【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な微生物に関し、
更に詳細には、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２
酢酸を分解資化する能力を有する新規な細菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】自然界では、多様な微生物群集の生物活性に支えられて安定に存在している生態系の浄化作用により、物質循環が行われている。 近年、大量の廃棄物、
難分解性物質、有害物質等が自然界に放出され、自然界の浄化作用に負荷がかかり、徐々にではあるが明確に、
環境破壊が進行しており、大きな社会問題となっている。

【０００３】このような背景の下で、各種化学物質には生分解性が求められたり、各種化学物質の廃棄の際にはそれらを生分解する微生物等で処理を施す等の必要性が高まっている。 また、環境中に放出された各種化学物質を生物機能を利用して分解、除去して環境保全を行うバイオリメディエーション（ Bio - Remediation）の開発も進められている。

【０００４】Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸は、下記構造式

【０００５】

【化１】

【０００６】で示される化合物であり、その生分解性については報告されている（ Journalof American Oil
Chemists' Society ５２ 、４１−４３（１９７
５））が、その分解微生物に関する報告はない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を含む廃棄物あるいは排水の生分解による処理、あるいは該物質をターゲットとしたバイオリメディエーションのために、該物質を分解資化する能力を有する微生物の利用が有効となる。 従って、本発明はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を分解資化する能力を有する微生物を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目的を達成するために、広く自然界よりＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸分解資化性微生物を探索した結果、兵庫県伊丹市の土壌中より得られた、アクロモバクター属に属する２菌株およびシュードモナス属に属する１菌株が前記の目的を達成するものであることを認め、本発明を完成するに至った。

【０００９】本発明のＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸分解資化性微生物は、アクロモバクター属に属する細菌、特にアクロモバクター エスピー（Achrom
obacter sp. ）Ｈ１（ＣＤＣ group Ｖ _d ）およびアクロモバクター エスピー（Achromobacter sp. ）Ｈ２
（ＣＤＣ group Ｖ _d ）、ならびにシュードモナス属に属する細菌、特にシュードモナス ピッケッティ（Pseu
domonas pickettii ）Ｈ３である。

【００１０】上記の特定の菌株は以下に示すような菌学的性質を有する。

【００１１】なお、菌学的性質の試験および分類法は「バージェーズ マニュアル オブディターミネイティブ バクテリオロジー（ Bergey's Manual of Deter
minative Bacteriology）第８版（１９７４年）」、
「バージェーズ マニュアルオブ システマティック
バクテリオロジー（Bergey ^' s Manual of Systematic
Bacteriology ）（１９８６年）」、およびアメリカン ディジーズ コントロール（American Disease Cot
rol ）のＣＤＣ group （ Centers for Disease C
ontrol）に基づいて行った。

【００１２】 (1) アクロモバクター エスピー（Achromobacter sp. ）Ｈ１（ＣＤＣ grou p Ｖ _d ） A.形 態 (1) 細胞の形 桿菌、直ないし僅かに湾曲 (2) 細胞の大きさ 0.3 ×1.0-2.0 （μｍ） (3) 運動性の有無 ＋（ヤヤマハ゛ラナ側毛、波状） (4) 胞子の有無 − (5) グラム染色 − (6) 抗酸性染色 − B.各培地における生育状態 (1) 標準寒天平板培養 薄茶色、光沢アリ、 正円、スムース゛ (2) 標準寒天斜面培養 薄茶色、光沢アリ、 スムース゛、凝水部分サンコ゛ 色 (3) 標準液体培養 ほぼ均一に混濁 (4) 標準ゼラチン穿刺培養 上層部のみ僅かに混濁 (5) リトマスミルク 変化なし C.生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元性 ＋ (2) 脱窒反応 ＋ (3) メチルレッド試験 − (4) アセチルメチルカルヒ゛ノール の生成 − (5) インドールの生成 − (6) 硫化水素の生成 − (7) 澱粉の加水分解 − (8) クエン酸の利用 − (9) 無機窒素源の利用 硝酸塩：− アンモニウム塩：− (10) 色素の生成 − (11) ウレアーゼ活性 ＋ (12) オキシダーゼ活性 ＋ (13) カタラーゼ活性 ＋ (14) 生育の範囲 ｐＨ 9.0 ＋ 6.0 ＋ 5.5 − 5.0 − 温度 10℃＋ 30℃＋ 35℃− 40℃− (15) 酸素に対する態度 好気性 (16) ジオキシアセトンの生成 − (17) 馬尿酸の分解 − (18) アミノ酸の分解 リシ゛ン − アルキ゛ニン − オルニチン − (19) フェニルアラニンの脱アミノ − (20) 温度抵抗性（85℃、10分） − (21) 塩化ナトリウムの耐性 2.0%＋ 5.0%− 7.0%− 10% − (22) サブロウ寒天培地の生育 − (23) 0.001 ％リゾチーム培地の生育 ＋ (24) チロシンの分解 ＋ (25) クエン 酸・アンモニウム 寒天でのアルカリ産生 − (26) カゼインの分解性 − (27) ゼラチンの分解性 − (28) 嫌気性培地における発育性 − (29) マッコンキー培地生育性 ＋ ^W (30) レシチナーゼ反応 − (31) ＶＰ培地におけるアルカリ産生能 ＋ ^W (32) 糖類の利用と生酸性 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ ^W麦芽糖 ＋ しょ糖 ＋ ^W乳糖 − トレハロース ＋ Ｄ−ソルビット ＋ Ｄ−マンニット ＋ イノシット − グリセリン ＋ デンプン − メリビオース − サリシン − エタノール − (33) エスクリン加水分解 − (34) グルコン酸の酸化 − （ｗ＝weak）

