【技术领域】
[0001] 本
发明属于微
生物修复技术领域，具体涉及重金属抗性菌及其应用。【背景技术】
[0002] 近年来，农田重金属污染问题已成为我国广泛关注的重大农业生态环境问题，对现代农业和社会经济的可持续发展、农业生态环境安全和农产品
质量安全构成了严重威胁。农业部曾对全国24省、市320个严重污染区
土壤调查发现，土壤重金属超标率占污染土壤和
农作物的80％。2005至2013年，环境保护部会同国土资源部开展了首次全国土壤无人状况调查，结果显示在无机污染物中，
铜的点位超标率达2.1％。总体来说，我国南部地区铜含量高于北部，西部高于东部。因此，对铜污染土壤的修复刻不容缓。
[0003] 土壤重金属污染
微生物修复技术是利用土壤环境中的微生物对重金属污染物进行吸收、沉淀、
氧化和还原作用来降低重金属在土壤中的毒性。相对传统的物理
化学修复技术，运用生物修复技术对重金属污染土壤进行修复，具有成本低、效率高和不会产生二次污染等优点。【发明内容】
[0004] 本发明解决的技术问题在于提供一种重金属抗性菌及其在重金属污染修复中的应用。
[0005] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
[0006] 本发明首先提供了一种重金属抗性菌，为罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)Ralstonia Bcul-1，该菌株保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年04月12日，保藏编号为CGMCC NO.17565。
[0007] 本发明还提供了所述重金属抗性菌的应用，即在重金属污染
水体或土壤生物修复中的应用。
[0008] 进一步地，所述重金属包括铜、锌、镉、铬、锰、镍。
[0009] 与
现有技术相比，本发明的有益效果在于：利用土壤环境中的微生物对重金属污染物进行
钝化吸附来降低重金属在土壤中的毒性，具有成本低、效率高和不会产生二次污染等优点。【
附图说明】
[0010] 下面参照附图结合
实施例对本发明作进一步的描述。
[0011] 图1为罗尔斯通氏菌在培养基上上的形态图。
[0012] 图2为罗尔斯通氏菌在
显微镜下的形态。
[0013] 图3为系统进化树。【具体实施方式】
[0014] 本发明提供了一株罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)RalstoniaBcul-1，该罗尔斯通氏菌是从福建尤溪铅锌矿区周边农田土壤中分离纯化的，具有耐重金属微生物特征的细菌菌株。
[0015] 该菌株筛选步骤如下：
[0016] 步骤1：10g新鲜土壤加入到90mL带玻璃珠的无菌水中，150r·min-1振荡10min后，静置5min后稀释制备10-2菌悬液；
[0017] 步骤2：取5mL的10-2菌悬液接种到50ml Cu2+浓度为200mg·L-1的
牛肉膏蛋白胨液体培养基内，无菌条件下37℃150r·min-1振荡培养24h；
[0018] 步骤3：将上述培养液以10％(V/V)的接种量转接入新鲜的培养液(Cu2+浓度为400mg·L-1)中150r·min-1继续振荡培养一个周期，再转接2次，至液体培养基中的Cu2+浓度-1
增加到600mg·L ；
[0019] 步骤4：取最后一次富集培养液0.2mL，以10倍比稀释法稀释后涂布于分离纯化培养基平板上，并在30℃下倒置培养48～72h。肉眼观察菌落生长情况，挑选不同形态的单菌落，并在新的分离纯化培养基平板上继续划线分离，直到培养出菌落特征一致的纯菌种；
[0020] 步骤5：将分离得到的纯菌种接种到含Cu2+的液体培养基中振荡培养，观察菌株生长情况，选择生长较好的菌株保存并进行吸附试验，筛选Cu2+吸附率最高的菌株即为目标菌株，并进行菌种鉴定。
[0021] 该菌株保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年04月12日，保藏编号为CGMCC NO.17565。
[0022] 该罗尔斯通氏菌的菌种菌学特征描述如下：
[0023] 【形态特征】：该罗尔斯通氏菌Bcul-1在PDA培养基上28℃培养24小时观察到菌株群落为圆形(图1)；菌株为杆状(图2)。对该菌株进行革兰氏
染色，显示为革兰氏阴性菌。
[0024] 【金属耐受性】该罗尔斯通氏菌Bcul-1依次分别接入到含Cu2+(氯化铜)0、50、100、200、300mg/L的PDA培养液中，结果显示：在Cu2+浓度≤100mg/L情况下细菌生长不受抑制并繁殖速度较快；在Cu2+浓度为300mg/L时，细菌生长仍可生长但繁殖速度变慢。此外，该菌株对Cd2+的最高耐受浓度为200mg/L；对Zn2+最高耐受浓度为800mg/L，对Ni2+最高耐受浓度为
350mg/L，对Mn2+最高耐受浓度为800mg/L。
[0025] 【先进性】该菌株对Cu2+最高耐受浓度显著高于已有报道(128mg Cu2+/L)。
[0026] 【16srRNA基因序列分析】从本发明所述菌株的纯培养物种提取基因组DNA，利用通用引物27f和1492r进行PCR扩增和测序，进一步通过Clustal X
软件和Mega 4.0软件以Neighbour-jioning方法构建系统进化树(图3)。结果显示菌株属于罗尔斯通氏菌(Ralstonia.sp)，命名为罗尔斯通氏菌(Ralstonia.sp)Ralstonia Bcul-1，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年04月12日，保藏编号为CGMCC NO.17565。
[0027] 【生理生化反应特征】该菌株运动性特征检测为不能自主运动，pH生长适宜范围5～8，适宜
温度为0～50℃，在2％以上浓度的NaCl条件下不能生长。
[0028] 该菌株的酶活检测结果显示，菌株具有
氧化酶、产
硫化氢、
硝酸盐还原
煤、甲基红(M.R.)反应呈阳性(表1)。
[0029] 表1菌株酶活性特征
[0030]
[0031] +：表示阳性反应，-：表示阴性反应。
[0032] 菌株抗生素抗性检测结果显示(表2)，菌株对
硫酸卡那霉素、
氨苄青霉素、硫酸
链霉素、利福平、氯霉素敏感。
[0033] 表2菌株抗生素抗性
[0034]
[0035] R:表示抗性，S:表示敏感
[0036] 【铜吸收特征】重金属抗性菌对重金属具有抗性，但不意味着其具备重金属吸收特性，本发明还发现了罗尔斯通氏菌Ralstonia Bcul-1在重金属污染水体和
土壤修复上的应用。将本发明提供的罗尔斯通氏菌Ralstonia Bcul-1接种到100mg/LCu2+水溶液中，16h对Cu2+的吸收率可达29.2％，其余重金属的吸附效果见表3。接种到铜污染土壤中培养，培养20天后，土壤中有效态铜含量由原来的1.678mg/kg降低到1.025mg/kg。
[0037] 表3菌株对不同重金属污染水体16小时的吸附效果
[0038]
