本发明涉及体细胞胚产生领域，尤其涉及通过体细胞胚发生再 生Acacia mangium的方法。更特别的，本发明涉及一种通过在愈伤 组织诱导培养基上培养未成熟合子胚的外植体以生长为胚发生组织 的方法。胚发生组织在体细胞胚成熟培养基和萌发培养基上继续培 养。将萌发的胚进一步转换为驯化植物以在田间种植。本发明特别 适合产生用于重新造林的克隆种植原种。

本文所引用的例证本发明背景或提供关于实践应用的附加说明 的出版物和其它物质，在此并入参考，并分别集中列于所附的参考 文献表中。

森林对世界经济及保持和保存我们的生态系统是非常重要的。 森林树木具有广泛的商业用途(建筑木材，造纸和纸浆原料，及作 为能源)。当天然森林补给不足时，木制品的全球性需求(大多数为 发展中国家的造纸和纸浆及木柴)已逐年增加。重新造林是解决这 种逐年增加的需求的方法。通常选择快速生长，广泛适应性的树种 进行重新造林。大多数树种改良的程序基于对遗传资源进行处理， 包括从现有森林中选择优异克隆，保存遗传可变性，部分控制繁殖 和所需性状的传统培育。尽管通常需若干代来进行培育，但传统的 培育法已成功获得具有快速和始终如一生长的精华树木。然而，许 多其它性状如疾病和昆虫抗性，不同木质素组分和含量难以获得， 主要因为树种和大分离群的高度杂合性所致。另外，授予某些表型 如疾病抗性的基因在基因库中可能根本没有。另一方面，基于树种 遗传转化的分子培育可以导入一特定表型而不影响培育植物的遗传 背景。在杨属物种和桉属物种进行遗传转化能成功修饰木质素含量 (Tzfira等，1998；Robinson，1999)。对森林树种进行分子培育的 前提是存在可靠及可重复的遗传转化方法，这依赖于从一个单细胞 再生一个完整植物的系统。

金合欢(Acacia)属包含大约1200种热带和亚热带树种。其属 于含羞草科(Mimosaceae)。Acacia mangium是一种多用途的，快速 生长和固氮的精华热带豆类树。Acacia mangium已越来越多地用于 在退化的土壤中种植，重新造林和土壤复原。许多Acacia mangium 已在酸性土壤或废弃土地中种植。由于其产生高质纤维，Acacia mangium已在东南亚如马来西亚(Tsai，1988)和印度尼西亚大量种 植作为纸浆业的原料。印度尼西亚的许多造纸和纸浆厂已主要依赖 于种植园作为木材来源，优选Acacia mangium。亚洲造纸和纸浆集 团有两个会员公司，总租界地为540000公顷。至1996年，一个公 司已种植了123000公顷的Acacia mangium，占其种植园的90％， 相当于180×106株幼苗。预计到2004年，亚洲种植和纸浆集团的 几乎全部木材来源均来自种植园，主要是Acacia mangium种植园 (Bayliss，1998a，1998b)。然而，Acacia mangium的花表现弱雌蕊 先熟及变化水平的雄性两性同体。其具有自身传粉，与自然界的 Acacia auriculiformis交叉种内传粉或种内传粉等特性(Sedgley等， 1992；Sornsathapornkul和Owens，1999)。这些繁殖特性对通过种 子进行商业繁殖和种植是不利的。

再生通常用于木本树木的繁殖中(Kozlowski和Pallardy，1997)。 在Acacia中，少数树种据报道成功再生，如通过体细胞胚发生再生 Acacia catechure(Rout等，1995)，和通过器官发生再生Acacia auriculiformis(Rao和Prasad，1991)。已报道了Acacia mangium嫩 枝繁殖(Bhaskan和Subbash，1996；Ahmad，1991；Galiana等，1991a， 1991b)，Toshihiro(1999)还报道了从无菌Acacia mangium幼苗中 分离原生质体。我们的PCT专利申请PCT/SG00/00010阐述了通过 器官发生再生Acacia mangium。然而，通过体细胞胚发生再生Acacia mangium还没有阐述。

