一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法
专利汇可以提供一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于研究 蛋白质 结构或蛋白质相互作用的分析方法。使用两侧具有反应活性基团且具有可断裂基团的交联剂将细胞内蛋白质 复合体 进行交联并酶解，取一部分酶解产物进行衍生化反应后进入质谱分析；另一部分酶解产物使用化学法断裂交联剂后，使用富集材料将肽段进行富集，将富集出的肽段洗脱后进入质谱分析，根据搜库结果可确定发生交联的肽段，从而建立肽段库。通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端 氨 基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。该方法具有操作简便等优点并应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用的分析。，下面是一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法专利的具体信息内容。
1.一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法，其特征在于：使用可化学断裂的交联剂对细胞或提取的蛋白质样品进行交联，将蛋白质样品进行酶解后，一部分酶解产物进行衍生化反应后进入质谱分析，通过软件分析质谱谱图可挑选出含交联肽段的谱图，同时获取交联肽段的m/z及发生交联的肽段的N端氨基酸信息；将另一部分酶解产物使用化学法断裂交联剂后，使用富集材料将肽段进行富集，将富集出的肽段洗脱后进入质谱分析，根据搜库结果可确定发生交联的肽段，从而建立肽段库；通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息；
具体包括：
(1)对于细胞样品，使用缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮；对于已提取出的蛋白样品，使用水或缓冲液配制成溶液；对于交联剂，使用水、缓冲液或有机溶剂配制成溶液；
(2)将交联剂溶液加入至细胞样品溶液或蛋白样品溶液中进行反应；
(3)对于细胞样品，离心弃去反应体系中的反应液，然后对细胞样品进行裂解，得交联蛋白样品；对于蛋白样品，向反应体系中加入反应终止液，或通过透析、滤膜或凝胶去除反应液，得交联蛋白样品；
(4)采用pH为1-6.5的酸性缓冲溶液或pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有离子液体、表面活性剂、去垢剂或有机溶剂的溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原；
(5)加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解，并将酶解产物分成两份进行除盐并冻干；
(6)取出步骤(5)中一份冻干的酶解产物，对肽段末端氨基进行衍生反应，对衍生物进行样品分级，除盐，冻干并重溶进行质谱分析；
(7)取出步骤(5)中另一份冻干的酶解产物，向内加入交联剂断裂剂溶液将酶解产物中的交联剂进行断裂；
(8)步骤(7)反应结束后，使用终止剂终止断裂反应，或通过透析、滤膜、凝胶中的一种或者二种以上方法去除交联剂断裂剂溶液；
(9)向步骤(8)的产物中加入带有能与交联剂断裂生成基团发生共价键合基团的富集材料，并反应；
(10)使用洗脱液洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；
(11)使用溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶进行质谱分析和数据检索；
(12)由步骤(6)中得到的交联肽段的质谱谱图中挑选出含交联肽段的谱图，并通过谱图中的a1离子得到对应的N端氨基酸，由步骤(11)中得到的富集出的肽段的搜库结果可建立肽段库，通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的缓冲液为pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含能与所用交联剂上反应基团反应的基团；
步骤(1)中所述的细胞样品，为胰酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品；步骤(1)中所述的蛋白样品，为单一蛋白样品或二种以上蛋白的混合蛋白样品，配制的蛋白质量与溶液的体积比为1μg/mL-100mg/mL；步骤(1)中所述的交联剂，为两侧含有与蛋白反应的基团，且连接臂上含有化学断裂基团的交联剂，配制的交联剂浓度为1μM-1M；
步骤(1)中所述的有机溶剂，为乙腈、有机醇类、有机酸类、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中的一种或二种以上。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的交联剂，为两侧具有与蛋白上氨基反应的活性基团的化学物，活性基团为琥珀酰亚胺基团(磺酸基-琥珀酰亚胺、羟基-琥珀酰亚胺等)、卤代芳烃基团、亚胺酸酯基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上巯基反应的活性基团的化学物，活性基团为马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶基团、硫代磺酸基团、卤代乙酰基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上羧基反应的活性基团的化学物，活性基团为碳二亚胺基团、异氰酸基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上糖链反应的活性基团的化学物，活性基团为酰肼基团、氨基基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上任意基团反应的活性基团的化学物，活性基团为苯基叠氮基团(硝基苯叠氮基团、卤代苯叠氮基团)、双吖丙啶基团中的一种或二种；所述的交联剂，其两侧基团分别为上述任一反应基团；所述的交联剂，其连接臂上的化学断裂基团，为经氧化断裂的邻二羟基基团；或为碱性/盐酸羟胺断裂的酯类基团。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的反应体系中细胞浓度为
106-109个/mL，蛋白浓度为1nM-1mM，交联剂的浓度为10nM-100mM；所述的反应条件为15-40℃反应10min-2h或0-10℃反应10min-10h。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的反应终止液为具有能与交联剂两侧反应基团反应的基团的物质；所述的反应条件为15-40℃反应10min-2h或0-10℃反应10min-10h。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的细胞裂解方法为机械裂解或高温孵育法等裂解方法中的一种或二种以上；