【００１３】 (2) アクロモバクター エスピー（Achromobacter sp. ）Ｈ２（ＣＤＣ grou p Ｖ _d ） A.形 態 (1) 細胞の形 桿菌、直ないし僅かに湾曲 (2) 細胞の大きさ 0.3 ×1.0-2.0 （μｍ） (3) 運動性の有無 ＋（ヤヤマハ゛ラナ側毛、波状） (4) 胞子の有無 − (5) グラム染色 − (6) 抗酸性染色 − B.各培地における生育状態 (1) 標準寒天平板培養 薄茶色、光沢アリ、 正円、スムース゛ (2) 標準寒天斜面培養 薄茶色、光沢アリ、 スムース゛、凝水部分サンコ゛ 色 (3) 標準液体培養 ほぼ均一に混濁 (4) 標準ゼラチン穿刺培養 上層部のみ僅かに混濁 (5) リトマスミルク 変化なし C.生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元性 ＋ (2) 脱窒反応 ＋ (3) メチルレッド試験 − (4) アセチルメチルカルヒ゛ノール の生成 − (5) インドールの生成 − (6) 硫化水素の生成 − (7) 澱粉の加水分解 − (8) クエン酸の利用 − (9) 無機窒素源の利用 硝酸塩：− アンモニウム塩：− (10) 色素の生成 − (11) ウレアーゼ活性 ＋ (12) オキシダーゼ活性 ＋ (13) カタラーゼ活性 ＋ (14) 生育の範囲 ｐＨ 9.0 ＋ 6.0 ＋ 5.5 − 5.0 − 温度 10℃＋ 30℃＋ 35℃− 40℃− (15) 酸素に対する態度 好気性 (16) ジオキシアセトンの生成 − (17) 馬尿酸の分解 − (18) アミノ酸の分解 リシ゛ン − アルキ゛ニン − オルニチン − (19) フェニルアラニンの脱アミノ − (20) 温度抵抗性（85℃、10分） − (21) 塩化ナトリウムの耐性 2.0%＋ 5.0%− 7.0%− 10% − (22) サブロウ寒天培地の生育− (23) 0.001 ％リゾチーム培地の生育 ＋ (24) チロシンの分解 ＋ (25) クエン 酸・アンモニウム 寒天でのアルカリ産生 − (26) カゼインの分解性 − (27) ゼラチンの分解性 − (28) 嫌気性培地における発育性 − (29) マッコンキー培地生育性 ＋ ^W (30) レシチナーゼ反応 − (31) ＶＰ培地におけるアルカリ産生能 ＋ ^W (32) 糖類の利用と生酸性 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ ^W Ｄ−ガラクトース ＋ ^W麦芽糖 ＋ ^Wしょ糖 ＋ ^W乳糖 − トレハロース ＋ Ｄ−ソルビット ＋ Ｄ−マンニット ＋ イノシット − グリセリン ＋ デンプン − メリビオース − サリシン − エタノール − (33) エスクリン加水分解 − (34) グルコン酸の酸化 − （ｗ＝weak）