体细胞胚是克隆起源的，因此使用体细胞胚的繁殖可具有非常 高速率的营养性增加的潜力，由此在商业上是令人感兴趣的。通过 体细胞胚发生进行再生是进行植物组织培养的一种有吸引力的方 法。据报道体细胞胚比嫩枝更稳定再生。用体细胞胚的再生系统的 另一优点是其明显的单细胞起源。这意味着再生体不太可能是嵌合 起源的，因为如果再生体源自成群细胞而不是单细胞，则植物组织 可能是嵌合的或不稳定的及产生不正常型。体细胞胚发生方法对马 铃薯或其它抗体细胞胚发生的作物物种的适用性使这些作物可利用 任何新的人工种子技术进步。

体细胞胚适于通过根瘤农杆菌(Mathews等，1992)，微注射 (Neuhaus等，1987)和颗粒轰击(Wilde等，1992)进行转化。另 外，体细胞胚可用液氮低温贮藏而不丧失存活性。低温贮藏是一种 保持种质的有效方法，并可使植物材料长时间转运。另外，体细胞 胚适于开发人工种子技术(美国专利No.5572827；Bajaj，1995a)。

因此，本发明的一个目的是提供一种通过体细胞胚发生再生 Acacia mangium的方法。

发明概述

本发明涉及体细胞胚生产领域，尤其涉及通过体细胞胚发生再 生Acacia mangium的方法。更特别的，本发明经体细胞胚发生再生 Acacia mangium的方法通常可分为4个步骤：(1)胚发生愈伤组织 诱导，(2)胚成熟，(3)胚萌发，和(4)转化为驯化植物，即再生 植物或再生体。然后将驯化植物移至土壤中。优选使用两步胚成熟。

本发明还涉及制备Acacia mangium的体细胞胚的方法。此方法 通常变化上述步骤的前两个。体细胞胚可用作制备转基因植物的原 料，可低温贮藏并可发育成人工种子。

根据本发明的实施方案，Acacia mangium的体细胞胚发生可在 MS基本培养基上从未成熟的胚轴中诱导的愈伤组织上实现，MS基 本培养基补加了赛二唑素(thidiazuron，TDZ)和吲哚-3-乙酸 (IAA)与抗坏血酸，天冬酰胺，酪素酶解物，谷氨酰胺，脯氨酸， 蔗糖和phytagel的组合物。通过首先在含有蔗糖，phytagel和赤霉酸 (GA3)的MS基本培养基上，然后在含有蔗糖和phytagel的MS 基本培养基上培养体细胞胚，42.33％的球形胚发育为鱼雷胚和子叶 胚。11％的成熟体细胞胚萌发为幼苗，将其移至由泥炭土和沙土混 合物组成的罐装土壤中。

附图简述

图1A-D示出体细胞胚诱导。图1A示出使用胚轴作为外植体 诱导胚发生愈伤组织。图1B示出在诱导培养基AM-304上诱导胚发 生愈伤组织。图1C-D示出Acacia mangium的体细胞胚扫描电子显 微镜图，图1C示出球形期(用箭头表示；标尺＝100μm)，图1D 示出心期(用箭头表示；标尺＝100μm)。

图2A-F示出体细胞胚成熟和萌发。图2A示出在AM-425上 体细胞胚的成熟。图2B-F示出体细胞胚成熟和萌发的各期，图2B 示出鱼雷期，图2C示出早期子叶期，图2D示出子叶期，图2E示 出体细胞胚萌发，图2F示出具有单个子叶的体细胞胚。

图3A-H示出Acacia mangium的体细胞胚发生的组织学。图3A -D示出自上皮细胞起始的体细胞胚：中期(A和B，用箭头表示)， 二子代细胞(C，用箭头表示)，和原胚结构(D)；图3E-G示出 球形胚形成；图3H示出心期胚。所用缩写是：dc＝分界细胞层；pe ＝原胚结构；sec＝表皮下细胞；sus＝胚柄；tdc＝二子代细胞。

