取得胎盘之外的羊膜，将所取新鲜羊膜迅速放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体8分钟内完成降温至8℃冷藏，并于1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

[0070] (2)快速裁切

[0071] 将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用本公司发明的冲压羊膜裁剪装置，在2分钟内将羊膜裁剪为长度为70mm，宽度为40mm，高为40mm的梯形羊膜膜片。将裁剪得到的羊膜膜片装入含有少量质量百分比浓度为80％的甘油水溶液包装袋中，密封。

[0072] (3)辐照灭菌

[0073] 将(2)步骤处理后的羊膜，在-10℃的低温保护条件下，采用高能电子束辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品；辐照后立即将生物羊膜产品置于-80℃下冷藏保存。

[0074] 本实施例制备得到的生物羊膜，可有效保留羊膜天然生物活性，具有新鲜羊膜的抗炎症、抗血管化、抗瘢痕、促进愈合的作用，经兔眼化学烧伤模型动物实验检测，结果显示术后治疗效果显著，羊膜降解速度与损伤修复速度相匹配，兔眼角膜无血管化瘢痕形成，透明清洗，无炎症无排异反应，具有极佳的治疗作用(参见图8)。

[0075] 实施例5

[0076] 用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其步骤如下：

[0077] (1)快速取材

[0078] 采用羊膜取材装置在1分钟内快速取得胎盘之外的羊膜，将所取新鲜羊膜迅速放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体3分钟内完成降温至9℃冷藏，并于1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

[0079] (2)快速裁切

[0080] 将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用本公司发明的冲压羊膜裁剪装置，在3分钟内将羊膜裁剪为边长为10mm的三角形羊膜膜片，再将裁剪得到的羊膜膜片装入含有少量质量百分比浓度为75％的甘油水溶液包装袋中，密封。

[0081] (3)辐照灭菌

[0082] 将(2)步骤处理后的羊膜，在-20℃的低温保护条件下，采用伽马射线辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品；辐照后立即将生物羊膜产品置于-60℃下冷藏保存。

[0083] 本实施例制备的生物羊膜在低温下裁切灭菌，冷藏保存，可有效保证生物羊膜所含有的羊膜天然有效成分及活性，在眼表临床应用具有良好的应用前景。

[0084] 实施例6

[0085] 用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其步骤如下：

[0086] (1)快速取材

[0087] 采用羊膜取材装置在2分钟内快速取得胎盘之外的羊膜，将所取新鲜羊膜迅速放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体4分钟内完成降温至7℃冷藏，并于1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

[0088] (2)快速裁切；

[0089] 将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用本公司发明的冲压羊膜裁剪装置，在2分钟内将羊膜裁剪为长度为45mm，宽度为55mm的矩形羊膜膜片，再将裁剪得到的羊膜膜片装入含有少量质量百分比浓度为50％的甘油水溶液包装袋中，密封。

[0090] (3)辐照灭菌；

[0091] 将(2)步骤处理后的羊膜，在-8℃的低温保护条件下，采用28kGy伽马射线辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品；辐照后立即将生物羊膜产品置于-16℃下冷藏保存。

[0092] 本实施例制备得到的生物羊膜，可完全灭活各种病毒，经病毒灭活工艺验证实验检测，病毒灭活效果均能达到4-6个log以上，确保各类病毒灭活。

[0093] 实施例7

[0094] 用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其步骤如下：

[0095] (1)快速取材

[0096] 采用羊膜取材装置在1分钟内快速取得胎盘之外的羊膜，将所取新鲜羊膜迅速放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体1分钟内完成降温至10℃冷藏，并于1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

[0097] (2)快速裁切

[0098] 将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用羊膜裁剪装置在1分钟内将羊膜裁剪为长度为70mm，宽度70mm的正方形羊膜膜片，再将裁剪得到的羊膜膜片装入含有少量质量百分比浓度为65％的甘油水溶液包装袋中，密封。

[0099] (3)辐照灭菌

[0100] 将(2)步骤处理后的羊膜，在-18℃的低温保护条件下，采用25kGy高能电子束辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品。辐照后立即将生物羊膜产品置于-80℃下冷藏保存。

[0101] 实施例8

[0102] 用于眼表治疗的生物羊膜的制备方法，其步骤如下：

[0103] (1)快速取材

[0104] 采用(1)羊膜取材装置在3分钟内快速取得胎盘之外的羊膜，将所取新鲜羊膜迅速放入预装无菌生理盐水的运输瓶中，在羊膜脱离母体8分钟内完成降温至8℃冷藏，并于1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

