一种利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法专利检索-植物修复生物修复环境工程专利检索查询-专利查询网

一种利用荧光定量PCR检测 植物对甲醛 代谢能 力的方法

阅读：408发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法，用于荧光定量PCR检测的引物为：FALDH‑QP3：tggacttggagcagtttgga，FALDH‑QP4：gccaattattcgtgaagcacc，CK‑P1：cctccaatccagacactgta，CK‑P2：ggagaagatctggcatcaca；利用这些引物对植物的叶片进行荧光定量PCR扩增，根据FALDH基因的相对表达量可以快速准确判断植物对甲醛的代谢能力。植物对甲醛有一定的清除能力，但不同的植物对甲醛的代谢能力大小不同；快速准确分析植物对甲醛的代谢能力，将有助于指导人们选择合适的花卉植物修复甲醛的污染。，下面是一种利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法，其特征在于所述方法是比较荧光定量PCR扩增待测植物的FALDH基因表达量与actin基因表达量比值大小判断待测植物对甲醛代谢能力的大小，用于荧光定量PCR扩增FALDH基因的引物为FALDH-QP3和FALDH-QP4，用于荧光定量PCR扩增actin基因的引物为CK-P1和CK-P2：
FALDH-QP3：tggacttggagcagtttgga，FALDH-QP4：gccaattattcgtgaagcacc，CK-P1：
cctccaatccagacactgta，CK-P2：ggagaagatctggcatcaca；
所述待测植物为铁线蕨、滴水观音、矮牵牛、常春藤或吊兰中的一种。
2.如权利要求1所述利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法，其特征在于所述检测方法为：以待测植物mRNA逆转录形成的DNA为模板，以FALDH-QP3和FALDH-QP4为引物进行荧光定量PCR反应，获得待测植物FALDH基因扩增产物；同样条件下，以待测植物RNA等量均匀混合后的mRNA逆转录形成的DNA为内参模板，以CK-P1和CK-P2为内参引物进行荧光定量PCR反应，获得actin基因扩增产物；比较待测植物FALDH基因扩增产物表达量和actin基因扩增产物表达量的比值，获得待测植物FALDH基因的相对表达量，根据相对表达量的高低判断待测植物代谢甲醛的能力大小，相对表达量高则待测植物对甲醛代谢能力高。
3.如权利要求2所述利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法，其特征在于所述内参模板为5种植物RNA等量均匀混合后的mRNA逆转录形成的DNA；所述5种植物为铁线蕨、滴水观音、矮牵牛、常春藤和吊兰。

说明书全文

一种利用荧光定量PCR检测 植物对甲醛 代谢能 力的方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物代谢甲醛能力的检测方法，特别涉及一种利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法。(二)背景技术

[0002] 随着我国现代化进程的不断推进，人们对生活品质的要求日趋提高，在居住条件大幅度改善的同时，室内环境由于各种新材料和设备的应用而不可避免地受到污染。如今室内空气污染作为危害公众健康的重要因素之一，越来越受到人们的关注。在室内空气污染中，除悬浮状物污染外，室内装饰材料散发的甲醛是主要的污染物。甲醛作为室内主要的污染物，已被世界卫生组织归为第一类致癌物，可导致癌症、胎儿畸形等多种疾病。绿色花卉植物因能美化环境而被引入室内。相比其他物理和化学修复技术，利用植物修复具有成本低、无二次污染、净化持久等特点。植物对甲醛有一定的清除能力，通常人们根据生活经验选择花卉放置室内以期消除甲醛污染；但并非每种盆栽花卉对甲醛都具有较大的吸收能力，每种盆栽花卉净化能力各不相同。不同的花卉植物对甲醛的代谢能力高低究竟如何？目前尚缺乏完整的、可靠准确的判断方法。而且，花卉植物的种类繁多，究竟选择哪种花卉植物放置于室内，以便达到最佳的清除甲醛、净化空气的效果？这些问题都有待解决。(三)发明内容

[0003] 本发明目的是提供一种植物甲醛代谢能力荧光定量PCR检测方法，利用这些特别设计的引物对植物的叶片进行荧光定量PCR扩增，根据FALDH基因的相对表达量可以快速准确判断植物对甲醛的代谢能力。

