一种降解氯苯类挥发性有机物的菌株及其培养方法和应用
阅读：56发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种降解氯苯类挥发性有机物的菌株及其培养方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种降解氯苯类挥发性有机物的菌株及其培养方法和应用，菌株命名为吡啶红球菌。该菌株保藏于广东 微 生物 研究所，保藏号：GDMCC NO.60677，保藏日期：2019年5月15日。本发明提供的用于降解氯苯类VOCs菌株为好 氧 型革兰氏 染色 阳性菌，可利用如一氯苯作为 碳 源和 能源 进行生长，并可将其彻底降解为CO2、H2O和无机氯化物。在纯培养条件下，该菌株于30℃、pH＝6.8-7.2的条件下对氯苯类VOCs降解效率最高，该菌株具有良好的底物适应能 力 和多底物降解能力，对一氯苯的最大降解效率达90％。通过对该菌株生物学特性和降解特性研究，可为医化行业氯苯类VOCs废气的生物处理提供技术 支撑 。，下面是一种降解氯苯类挥发性有机物的菌株及其培养方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种降解氯苯类挥发性有机物的菌株，其特征在于，命名为吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)，保藏号：GDMCC NO.60677，保藏时间：2019年5月15日。
2.一种基于权利要求1所述的降解氯苯类挥发性有机物的菌株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取郑州市某水务公司回流污泥，投加液体培养液曝气培养，然后将富集菌液的离心底物、液体培养基和氯苯类VOCs加入血清瓶中，在摇床中培养，得到微生物群落；
2)基于涂布法于固体培养基进行目标菌株的纯化分离，得到用于降解含氯含苯有机物的菌株。
3.根据权利要求2所述的降解氯苯类挥发性有机物的菌株的培养方法，其特征在于，以液体培养基1L计，所述的液体培养基由如下重量的组分组成：
0.1g MgCl2·6H2O，0.002g ZnSO4·7H2O，0.0002g Na2MoM4·2H2O，0.001g CaCl2·
2H2O，0.0002g CuSO4·5H2O，0.0004g CoCl2·6H2O，2.5g(NH4)2SO4，0.005g FeSO4·7H2O，
1.6g K2HPO4·2H2O，0.8g NaH2PO4·2H2O，0.001g MnCl·4H2O，采用蒸馏水补至1L。
4.根据权利要求2所述的降解氯苯类挥发性有机物的菌株的培养方法，其特征在于，以固体培养基1L计，所述的固体培养基由如下重量的组分组成：
0.5g(C6H10O5)n，0.024g MgSO4，0.5g Peptones，0.5g C6H12O6，0.5g Yeast，0.3g K2HPO4，0.5g Casein hydrolysate，15.0g Agar，和1L H2O。
5.根据权利要求2所述的降解氯苯类挥发性有机物的菌株的培养方法，其特征在于，以营养液1L计，所述的四种营养液由如下重量的组分组成：
阴离子：0.002g Na2MoM4·2H2O，16.0g K2HPO4，8.0g NaH2PO4·2H2O和1L蒸馏水；
A营养液：0.05g FeSO4·7H2O，0.02g ZnSO4·7H2O，0.002g无水硫酸铜和1L纯水；
B营养液：25.0g(NH4)2SO4和1L蒸馏水；
C营养液：0.01g CaCl2·2H2O，1.0g MgCl2，0.004g CoCl2·6H2O，0.001g MnCl·4H2O和
1L蒸馏水。
6.基于权利要求1所述的降解氯苯类挥发性有机物的菌株在处理氯苯类有机废气中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将权利要求1中所述的降解氯苯类挥发性有机物的菌株接种至生物膜反应器内进行氯苯类有机废气处理，经驯化至稳定阶段即可。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，降解氯苯类VOCs在25-35℃、pH＝5.6-8.4条件下进行。