图4A-C示出体细胞胚萌发。图4A示出在培养基中萌发的具 有羽状叶(用箭头表示)，伸长的胚轴和胚根的成熟体细胞胚。图4B 示出在种植于土壤之前的幼苗。图4C示出在土壤中生长的植物(3： 1)。

发明详述

本发明涉及体细胞胚产生领域，尤其涉及通过体细胞胚发生再 生Acacia mangium的方法。更特别的，本发明涉及在愈伤组织诱导 培养基上，培养未成熟的合子胚外植体生长为胚发生组织的方法。 胚发生组织在体细胞胚成熟培养基和萌发培养基上继续培养。将萌 发胚进一步转化为适于田间种植的驯化植物。此方法非常适于生产 克隆种植原种以用于重新造林。

通过体细胞胚发生进行繁殖是指胚是在体外从小块植物组织或 个体细胞中产生的方法。胚被称为体细胞胚是因为它们产生自体细 胞(营养)组织，而不是有性过程。通过体细胞胚发生的植物繁殖 具有捕捉非常需要的基因型的所有遗传获得量的能力。另外，这些 方法易于自动操作和机械化。这些性质赋予体细胞胚发生方法具有 产生大量个体克隆的潜力，以重新造林。

在本发明的一实施方案中，体细胞胚是通过下述方法产生的， 该方法分为两步：(1)胚发生愈伤组织诱导和(2)胚成熟。优选使 用两步胚成熟法。一方面，体细胞胚是通过以下步骤制备的：(a) 在包括补加TDZ和IAA的基本培养基的愈伤组织诱导培养基上诱 导胚发生愈伤组织，(b)在包括补加GA3的基本培养基的第一种成 熟培养基上使胚成熟，和(c)在包含基本培养基的第二种成熟培养 基上使胚成熟。

在本发明的另一实施方案中，Acacia mangium的再生植物是通 过下述方法生产的，该方法可分为4步：(1)胚发生愈伤组织诱导， (2)胚成熟，(3)胚萌发，和(4)转化为驯化植物。优选使用两 步胚成熟法。然后可将驯化植物种植于田间。一方面，Acacia mangium 的再生体是通过以下步骤制备的：(a)在包括补加TDZ和IAA的基 本培养基的愈伤组织培养基上诱导胚发生愈伤组织，(b)在包括补 加GA3的基本培养基的第一种成熟培养基上使胚成熟，和(c)在包 括基本培养基的第二种成熟培养基上使胚成熟，(d)在包括基本培 养基的萌发培养基上萌发成熟胚，和(e)将萌发植物在罐装土壤中 驯化。

后一实施方案更具体的是，Acacia mangium Willd.的体细胞胚发 生是在MS基本培养基上从未成熟的胚轴诱导的愈伤组织上实现 的，所述MS培养基补加TDZ(1-2mg/l)和IAA(0.25-2mg/l) 与抗坏血酸(Vc)100mg/l，天冬酰胺(Asn)150mg/l，酪素酶解物 (CH)100mg/l，谷氨酰胺(Gln)150mg/l，脯氨酸(Pro)150mg/l， 蔗糖30g/l和phytagel 0.3％的组合物。通过两步成熟法，42.33％的 球形胚发育为鱼雷胚和子叶胚，所述两步成熟法是将体细胞胚在含 有30-50g/l蔗糖，0.1％活性炭，0.35％phytagel和2.5mg/l-5.0mg/l 优选5.0mg/l的GA3，与Vc 100mg/l，Asn 150mg/l，CH 100mg/l，Gln 150mg/l，和Pro 150mg/l的MS基本培养基上培养体细胞胚，然后 在含有50g/l蔗糖和0.35％ phytagel与Vc 100mg/l，Asn 150mg/l，CH 100mg/l，Gln 150mg/l，和Pro 150mg/l及0.1％活性炭的MS基本 培养基上培养体细胞胚。在含有30g/l蔗糖和0.35％phytagel和2.5 -5.0mg/l优选5.0mg/l的GA3，与Vc 100mg/l，Asn 150mg/l，CH 100mg/l，Gln 150mg/l，和Pro 150mg/l及0.1％活性炭的MS基本 培养基上培养成熟体细胞胚，11％的成熟体细胞胚萌发为幼苗。将 幼苗在含有20g/l蔗糖和0.35％ phytagel的MS基本培养基上培养， 然后移至由泥炭土∶沙土(3∶1)组成的罐装土中。移植的幼苗然 后易于在田间种植。