【００１４】 (3) シュードモナス ピッケッティ（Pseudomonas picekettii ）Ｈ３ A.形 態 (1) 細胞の形 桿菌、直ないし僅かに湾曲 (2) 細胞の大きさ 0.5-0.7 ×1.0-1.5 （μｍ） (3) 運動性の有無 ＋（単極毛） (4) 胞子の有無 − (5) グラム染色 − (6) 抗酸性染色 − B.各培地における生育状態 (1) 標準寒天平板培養 薄茶色、光沢アリ、 正円、スムース゛ (2) 標準寒天斜面培養 薄茶色、光沢アリ、 スムース゛ (3) 標準液体培養 ほぼ均一に混濁 (4) 標準ゼラチン穿刺培養 上層部のみ僅かに混濁 (5) リトマスミルク 変化なし C.生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元性 ＋ (2) 脱窒反応 ＋ (3) メチルレッド試験 − (4) アセチルメチルカルヒ゛ノール の生成 − (5) インドールの生成 − (6) 硫化水素の生成 − (7) 澱粉の加水分解 − (8) クエン酸の利用 ＋ (9) 無機窒素源の利用 硝酸塩：＋ アンモニウム塩：− (10) 色素の生成 − (11) ウレアーゼ活性 ＋ (12) オキシダーゼ活性 ＋ (13) カタラーゼ活性 ＋ (14) 生育の範囲 ｐＨ 9.0 ＋ 5.0 ＋ 4.5 ＋ 4.0 − 温度 10℃＋ 30℃＋ 35℃＋ 40℃− (15) 酸素に対する態度 好気性 (16) ジオキシアセトンの生成 − (17) 馬尿酸の分解 − (18) アミノ酸の分解 リシ゛ン − アルキ゛ニン − オルニチン − (19) フェニルアラニンの脱アミノ − (20) 温度抵抗性（85℃、10分） − (21) 塩化ナトリウムの耐性 2.0%＋ 5.0%− 7.0%− 10% − (22) サブロウ寒天培地の生育 − (23) 0.001 ％リゾチーム培地の生育 ＋ (24) チロシンの分解 − (25) クエン 酸・アンモニウム 寒天でのアルカリ産生 ＋ (26) カゼインの分解性 − (27) ゼラチンの分解性 − (28) 嫌気性培地における発育性 − (29) マッコンキー培地生育性 ＋ ^W (30) レシチナーゼ反応 − (31) ＶＰ培地におけるアルカリ産生能 ＋ ^W (32) 糖類の利用と生酸性 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ ^W Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ 麦芽糖 − しょ糖 − 乳糖 − トレハロース ＋ Ｄ−ソルビット ＋ Ｄ−マンニット ＋ ^Wイノシット ＋ グリセリン − デンプン − メリビオース − サリシン − エタノール − (33) エスクリン加水分解 − （ｗ＝weak）

【００１５】以上の菌学的性質よりＨ１およびＨ２株はアクロモバクター属に属すると、考えられるが、アクロモバクター属の多くは、現在ではシュードモナス属やアルカリゲネス（Alcaligenes ）属あるいはアシネトバクター（Acinetobacter ）属に移行されており、分類未定のものがＣＤＣ group として群別されている。 Ｈ１およびＨ２株はシュードモナス属とアルカリゲネス属との中間的な性状を示し、それぞれに該当する菌種が見出されないため、最も近い性状のＣＤＣ group Ｖ _dと判定し、それぞれ、アクロモバクター エスピー Ｈ１（Ｃ
ＤＣ groupＶ _d ）およびアクロモバクター エスピー Ｈ２（ＣＤＣ group Ｖ _d ）と命名した。

【００１６】また、Ｈ３株は、菌学的性質よりシュードモナス ピッケッティの１菌種と判定され、シュードモナス ピッケッティ Ｈ３と命名した。

【００１７】上記菌株を以下のように工業技術院微生物工業研究所に寄託した。 アクロモバクター エスピー Ｈ１（ＣＤＣ group
Ｖ _d ）（微工研菌寄第１３５２１号） アクロモバクター エスピー Ｈ２（ＣＤＣ group
Ｖ _d ）（微工研菌寄第１３５２２号） シュードモナス ピッケッティ Ｈ３（微工研菌寄第１
３５２３号）

【００１８】本発明の微生物は、前記アクロモバクター属Ｈ１，Ｈ２株およびシュードモナス ピッケッティ
Ｈ３株の他、アクロモバクター属あるいはシュードモナス属に属する微生物でＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を分解資化する能力を有する菌株を包含するものである。 また、これらの菌株の天然または人為的変異株やＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸の分解資化の代謝活性に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の微生物菌株であっても本発明の微生物に属する。

【００１９】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれら実施例に限定されるものではない。 なお、％は他に特記せぬ限りｗ／ｖ％である。