一种降解氯苯类挥发性有机物的菌株及其培养方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 空气污染问题一直是近些年人们关注的焦点，挥发性有机污染物(Volatile Organic Compounds,VOCs)是空气中普遍存在的一种对环境影响极大的有机污染物，通常指参与大气光化学反应的任何含碳化合物，大部分VOCs都有毒性，少部分还具有“三致”作用，且VOCs是产生雾霾和光化学烟雾的重要前驱物。环境中VOCs来源非常广泛，分为天然源和人为源两种，天然源大部分来自海洋、土壤、植物等散发的有害气体，人为源则主要源于石油化工生产、污水以及垃圾处理厂、汽油发动机尾气、制药等行业。石油及化工行业排放的有机废气是最主要的来源，且医药化工行业是众多化工行业中一个重要的分支，具有废气排放量大，排放环节较为分散复杂等特点，所以对于医药化工中产生的有机废气必须加强监管和治理。
[0003] VOCs的处理方法主要分为销毁技术(如燃烧法、生物法、低温等离子体法和光催化氧化法)和回收技术(如吸附、冷凝、膜分离、吸收技术)两大类。针对医药化工等工业企业排放的氯代烃、苯系物等污染物，常用的处理方法有冷凝回收、吸收法、吸附法、催化燃烧法等。虽然在环境净化上有一定改善效果，但在长期的实践过程中这些传统处理方法的经济性差，处理不彻底，对非水溶性的废气治理效果差等弊病逐渐显现。
[0004] 生物法是基于真菌、细菌的自然代谢过程去除污染物的技术，除采用特种菌种处理特种废气之外，还可以对微生物进行人为驯化，亦可处理含其他VOCs的有机废气。针对医药化工行业产生的气量大、浓度低的废气，生物法可将复杂的、大分子有机物降解为简单的、小分子有机物或者无机物，处理过程无二次污染。与传统工艺相比，生物法具有处理的成分多，适用范围较广、去除效率高、产生二次污染小，投资少、运行成本低等优势，对浓度低、生物降解性高的废气降解效果最为显著，因而受到了越来越多的重视，当前在我国也得到一定程度的工业应用。因此，加强医药化工行业生物治理的研究对挥发性有机物的降解及生物处理装置的处理效果及长期稳定运行具有重要的意义。
[0005] 目前，可降解CBs的菌株已有很多发现。张士汉(一株高效降解氯苯的苍白杆菌ZJUTCB-1及其应用专利号： CN109370945A)等从污水处理厂的活性污泥中驯化、分离得到的一株具有氯苯高效降解能力的苍白杆菌ZJUTCB-1，在好氧条件下可降解初始浓度347.31-2604.80μmol/L的氯苯，去除率为100％。张丽丽(具有氯苯降解能力的皮式罗尔斯顿菌H2及其应用专利号：CN101880642A)等从净化氯苯废气的生物滴滤床填料表面的生物膜内分离纯化得到一株高效、快速降解氯苯类化合物的菌株，在温度 30和℃35℃时，36h对氯苯的去除率高达97.5％。然而，通过对当前氯苯类降解菌研究现状的分析发现，基于医化行业筛选出的氯苯类VOCs降解菌在高浓度和低浓度之间没有深层次的研究，对于菌种的培养时间也没有具体的要求，导致培养时间各不一样，最佳降解效率也是各有差异。
[0006] 因此，筛选分离并利用定向驯化方法获得可降解氯苯类VOCs高效降解菌株，通过对其生物学特性和降解特性的研究，可为医化行业氯苯类VOCs废气的生物处理提供技术支撑和理论依据。
发明内容
[0007] 1.本发明提供了一种降解氯苯类挥发性有机物的菌株，该菌株可有效降解氯苯类 VOCs。
[0008] 2.一种降解氯苯类挥发性有机物的菌株，命名为吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)，保藏号：GDMCC NO.60677。
[0009] 该菌株的具体保藏信息如下：
[0010] 名称：Rhodococcus pyridinivorans LR
[0011] 保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC
[0012] 保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号
[0013] 保藏时间：2019年5月15日
[0014] 保藏编号：GDMCC NO：60677
[0015] 3.吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)属于Rhodococcus属；为好氧革兰氏阳性菌，其菌落呈圆状，乳黄色，不透明，菌落边缘为锯齿状，边缘光滑整齐，直径约2μm。
[0016] 4.本发明还提供了一种用于降解氯苯类挥发性有机物的菌株的培养方法，从郑州市某水务公司提取回流污泥，该污泥样品经长期投加液体培养液曝气定向驯化后，在液体培养基反复培养，在无菌操作台用固体培养基(培养基添加目标污染物)进行涂布置于恒温箱30℃培养，经多次分离，提纯出具有高效降解特性的优势菌种。
[0017] 5.一种用于降解氯苯类挥发性有机物的菌株的培养方法，包括以下步骤：