[0105] (2)快速裁切

[0106] 将(1)步骤取得的羊膜，上皮面向上，铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用本公司发明的冲压羊膜裁剪装置，在3分钟内将羊膜裁剪为长度为15mm，宽度为10mm的矩形羊膜膜片。将裁剪得到的羊膜膜片装入含有少量质量百分比浓度为50％的甘油水溶液包装袋中，密封。

[0107] (3)辐照灭菌

[0108] 将(2)步骤处理后的羊膜，在-10℃的低温保护条件下，采用高能电子束辐射灭菌处理，即得到生物羊膜产品；辐照后立即将生物羊膜产品置于-80℃下冷藏保存。

[0109] 以下各实例中羊膜是产妇签署知情同意书后，从废弃顺产或剖腹产胎盘裁切剥离取得的，为脱离活体的废弃品。

[0110] 所述羊膜快速取材装置，如图1所示，包括中空的漏斗状壳体1、细端小切刀2和粗端大切刀5，所述漏斗状壳体1的粗端端部安装粗端大切刀5，所述漏斗状壳体1的细端设置细端小切刀2，所述细端小切刀2的侧壁设置开口4；当下压时可使细端小切刀2呈中心辐射状散开，通过旋转漏斗状壳体1即可利用辐射状细端小切刀2将胎盘上的羊膜与胎盘分离。在所述细端小切刀2外侧设置可拆卸的固定带3，用于固定所述细端小切刀2。所述细端小切刀2为若干刀片单元可拆卸的安装于漏斗状壳体1细端的端部。相邻刀片单元之间设置开口
4。所述粗端大切刀5上设置可拆卸的保护罩6，所述保护套6可将粗端大切刀完全嵌套覆盖，作为下压旋转细端小切刀时人员手握部位。其中，所述漏斗状壳体1的长度为15～25cm；壁厚度为2～5mm。所述细端小切刀2直径2～5cm，长度15～30cm，厚度0.2～0.5mm，用于供环切脐带周围羊膜之用。所述开口4长度为15～30cm，用于下压旋转漏斗状壳体对脐带周围羊膜环切。所述粗端大切刀5的直径15～30cm、长度1～2cm、厚度2～5mm，用于迅速裁切胎盘边缘之羊膜。所述漏斗状壳体1、粗端大切刀5和细端小切刀2材质均为不锈钢；保护罩6材质为医用级PMMA塑料或高密度聚四氟乙烯塑料；固定带4材质为医用硅橡胶。

[0111] 本发明在使用时先手持漏斗状壳体1，卸掉所述粗端大切刀5上的保护罩6，下压粗端大切刀5裁切胎盘边缘羊膜交界处，去除胎盘之外所有羊膜，装好粗端保护罩6。然后用固定带3固定细端，将脐带从细端小切刀2穿入，从粗端大切刀5穿出，手持粗端保护罩6及部分漏斗状壳体1，下压旋转漏斗状壳体1对脐带周围羊膜环切，完成后卸除固定带3，再手持粗端保护罩6及部分壳体1，将细端小切刀2对准羊膜环切切口下压漏斗状壳体1，使细端小切刀2呈中心辐射状散开，再旋转漏斗状壳体1即可利用辐射状细端小切刀2将胎盘上的羊膜与胎盘分离，得到胎盘之上羊膜。

[0112] 采用本发明可大大缩短剥离取材胎盘之上羊膜的操作时间，平均1～3分钟内即可完成操作。相比之前在操作人员经过较长时间培训及实际操作的条件下，仅用手工操作将胎盘之上羊膜从胎盘完整剥离，至少需要10～30分钟；使用本发明可大大提高操作效率，有效缩短羊膜取材时间。