组织学分析示出体细胞胚发生是源自胚发生愈伤组织的单一上 皮细胞的单细胞胚发生。体细胞胚发生经历双细胞期，原胚期，球 形胚期，鱼雷期和子叶期。原胚结构是通过一分界细胞层与亲代愈 伤组织分开，球形胚通过类胚柄结构与愈伤组织连接。

体细胞胚发生已用作为大规模繁殖油棕(Huong，1999； Aberlence-Bertossi等，1999)和大豆(Trick，1997)的方法，并还 用于繁殖其它木本植物如Dalbergia sissoo Roxb(Das等，1997)， Camellia sinensis(L).O.Kuntze(Ponsamuel等，1996)，和Picea abies (L.)Karst(Westcott，1994)。体细胞胚发生的一重要应用是进行遗 传修饰。例如，大豆体细胞胚发生提供了培育高产量转基因大豆植 物的主要方法(Trick，1997)。组合胚发生和农杆菌介导的转化在英 国胡桃，核桃和樱桃中也已成功进行，对培育是非常重要的 (Kozlowski和Pallardy，1997)。Acacia mangium是一种对造纸和纸 浆业有商业重要性的热带豆类树，并是种植的首选树种。将本文所 述的通过体细胞胚发生的有效再生系统，与biolistic或Agrobacterium 介导的转化组合，提供了培育对害虫或疾病抗性植物的另一种有价 值的方法。

实施例

本发明在以下实施例中得以进一步阐述，实施例只是例证了本 发明而不是以任何方式限制本发明。利用本领域已知的标准技术或 以下特别阐述的方法。

实施例1：试剂和培养基

A.MS基本培养基：MS培养基(Murashige和Skoog，1962)   名称   分子式   浓度   (mg/l)   Sigma   目录号   常量营养元素   硝酸铵   NH4NO3   1650   A-3795   硝酸钾   KNO3   1900   P-8291   二水氯化钙   CaCl2.2H2O   440   C-2536   七水硫酸镁   MgSO4.7H2O   370   M-7774   无水磷酸二氢钾   KH2PO4   170   P-8416   七水硫酸亚铁   FeSO4.7H2O   27.8   F-8263   乙二胺四乙酸   (EDTA)   C10H14N2O8Na2.2H2O   (Na2EDTA)   37.3   E-6635   微量营养元素   碘化钾   KI   0.83   P-8166   硼酸   H3BO3   6.2   B-9645   一水硫酸锰   MnSO4.H2O   6.9   M-7899   硫酸锌   ZnSO4.7H2O   8.6   Z-1001   钼酸(钠盐∶二水合物)   Na2MoO4.2H2O   0.25   M-1651   硫酸铜(五水)   CuSO4.5H2O   0.025   C-3036   氯化钴   CoCl2.6H2O   0.025   C-2911   有机试剂   肌醇   C6H12O6   100   I-3011   烟酸   C6H5NO2   0.5   N-0765   甘氨酸   C2H5NO2   2.0   G-6143   硫胺素(维生素B1)   C12H17ClN4OS.HCl   0.1   T-3902   盐酸吡哆醇(维生素B6)   C8H11NO3.HCl   0.5   P-9755