[0018] 1)取郑州市某水务公司的回流污泥，投加液体培养液曝气培养，然后将富集菌液的离心底物、液体培养基和氯苯类有机物加入血清瓶中，在摇床中培养，得到微生物群落。
[0019] 2)利用固体培养基结合涂布法进行目标菌株的纯化分离，得到用于降解氯苯类挥发性有机物的菌株。
[0020] 3)以液体培养基1L计，所述的液体培养基由如下重量的组分组成：
[0021] 0.1g MgCl2·6H2O，0.002g ZnSO4·7H2O，0.0002g Na2MoM4·2H2O，0.001g CaCl2·2H2O，0.0002g CuSO4·5H2O，0.0004g CoCl2·6H2O，2.5g(NH4)2SO4，0.005g FeSO4·7H2O，
1.6g K2HPO4·2H2O，0.8g NaH2PO4·2H2O，0.001g MnCl·4H2O和1L蒸馏水。
1.6g K2HPO4·2H2O，0.8g NaH2PO4·2H2O，0.001g MnCl·4H2O和1L蒸馏水。
[0022] 4)以固体培养基1L计，所述的固体培养基由如下重量的组分组成：
[0023] 0.5g(C6H10O5)n，0.024g MgSO4，0.5g Peptones，0.5g C6H12O6，0.5g Yeast，0.3g K2HPO4，0.5g Casein hydrolysate，15.0g Agar，和1L H2O。
[0024] 5)以营养液1L计，所述的四种营养液由如下重量的组分组成：
[0025] 阴离子：0.002g Na2MoM4·2H2O，16.0g K2HPO4，8.0g NaH2PO4·2H2O和1L蒸馏水。
[0026] A营养液：0.05g FeSO4·7H2O，0.02g ZnSO4·7H2O，0.002g CuSO4和1L H2O。
[0027] B营养液：25.0g(NH4)2SO4和1L H2O。
[0028] C营养液：0.01g CaCl2·2H2O，1.0g MgCl2，0.004g CoCl2·6H2O，0.001g MnCl·4H2O 和1L H2O。
[0029] 6.利用固体培养基结合涂布法进行目标菌株的纯化分离，即取100μL前面反复纯化后的液体培养基中的两种微生物菌液，再通过固体培养基实验方法步骤涂布到固体培养基上。放入30℃恒温培养箱中进行培养。4天之后，同样用固体培养基试验方法挑出单菌落培养，在液体培养基中扩大培养得到还原菌种，然后将菌液加入消过毒的50mL离心管中在运行条件为5000r/min，15min，15℃的离心机下离心，弃去上清液。
[0030] 7.本发明用于降解对氯苯类VOCs菌株可用于处理氯苯类有机废气。具体为将本发明用于降解氯苯类挥发性有机物的菌株接种至生物膜反应器内进行氯苯类有机废气处理，经挂膜驯化至稳定阶段即可，获得了良好的氯苯类VOCs降解效果。
[0031] 8.本发明用于降解氯苯类挥发性有机物的菌株降解氯苯类VOCs在30-35℃，pH＝6.8- 7.2条件下进行，实验表明，该菌株可在96h内将液体培养基中不同初始浓度(50-350 mg/L，以血清瓶体积计算)的氯苯类VOCs彻底降解，具有较强的底物适应能力；该菌株还有良好的底物宽泛性，可将氯苯类VOCs作为碳源和能源加以利用并彻底矿化为CO2、 H2O和无机氯化物。
[0032] 9.公开(公告)号为CN108130288A的发明专利描述了赤红球菌及其降解有机污染物的应用(公开(公告)日：2018-06-08)，该申请所述应用方法包括：赤红球菌FQ-2在 30℃、160r/min条件下可实现对丙酮、氯苯、乙酸丁酯、α-蒎烯等有机污染物的降解。该菌主要对丙酮具有较好地降解效果。但本发明仅对氯苯初始浓度为50mg/L条件下赤红球菌 FQ-2的降解效果进行了研究，降解效率为％，并未对更广泛范围氯苯初始浓度的降解效果进行研究。
[0033] 10.本发明一种用于降解氯苯类挥发性有机物的菌株，命名为吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)，菌株为革兰氏染色阳性菌，其菌落呈圆状，乳黄色，不透明，菌落边缘为锯齿状，直径约2μm。具有氯苯类VOCs高效降解能力，能够以氯苯类VOCs为碳源和能源进行生长并完全降解不同初始浓度底物；该菌株能以共代谢方式同时降解氯苯类 VOCs；本发明为生物法处理含氯苯类VOCs有机废气的工业提供了一条可行的技术方向。附图说明
[0034] 图1为吡啶红球菌系统进化树；
[0035] 图2为菌株革兰氏染色照片；
[0036] 图3为吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)显微镜照片；