上述机械裂解方法，具体为在蛋白质提取液与生物样本的混合物中加入蛋白酶抑制剂后，使用匀浆器、超声仪、研钵或组织捣碎机等对组织或细胞样品进行裂解；
上述蛋白酶抑制剂为下列物质中的一种或二种以上：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、抑肽酶、抑氨肽酶、焦磷酸钠、反-环氧丁二酰基-L-亮氨酰胺基(4-胍基)丁烷、乙二胺四乙酸二钠、亮抑蛋白酶肽或胃酶抑素A、本甲磺酰基氟化物中的一种或二种以上；
上述物质中每种蛋白酶抑制剂在蛋白质提取液中的浓度范围分别在1-200mg/mL之间；
上述高温孵育法，具体为将蛋白质提取液与生物样本的混合物在40-100℃水浴下孵育
1-60min。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的蛋白质样品溶解液中，pH为1-6.5的酸性缓冲溶液，为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；所述的pH为7.5-14的碱性缓冲缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；
所述的蛋白质溶解液中，离子液体的阳离子部分为烷基链部分含2个以上碳的咪唑类、吡啶类、季铵类、或季鏻类阳离子中的一种或二种以上；阴离子部分为卤素离子、NO3-、ClO4-、AlCl4-、BF4-、PF4-、CF3COO-、CF3SO3-、(CF3SO2)2N-或SbF6-中的一种或二种以上；质量体积浓度按离子液体的质量(g)与碱性缓冲溶液的体积(mL)之比计为0.1％-30％；
所述的表面活性剂为十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、烷基糖苷、100(聚乙二醇辛基苯基醚)(Triton X-100)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、RapiGest SF或乙基苯基聚乙二醇(NP-40d)中的一种或二种以上，质量体积浓度按表面活性剂的质量(g)与缓冲溶液的体积(mL)之比计为0.1％-30％；
所述的去垢剂为尿素、硫脲或盐酸胍等去垢剂中的一种或二种以上，摩尔浓度按去垢剂的物质的量与缓冲溶液的体积之比计为0.1-20M；
所述的有机溶剂为有机醇类或有机酸类中的一种或二种以上，体积浓度按有机溶剂与缓冲溶液的体积之比计为0.1％-100％；
所述的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、磷酸三氯乙(TCEP)或β-巯基乙醇等还原剂中的一种或二种以上，摩尔浓度按还原剂的物质的量与碱性缓冲溶液的体积之比计为0.1-
1000mM；
所述的高温孵育法，具体为将蛋白质提取液与生物样本的混合物在40-100℃水浴下孵育1min-10h。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺中的一种或二种，溶于上述碱性缓冲溶液后的摩尔浓度为1-200mM；
所述的蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C/N、蛋白内切酶Glu-C/N、Asp-C/N中的一种或二种以上，使用二种以上时，选用的酶可同时使用或顺序使用，蛋白酶与蛋白质的质量比为1:500–500:1；
步骤(6)中所述的肽段末端氨基反应，可为使用醛基及氰基硼氢化钠进行的二甲基化反应等可增强肽段a1离子信号强度的末端氨基衍生反应；所述的分级方法包括体积排阻分级、离子交换分离中的一种或二种。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(7)中所述的交联剂断裂剂为氧化剂、碱性溶液、盐酸羟胺中的一种或二种以上；
上述氧化剂为高碘酸盐、高氯酸盐、高锰酸盐、重铬酸盐、过氧化钠、过氧化氢、硝酸等中的一种或二种以上；上述碱性溶液可为氢氧根盐溶液、氨水中的一种或二种；
步骤(8)中所述的终止剂为对应于可中和交联剂断裂剂的试剂，可为还原剂或酸性溶液等；
上述还原剂为硫代硫酸盐、亚硫酸盐、卤素离子中的一种或二种以上；
上述酸性溶液为盐酸、磷酸、硝酸或硫酸中的一种或二种以上。
10.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(9)中所述的富集材料为在琼脂糖凝胶球、硅球、聚合物球等有机/无机材料上键合能与交联剂断裂生成基团反应的物质；
步骤(10)中所述的洗脱液为下述中的一种：浓度为0.1-8M的氯化钠溶液、0.1-8M的氯化钾溶液、0.1-1M的碳酸钠溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的盐酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氢铵溶液；乙腈、甲醇、异丙醇；十二烷基磺酸钠、Triton X-100、Chaps、Tween；
步骤(11)中所述的键合肽段释放溶液为浓度为0.1-1M的盐酸羟胺溶液；或为pH为8-12的碱性溶液，碱性溶液为氢氧根化合物、碳酸盐、氨水中的一种或两种以上。
一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
VISMEK(3)-FCVGLQKIEEIFKK(7)
VISEKGGNK(5)-GGVHVKLAHLSK(6)
LAHLSKHPK(6)-LQKR(3)
TGKSIKGYTLPPHCSRGER(3)-LSVEALNSLTGEFKGK(2)
LNYKSEEEYPDLSK(4)-AVEKLSVEALNSLTGEFK(4)
GKYYPLK(2)-VISMEKGGNMKEVFRR(6)
LNYKSEEEYPDLSK(4)-VLTPDLYKK(8)
GGVHVKLAHLSK(6)-LQKR(3)
GGDDLDPHYVLSSR(9)-VISEKGGNK(5)
GGVHVKLAHLSK(6)-LEKGQSIDDIPAQK(3)
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 具有高流动性的洗衣粉浆料及其制备方法 | 2020-05-08 | 219 |
| 提高利用蒸气加热的效率的方法及抄纸方法 | 2020-05-11 | 384 |
| 基于水性丙烯酸酯乳液的珠光涂料及其制备方法 | 2020-05-08 | 25 |
| 一种生物质糖化液中糖含量的检测方法 | 2020-05-11 | 676 |
| 一种多材质金属共线涂装用紫外光固化阴极电泳涂料及其制备方法 | 2020-05-08 | 510 |
| 一种瑞博西尼的工业化制备方法 | 2020-05-08 | 258 |
| 乳液及其制备方法 | 2020-05-08 | 688 |
| 一种纯化长链氨基酸的工艺 | 2020-05-11 | 114 |
| 一种分离长链氨基酸和二元酸的工艺 | 2020-05-11 | 188 |
| 一种工业级碳酸锂沉降提取装置 | 2020-05-08 | 277 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