B.其它有机试剂   名称   分子式  Sigma目录号   L-抗坏血酸(维生素C)   C6H8O6  A-2174   酪素酶解物(CH)  C-7290   L-谷氨酰胺(Gln)   C5H10N2O3  G-9273   一水L-天冬酰胺(Asn)   C4H8N2O3.H2O  A-4284   L-脯氨酸(Pro)   C5H9NO2  P-4655   蔗糖  S-5390

C.植物生长调节剂   名称  Sigma目录号   2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)  D-8407   吲哚-3-乙酸(IAA)  I-2886   α-萘乙酸(NAA)  N-0640   1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲   (赛二唑素，TDZ)  P-6186   6-苄基氨基嘌呤(6-BA)  B-3408   细胞分裂素(KT)  K-0753   赤霉酸(GA3)  G-7645

D.琼脂：Phytagel(Sigma目录号：P-8169)

E.愈伤组织诱导培养基1

AM-5      MS+2，4-D2.0mg/l+KT3.0mg/l

AM-6      MS+2，4-D2.0mg/l+KT0.5mg/l

AM-7      MS+NAA2.0mg/l+KT3.0mg/l

AM-8      MS+NAA2.0mg/l+KT0.5mg/l

AM-14     MS+2，4-D0.5mg/l+6-BA3.0mg/l

AM-22     MS+2，4-D2.0mg/l+6-BA1.0mg/l

AM-27     MS+NAA0.5mg/l+6-BA3.0mg/l

AM-31     MS+NAA0.5mg/l+6-BA1.0mg/l

AM-230    MS+2，4-D5.0mg/l+KT3.0mg/l

AM-231    MS+2，4-D5.0mg/l+KT0.5mg/l

AM-234    MS+2，4-D1.0mg/l+KT1.0mg/l

AM-265    MS+IAA0.25mg/l+TDZ1.0mg/l

AM-304    MS+IAA0.25mg/l+TDZ2.0mg/l

AM-308    MS+IAA2.0mg/l+TDZ1.0mg/l

1所有培养基还含有CH100mg/l，Vc100mg/l，Gln150mg/l，Asn 150mg/l和Pro150mg/l，，phytagel0.30％，蔗糖30g/l，在高压灭菌 后pH5.8。

F.胚成熟和萌发培养基1

AM-423    MS+蔗糖30.0mg/l

AM-424    MS+GA35.0mg/l+蔗糖30.0mg/l

AM-425    MS+蔗糖50.0mg/l

AM-426    MS+GA35.0mg/l+蔗糖50.0mg/l

AM-467    MS+GA32.5mg/l+蔗糖30.0mg/l

1所有培养基还含有CH100mg/l，Vc100mg/l，Gln150mg/l，Asn 150mg/l和Pro150mg/l，，phytagel0.30％，活性炭0.1％，在高压灭 菌后pH5.8。

G.幼苗生长(驯化)

MS，蔗糖20.0mg/l，0.35％phytagel

H.移植

泥炭土∶白沙＝3∶1

实施例2：植物材料

1.5月龄的未成熟绿色豆荚是在新加坡科学公园大道的20米高 的成熟Acacia mangium Willd树上收集的。从豆荚中轻轻分离绿色种 子，并用无菌双去离子水(ddH2O)洗4-5次。在将绿色种子的表 面用30％商购的次氯酸钠漂白粉(NaClO)消毒5分钟，并用无菌 ddH2O洗5次后，将种子再用0.1％HgCl2消毒6分钟，及用无菌ddH2O 洗5次。种皮用无菌镊子除去，并分离胚。将胚轴(EA)(图1A) 用无菌镊子轻轻分离，并用作外植体以进行胚发生愈伤组织诱导。

实施例3：培养条件

在121℃高压灭菌25分钟后，将所有培养基调节为pH5.8。将 在实验中测试的植物生长调节剂在高压灭菌后加入培养基中，但其 它物质在高压灭菌前加入培养基中。将所有培养物在28℃，保持在 发光度在23.41-26.01μmol.s-1m-2范围的暖白色荧光灯下，光周期16 小时。