[0037] 图4为不同pH值对吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)降解C6H5Cl效率影响；
[0038] 图5为不同C6H5Cl浓度条件下吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)降解C6H5Cl效率影响；
[0039] 图6为吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)的生长代谢特性分析示意图；
[0040] 图7为吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)对不同底物的降解能力分析示意图；
具体实施方式
[0041] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不限于此：
[0042] 实施例1：菌株的分离与鉴定：
[0043] 1.菌株的驯化选育
[0044] 将取自郑州市某水务公司(2019年3月、中原环保股份有限公司五龙口水务分公司) 污水排放口的活性污泥(投加液体培养液)进行曝气驯化(2d)，然后将富集菌液的离心底物(5mL)、液体培养基和不同浓度氯苯类有机物加入血清瓶中，在摇床中培养4天，获得可降解目标污染物(氯苯类VOCs)的微生物群落；利用固体培养基涂布法进行可降解菌株的纯化分离，即取100μL前面反复纯化后的液体培养基中的两种微生物菌液，通过之前的固体培养基实验方法步骤涂布到固体培养基上。倒置于恒温培养箱，30℃培养4天，挑取单菌落于液体培养基中，在液体培养基中扩大培养得到还原菌种，然后将菌液离心(5000 r/min，15min，15℃)底物送去菌种鉴定。菌株命名为吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)。
[0045] 该菌株短期保藏，接入斜面固体培养基，于冰箱4℃保藏。长期保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国广州市先烈中路100号，保藏日期：2019.5.15，保藏编号： GDMCC NO：60677。
[0046] 2.培养条件
[0047] 以液体培养基1L计，所述的液体培养基由如下重量的组分组成：
[0048] 0.1g MgCl2·6H2O，0.002g ZnSO4·7H2O，0.0002g Na2MoM4·2H2O，0.001g CaCl2·2H2O，0.0002g CuSO4·5H2O，0.0004g CoCl2·6H2O，2.5g(NH4)2SO4，0.005g FeSO4·7H2O，
1.6g K2HPO4·2H2O，0.8g NaH2PO4·2H2O，0.001g MnCl·4H2O和1L蒸馏水。
1.6g K2HPO4·2H2O，0.8g NaH2PO4·2H2O，0.001g MnCl·4H2O和1L蒸馏水。
[0049] 以固体培养基1L计,所述的固体培养基由如下重量的组分组成：
[0050] 0.5g(C6H10O5)n，0.024g MgSO4，0.5g Peptones，0.5g C6H12O6，0.5g Yeast，0.3g K2HPO4，0.5g Casein hydrolysate，15.0g Agar，和1L H2O。搅拌溶解，灭菌15min。
[0051] 以营养液1L计，所述的四种营养液由如下重量的组分组成：
[0052] 阴离子：0.002g Na2MoM4·2H2O，16.0g K2HPO4，8.0g NaH2PO4·2H2O和1L蒸馏水。
[0054] B营养液：25.0g(NH4)2SO4和1L蒸馏水。
[0055] C营养液：0.01g CaCl2·2H2O，1.0g MgCl2，0.004g CoCl2·6H2O，0.001g MnCl2·4H2O和1 L蒸馏水。
[0056] 培养条件：最适宜生长pH为6.8-7.2；最适宜生长温度为30-35℃。
[0057] 3.菌株形态及分子生物学鉴定
[0058] 该菌株属于Rhodococcus属，菌株为革兰氏染色阳性菌，其菌落呈圆状，乳黄色，不透明，菌落边缘为锯齿状，直径约1.05μm。
[0059] 得到的用于降解氯苯类挥发性有机物的菌株测得其16S rRNA基因序列与Genbank中已存在的核酸序列应用BLAST程序进行同源性比较，发现其与Rhodococcus pyridinivorans菌属的多个菌株序列相似性达99％以上。选取若干株菌株利用DNAStar软件将这些相应序列与该菌序列进行同源性比较，建立系统进化树，得到该菌的系统进化树(如图1)，并上传基因序列至Genbank，获取基因序列号(MN080148)；通过构建系统发育关系，确定该菌属与Rhodococcus pyridinivorans的亲缘关系最近，相似度大于99％。因此将该菌株归属为 Rhodococcus pyridinivorans属，并命名为Rhodococcus pyridinivorans LR。