[0113] 如图2所示，所述冲压羊膜裁剪装置包括平板载体7和裁刀8，若干所述裁刀8排列固定在所述平板载体7一侧表面上。所述平板载体7的边长尺寸为20～30cm，厚度为2～10mm。相邻所述裁刀8之间的最小间距为0.1～0.5mm。所述裁刀8的边长为3～10mm，厚度为
0.1～0.5mm。所述平板载体7和裁刀8材质均为不锈钢。所述裁刀的刀口形状可为正方形、三角形、圆形、梯形或矩形。使用本装置时，先将羊膜及滤纸平铺于低温操作台，然后手持平板
7将裁刀8面向羊膜，迅速向下冲压即可将羊膜裁切为所需规格及形状。优选的，所述平板载体7的边长尺寸为23～28cm，厚度为4～6mm。相邻所述裁刀8之间的最小间距为0.2～0.4mm。
所述裁刀8的边长为25～45mm，厚度为0.2～0.4mm。最优的，所述平板载体7的边长尺寸为
25cm，厚度为5mm。相邻所述裁刀8之间的最小间距为0.3mm。所述裁刀8的边长为30mm，厚度为0.3mm。上述尺寸在裁切时最节省，且能符合手术的各种要求。所述裁刀的刀口形状可为正方形、三角形、圆形、梯形或矩形。

[0114] 本发明的使用方法是通过多个均匀排列的小型裁刀冲压裁切羊膜，可迅速将羊膜批量裁切为所需规格及大小，大大减少羊膜裁切所需操作时间，在1～3分钟内将一张羊膜裁切为临床适用规格及大小的羊膜，操作快速，裁切得到羊膜也适用于临床手术需求，满足产业化规模化生产的需求。

[0115] 以下针对上述实施例，结合实验数据、附图资料进行分析：

[0116] 图3是本发明制备得到的生物羊膜与新鲜羊膜主要成分定量检测对比结果图。图中COLⅠ为Ⅰ型胶原，COLⅢ为Ⅲ型胶原，COLⅣ为Ⅳ型胶原，bFGF为碱性成纤维细胞生长因子，EGF为表皮生长因子，TIMP为金属蛋白酶组织抑制因子，HGF为肝细胞生长因子，KGF为角质生长因子。BA代表本发明制备的生物羊膜，FAM代表新鲜羊膜。通过图片显示可以看出生物羊膜所包含的各类天然胶原及因子成分含量与天然新鲜羊膜无明显差异。

[0117] 图4是本发明制备得到的生物羊膜与新鲜羊膜缝合强度检测对比结果图。图中样品编号1，2为本发明制备的生物羊膜，3，4为新鲜羊膜。图片显示可以看出本发明制备的生物羊膜与新鲜羊膜具有接近等同的缝合强度。

[0118] 附图5是本发明制备得到的生物羊膜与新鲜羊膜体外降解性能检测对比结果图。图中Hyp为羊膜体外降解产物羟脯氨酸，time为降解时间，FAM为新鲜羊膜，BA为本发明制备的生物羊膜。图片显示可以看出本发明制备得到的生物羊膜与新鲜羊膜降解性能无明显差异。

[0119] 图6是本发明制备得到的生物羊膜体外细胞毒性检测结果图。图中BA代表本发明制备的生物羊膜，CK代表空白对照组，PE代表高密度聚乙烯阴性对照组，DMSO代表二乙烯基砜阳性对照组。纵坐标百分率表示L929细胞的体外培养增殖率。图片显示可以看出生物羊膜与空白对照组及阴性对照组的体外细胞增殖率无显著差异，均在100％左右。而阳性对照组细胞增殖率低于20％，表明生物羊膜具有良好的体外细胞相容性。

[0120] 图7是本发明制备得到的生物羊膜体外淋巴细胞增殖检测结果图。图中BA代表本发明制备的生物羊膜，CK代表空白对照组，FAM代表新鲜羊膜。纵坐标百分率表示人淋巴细胞体外培养增殖率。图片显示可以看出生物羊膜以及新鲜羊膜组与空白对照组相比，均未引起人淋巴细胞体外异常增殖或凋亡，表明生物羊膜具有良好的免疫原性。

[0121] 图8是本发明制备得到的生物羊膜应用于兔眼表烧伤治疗的每个重要观察时间点修复情况对比结果图。图中A为兔眼烧伤造模后兔眼表外观，B为对烧伤区域进行清创处理后的兔眼表外观，C为缝合本发明制备的生物羊膜后的兔眼表外观，D为经本发明制备的生物羊膜治疗一个月后的兔眼表外观。图片显示可以看出生物羊膜在术后即表现出良好的治疗效果，兔眼炎性反应降低，迅速完成上皮化，未发生后期瘢痕或血管增生，羊膜降解速率与组织修复速率相匹配，最终角膜修复结果与健康眼无显著性差异。

[0122] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案，均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。

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