实施例4：组织学

将胚发生愈伤组织固定在于50mM pH7.2磷酸钠缓冲液中的2.5 ％戊二醛中，在室温过夜，然后相继通过梯度乙醇系列20％，30％， 50％，70％，和90％脱水20分钟3次，最后在100％乙醇中脱水30 分钟。将所有组织包埋在塑胶(Leica塑胶包埋试剂盒)中，并以5 -10μm的厚度切片。将所有切片在0.025％甲苯胺蓝中染色1分钟， 在42℃干燥，用DPX(BDH)制作标本，并在光学显微镜下(Leica) 检测。

实施例5：电子显微镜扫描

将胚发生愈伤组织用液氮处理，并通过电子显微镜扫描检测 (JSM-5310LV，日本JEOL公司)。

实施例6：胚发生愈伤组织诱导

将EAs在MS培养基(Murashige和Skoog，1962)上培养2个 月，所述MS培养基补加了不同组合的植物生长调节剂：2，4-D(1.0 -5.0mg/l)和KT(0.5-3.0mg/l)，2，4-D(0.5-2.0mg/l)和6-BA(1.0 -3.0mg/l)，NAA(0.5mg/l)和6-BA(1.0-3.0mg/l)，NAA(0.5- 2.0mg/l)和KT(0.5-3.0mg/l)，或IAA(0.25-2.0mg/l)和TDZ(1.0 -2.0mg/l)。每个实验均重复2次。将全部90个胚轴在每种植物生 长调节剂组合上测试胚发生愈伤组织诱导。在此实验中，所有培养 基均含有抗坏血酸(Vc)100mg/l，天冬酰胺(Asn)150mg/l，酪素 酶解物(CH)100mg/l，谷氨酰胺(Gln)150mg/l，和脯氨酸(Pro) 150mg/l，蔗糖30g/l和phytagel0.3％(g/l)。

据报道体细胞胚在愈伤组织中开始产生是在含有高浓度植物生 长素或高比率植物生长素/细胞激动素的培养基中发生(Kozlowski 和Pallardy，1997)。然而，在Acacia mangium的体细胞胚发生中， 只在含有1.0-2.0mg/l TDZ和0.25-2.0mg/l IAA组合的培养基上获 得绿黄色易碎胚发生愈伤组织(表1；图1B)。TDZ 2.0mg/l和IAA 0.25mg/l组合诱导胚发生愈伤组织最有效(16.41％)(表1)，该愈 伤组织然后产生球形胚和心期胚(图1B-D)。此组合用于诱导更多 的胚发生愈伤组织。然而，在含有2，4-D(1.0-5.0mg/l)和KT(0.5- 3.0mg/l)，2，4-D(0.5-2.0mg/l)和6-BA(1.0-3.0mg/l)，NAA(0.5mg/l) 和6-BA(1.0-3.0mg/l)，或NAA(0.5-2.0mg/l)和KT(0.5-3.0mg/l) 的培养基上，未获得胚发生愈伤组织(表1)。Rout等(1995)报道 了细胞分裂素13.9μM(2.99mg/l)和NAA 2.7μM(0.55mg/l)组合 促进在未成熟的子叶中A.catechu体细胞胚发生。然而，NAA和KT 的相似组合在Acacia mangium未成熟胚轴中不诱导任何胚发生愈伤 组织(表1)。自胚轴中诱导的愈伤组织在含有NAA和KT的培养 基上是白色松散的。已记录Acacia属包含1200多种，形态学上也 有很大差异(Simmons，1987)。在其它不同中，成熟Acacia mangtum 有大约30米高，而一个成熟的A.catechu只有9-12米。对植物生 长调节剂应答的差异可得自物种间遗传背景的不同。TDZ推荐用于 木本物种尤其在顽抗物种组织培养中(Lu，1993)。我们的结果示出 TDZ在Acacia mangium中有效诱导胚发生愈伤组织。Chengalrayan 等，(1997)报道用TDZ代替6-BA和KT可通过体细胞胚发生提高 花生植物的回收。