[0060] 实施例2:吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans LR)降解特性
[0061] 1.不同pH条件(5.6-8.4)下吡啶红球菌降解特性
[0062] 取上述四种营养液各10mL于9个血清瓶中，定容至200mL。取160μL C6H5Cl、5mL 菌液加于Rhodococcus pyridinivorans LR血清瓶中。用HCl(HCl 10mL加蒸馏水50mL配置)和NaOH(NaOH 10g加蒸馏水50mL配置)将1、2、3、4、5号培养瓶的pH值分别调节到pH＝5.6、pH＝5.8、pH＝6.0、pH＝6.4、pH＝6.8，分别置于30℃、180r·min-1恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析(结果如图4)。结果表明，Rhodococcus pyridinivorans LR的最适降解pH为7.2，在C6H5Cl的逐步降解过程中，其降解特性明显优于其他pH值；pH值的过高或过低(小于6或大于8)，都会影响Rhodococcus pyridinivorans LR的降解过程(底物降解不彻底)；
在不同pH环境中吡啶红球菌均能不同程度的降解C6H5Cl，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。
在不同pH环境中吡啶红球菌均能不同程度的降解C6H5Cl，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。
[0063] 2.不同C6H5Cl浓度下Rhodococcus pyridinivorans LR的降解特性
[0064] 以C6H5Cl作为吡啶红球菌的唯一碳源，标号1、2、3、4、5号瓶分别加入梯度浓度的 C6H5Cl和5mL Rhodococcus pyridinivorans LR。分别置于30℃、180r·min-1恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析(结果如图5)。结果表明，Rhodococcus pyridinivorans LR适宜的C6H5Cl浓度在实验室条件下达100mg/L-1000mg/L，并且对C6H5Cl的降解效率保持在 80％以上，说明该菌株对C6H5Cl具有高效稳定的降解能力。
[0065] 3.Rhodococcus pyridinivorans LR的生长代谢特性
[0066] 在温度为30℃，摇床转速为180r·min-1，pH为7左右的条件下，Rhodococcus pyridinivorans LR菌株在接种量为7.62mg蛋白质·L-1，氯苯初始浓度为500mg·L-1条件下进行培养，氯苯和蛋白质浓度变化如图6所示。在培养的前20h内，氯苯的降解速率比较缓慢，降解效率不超过20％，测菌液蛋白含量发现在前20h内培养液蛋白含量基本保持在7.6 左右，与接种量基本一致，说明该阶段氯苯的消减量主要原因并不是由于细菌繁殖，可能是由于细菌自身生长代谢导致。在培养20h后氯苯降解速率明显增加，培养液中蛋白含量也明显提高，说明该阶段氯苯降解主要是由于生物代谢作用。最终氯苯浓度稳定在75.5mg·L-1，说明在该条件下CBR菌株对氯苯的降解率达84.91％。
[0067] 4.Rhodococcus pyridinivorans LR降解不同底物分析
[0068] 以1,2,4-三氯苯作为吡啶红球菌生长的碳源，置于30℃、180r·min-1恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析(结果如图7)。随着1,2,4-三氯苯浓度的逐渐增加， Rhodococcus pyridinivorans LR菌株对氯苯的降解效率逐渐下降，且在1,2,4-三氯苯的浓度由 540mg·L-1增至600mg·L-1时，菌株对氯苯的降解效率明显下降，说明1,2,4-三氯苯对 Rhodococcus pyridinivorans LR菌株降解氯苯有抑制作用。
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