【００２０】実施例 １ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を分解資化性菌株の分離：兵庫県伊丹市で採取した土壌サンプルの約１ｇを滅菌した０．８５％ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌに分散し、上澄液の０．１ｍｌをＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を含む液体培地１０ｍｌに添加し、２５℃にて好気的に振とう培養した。 用いた液体培地の組成を以下に示す。 Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸 １ｍＭ 塩化アンモニウム １ｍＭ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２％ 塩化カルシウム・２水塩 ０．００２％ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍＭ （ＨＣｌあるいはＮａＯＨでｐＨを７．０に調整）

【００２１】培養開始後、７日毎に培養液の一部をサンプリングし、培養液中の全有機体炭素（ＴＯＣ）量をＪ
ＩＳ Ｋ ０１０２の２２． に記載の方法に準じて測定した。 なお、ＴＯＣ量の測定には（株）島津製作所製全有機体炭素計ＴＯＣ−５０００を用いた。 本測定機の使用法は取扱説明書に従った。

【００２２】培養の進行にともなって、ＴＯＣ量の減少が認められた培養液を１白金耳とり、普通寒天培地（日水製薬（株）製 Code ０５５１４）へストリークし、
生育したコロニーを肉眼観察により種類分けし、同培地で２〜３回純化することにより均一化された菌株３６株を得た。

【００２３】得られた菌株を前記のＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を含む液体培地に接種し、２５
℃にて好気的に振とう培養し、前述の方法により経時的に培養液中のＴＯＣ量を測定し、顕著なＴＯＣ量の減少を与える３菌株を得、菌株の同定実験を行った。 その結果、前述の如く、これらの菌株をアクロモバクターエスピー Ｈ１（ＣＤＣ group Ｖ _d ）、アクロモバクター エスピー Ｈ２（ＣＤＣ group Ｖ _d ）およびシュードモナス ピッケッティ Ｈ３と命名した。

【００２４】実施例 ２ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を単一Ｃ源として用いたときのＨ１，Ｈ２およびＨ３株の該物質分解資化性の検討：実施例１で得られたＨ１，Ｈ２およびＨ３株を表１に示すＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を単一Ｃ源として添加して液体培地および対照区として該物質を無添加の液体培地に接種し、２５℃で好気的に振とう培養し、培養の進行にともなうＴＯＣ
量、生菌数およびｐＨの変動を測定した。 ＴＯＣ量の測定は実施例１と同様に行い、生菌数の測定は、サンプリングした培養液を０．８５％ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で適宜稀釈し、普通寒天培地（日水製薬（株）製 Code ０５５１４）に塗布し、２
５℃で２日間好気的にに静置培養後、生育したコロニー数により、算出した。 なお、ブランク試験は微生物を接種しない区分とした。

【００２５】

【００２６】この結果を図１に示す。 この結果より、Ｈ
１，Ｈ２およびＨ３株とも試験区でのみ生育し、かつＴ
ＯＣ量の減少にともなって生菌数が増加することより、
これらの菌株はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２
酢酸を単一Ｃ源として用いた場合、該物質を分解資化する。 また、これらの菌株は上記の培養条件でＮ−（２−
ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を５〜６日間で完全に分解した。

【００２７】実施例 ３ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を単一Ｃ，
Ｎ源として用いたときのＨ１，Ｈ２およびＨ３株の該物質分解資化性の検討：実施例１で得られたＨ１，Ｈ２およびＨ３株を表２に示すＮ−（２−ヒドロキエチル）イミノ２酢酸を単一Ｃ，Ｎ源として添加した液体培地および対照区として該物質を無添加の液体培地に接種し、２
５℃で好気的に培養し、培養の進行にともなうＴＯＣ
量、生菌数およびｐＨの変動を実施例２と同様にして測定した。 なお、ブランク試験は微生物を接種しない区分とした。

【００２８】

【００２９】この結果を図２に示す。 この結果より、Ｈ
１，Ｈ２およびＨ３株とも試験区でのみ生育し、かつＴ
ＯＣ量の減少にともなって生菌数が増加することより、
これらの菌株はＮ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２
酢酸を単一Ｃ，Ｎ源として用いた場合、該物質を分解資化している。 また、これらの菌株は上記の培養条件でＮ
−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を３〜４日間で完全に分解した。

【００３０】

【発明の効果】以上詳細に説明したとおり、発明により、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を分解資化する能力を有する微生物が得られた。 これらの微生物を用いることにより、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
イミノ２酢酸を含む廃棄物あるいは排水の生分解による処理、あるいは該物質をターゲットとしたバイオリメディエーションを有効に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を単一Ｃ源として用いたときのＨ１，Ｈ２およびＨ３株の培養経過を示すグラフである。

【図２】Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ２酢酸を単一Ｃ，Ｎ源として用いたときのＨ１，Ｈ２およびＨ３
株の培養経過を示すグラフである。

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