表1：植物生长调节剂的不同组合对胚发生愈伤组织诱导的作用   培养基   外植体形成胚发   生愈伤组织的频   率1   培养基号   2，4-D   mg/l   NAA   mg/l   IAA   mg/l   TDZ   mg/l   6-BA   mg/l   KT   mg/l   AM-234   1.0   1.0   0   AM-6   2.0   0.5   0   AM-5   2.0   3.0   0   AM-231   5.0   0.5   0   AM-230   5.0   3.0   0   AM-14   0.5   3.0   0   AM-22   2.0   1.0   0   AM-31   0.5   1.0   0   AM-27   0.5   3.0   0   AM-23   0.5   3.0   0   AM-7   2.0   3.0   0   AM-8   2.0   0.5   0   AM-265   0.25   1.0   11.06±0.94   AM-304   0.25   2.0   16.41±4.75   AM-308   2.0   1.0   3.51±3.35

1％(平均值±SD)；数据相当于3份实验结果的平均值。

TDZ(2.0mg/l)和IAA(0.25mg/l)组合促进Acacia mangium 的体细胞胚发生。然而，体细胞胚发育在心期停止(图1D；图3H)， 如果心期胚在相同诱导培养基上保持较长时间，则形成次生体细胞 胚。体细胞胚不能向前发育为较晚期。因此，必需使体细胞胚成熟。

实施例7：体细胞胚成熟和萌发

将在含有IAA 0.25mg/l和TDZ 2.0mg/l的诱导培养基(AM-304) 中诱导的球形胚(图1B-C)，在补加0-5.0mg/GA3，30-50g/l蔗 糖，Vc100mg/l，Asn150mg/l，CH100mg/l，Gln150mg/l，Pro150mg/l， phytagel0.35％(g/l)和活性炭0.1％的MS基本培养基上培养30 天。然后将体细胞胚移至成熟培养基AM-425上，培养40天。接着 将子叶体细胞胚(成熟体细胞胚)移至AM-424培养基上萌发。用 全部250个球形体细胞胚，将在每种培养基组合上的实验均进行两 次。将幼苗移至含有蔗糖20g/l以及phytagel 0.35％的基本培养基 上，培养两个月，之后移至由泥炭土∶沙土(3∶1)组成的罐装土 中。

体细胞胚的成熟与得自其它方法的结果相一致，成熟在通过体 细胞胚发生再生植物中是非常重要的(Kozlowski和Pallardy，1997； Huong 1999)。体细胞胚的成熟使用两步成熟法。首先，将体细胞胚 在含有0.35％ phytagel和2.5-5.0mg/l GA3的培养基(成熟培养基 AM-424，AM-426，和AM-467)中处理(表2)。接着，将体细胞 胚移至含有50g/l蔗糖和0.35％ phytagel的培养基上(成熟培养基 AM-425)脱水。在AM-424培养基上随后在AM-425培养基上处理， 促进42.33％球形体细胞胚发育为鱼雷胚和子叶胚(图2A；表2)。

表2：不同培养基对体细胞胚成熟的作用   成熟培养基   球形胚产生鱼雷和子叶   体细胞胚的频率1   培养基号   基本培养基   GA3(mg/l)  蔗糖(g/l)   AM-424   MS   5.0   30   42.33±13.65   AM-467   MS   2.5   30   18.67±6.11   AM-426   MS   5.0   50   26.67±8.33   AM-423   MS   0   30   0   AM-425   MS   0   50   0

1％(平均值±SD)；数据是三份实验结果的平均值

在没有GA3的成熟培养基(AM-423和AM-425)上，未观测到 球形体细胞胚进一步发育为鱼雷期和子叶期。这些结果表明GA3促 进体细胞胚成熟。我们的结果与在天竺葵(Pelargonium×hortorum Bailey)体细胞胚发生的诱导和表达期均存在GA3对在胚轴外植体 上的体细胞胚形成有害的报道相反(Hutchinson等，1997)。在我们 的实验中，体细胞胚成熟是在相对高蔗糖浓度的情况下完成的。据 报道在Populus体细胞胚发生中有相似结果，蔗糖浓度在20-50g/l 刺激体细胞胚分化(Michler和Bauer 1991)。Biahoua和Bonnean (1999)报道了350mM(120g/l)的高蔗糖浓度提供更有效的Euonymus europaeus体细胞胚发生，并推断高蔗糖浓度在体细胞胚发生中的两 种作用，其一是培养基中的营养因子，二是具有渗透潜力。体细胞 胚发生的成熟对许多植物是关键的，如大豆(Ranch等，1986)和Picea abies(Jalonen和Arnold 1991)体细胞胚发生。在培养基中加入6％ 的麦芽糖促进大豆体细胞胚组织分化和成熟(Ranch等，1996)。对 Picea abies体细胞胚成熟而言，在培养基中进行ABA处理是必需的 (Jalonen和Arnold 1991)。在我们的实验中，还观测到异常子叶胚 如只具有一个子叶的体细胞胚(图2F)或具有三个子叶的体细胞胚， 其不能萌发为幼苗。

实施例8：体细胞胚发生的组织学

体细胞胚发生已经被认为是一种了解植物胚发育的模型 (Warren，1993)。已经识别两种独特类型的体细胞胚发生。一种是 直接胚发生，其中一个单细胞(或细胞群)开始分生组织生长，该 细胞的所有后代均形成部分胚(Warren，1993)。另一种是间接胚发 生，其中胚在预先形成的分生组织丛中发育(Warren，1993)。在Acacia mangium中，胚发生属于间接体细胞胚发生。组织学切片示出体细 胞胚发生在胚发生愈伤组织的一个上皮细胞中发育(图3A-D)。细 胞的平周分裂产生二子代细胞(图3A-C)，一个外子代细胞，一个 内子代细胞(图3C)。二子代细胞的连续分裂形成原胚结构(图3D)， 其进一步发育为球形胚和心期胚(图3E-H)。在光学组织学分析中， 确定外子代细胞发育为体细胞胚的上皮细胞，但内子代细胞发育为 体细胞胚体。组织学切片还示出与上皮相邻的上皮下细胞不形成体 细胞胚，但其背斜分裂形成分界细胞层，以分开体细胞胚和亲代愈 伤组织(图3C-G)。在原胚结构和亲代愈伤组织之间的一层细胞的 结构在本文称为分界细胞层(图3D)。从原胚结构至球形胚，在球 形胚的基部形成一个类胚柄结构(图3G)。在诱导培养基上，胚发 育在心期胚停止(图1D；图3H)。通过成熟，球形胚向前发育为鱼 雷胚(图2B)和子叶胚(图2C-D)。结果，体细胞胚发生经过二细 胞期(图3C)，原胚期(图3D)，球形期(图3E-G)，心期(图1D； 图3H)，鱼雷期(图2B)，和子叶期(图2C-D)。

实施例9：体细胞胚萌发

正常体细胞胚萌发包括胚根延长，胚轴延长和第一片羽状叶延 展。只有由胚根，胚轴，子叶和第一片羽状叶结构组成的那些成熟 体细胞胚，可萌发为自由生长的幼苗(图4B-C)。在含有GA35.0mg/l 的AM-424培养基上，11％的体细胞胚萌发为具有根，第一片羽状 叶(图4A，箭头所指)，和延长的胚轴的幼苗。具有胚根和胚轴延 长但没有第一片羽状叶形成的体细胞胚，不能萌发为幼苗。具有第 一片羽状叶形成但没有胚根延长的体细胞胚，不能通过生根或微量 繁殖而拯救。异常胚如那些具有大单子叶(图2F)或三子叶结构的 体细胞胚，不能萌发为幼苗。

本发明在此专利申请中参考本发明优选实施方案的详细阐述已 得以揭示，应知此揭示只是例证了本发明而无限制之意，本领域技 术人员在本发明的原理和所附权利要求的范围内，对本发明可加以 修改。

发明背景