[0004] 本发明采用的技术方案是：

[0005] 本发明提供一种利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法，所述方法是比较荧光定量PCR扩增待测植物的FALDH基因表达量与actin基因表达量比值大小判断待测植物对甲醛代谢能力的大小，用于荧光定量PCR扩增FALDH基因的引物为FALDH-QP3和FALDH-QP4，用于荧光定量PCR扩增actin基因的引物为CK-P1和CK-P2：

[0006] FALDH-QP3：tggacttggagcagtttgga，

[0007] FALDH-QP4：gccaattattcgtgaagcacc，

[0008] CK-P1：cctccaatccagacactgta，CK-P2：ggagaagatctggcatcaca。

[0009] 进一步，所述植物甲醛代谢能力荧光定量PCR检测方法为：以待测植物mRNA逆转录的DNA为模板，以FALDH-QP3和FALDH-QP4为引物进行荧光定量PCR反应，获得待测植物FALDH基因扩增产物；同样条件下，以待测植物RNA等量均匀混合后的mRNA逆转录形成的DNA为内参模板，以CK-P1和CK-P2为内参引物进行荧光定量PCR反应，获得actin基因扩增产物；比较待测植物FALDH基因扩增产物和actin基因扩增产物比值，获得待测植物FALDH基因的相对表达量，根据相对表达量的高低判断待测植物代谢甲醛的能力大小，相对表达量高则待测植物对甲醛代谢能力高。

[0010] 进一步，所述待测植物为花卉植物，优选所述待检测植物为铁线蕨、滴水观音、矮牵牛、常春藤或吊兰中的一种。

[0011] 进一步，所述内参模板为5种植物RNA等量均匀混合后的mRNA逆转录形成的DNA；所述5种植物为铁线蕨、滴水观音、矮牵牛、常春藤和吊兰。

[0012] 本发明方法可以检测蕨类、天南星科、茄科、五加科、百合科等不同科属类型的花卉植物。

[0013] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种植物甲醛代谢能力荧光定量PCR检测方法，利用这些引物对植物的叶片进行荧光定量PCR扩增，根据FALDH基因的相对表达量可以快速准确判断植物对甲醛的代谢能力，植物对甲醛有一定的清除能力，但不同的植物对甲醛的代谢能力大小不同；快速准确分析植物对甲醛的代谢能力，将有助于指导人们选择合适的花卉植物修复甲醛的污染。(四)附图说明

[0014] 图1甲醛含量的标准曲线。

[0015] 图2不同植物FALDH基因的相对表达量。(五)具体实施方式

[0016] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0017] 实施例1

[0018] 一、不同花卉植物对甲醛代谢能力的生理分析

[0019] (一)、实验材料

[0020] 选择5种属于不同科属的常见室内花卉植物：矮牵牛、吊兰、常春藤、滴水观音(海芋)、铁线蕨。

[0021] (二)、实验方法以及步骤

[0022] 参照国家环境保护标准公布的方法(标准编号：HJ601-2011，水质甲醛的测定乙酰丙酮分光光度法[S])(下载网站：http://www.zhb.gov.cn/gkml/hbb/bgg/201102/W020110216389531775025.pdf)，测定甲醛处理液中甲醛的含量，每间隔一定时间测定1次，每次测定实验重复3次以上，取至少3次重复一致的结果，求其平均值。

[0023] 1、MS液体培养基的配制

[0024] MS液体培养基终浓度组成为参照文献：Murashige T and Skoog F(1962)A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant 15(3):473-497。配置方法如下：(1)在500mL容量瓶中加入少量双蒸馏水。(2)用量筒取10×(即10倍)MS大量元素的母液50mL，用微量进样器取100×MS微量元素的母液5mL，100×Fe2+盐的母液5mL，100×有机物的母液5mL加入容量瓶中，用天平秤取15g蔗糖，(3)用蒸馏水定容到总体积500mL。(4)用酸度仪将培养基浓度调至5.8-5.9。(5)分装到2只500mL的三角瓶中，每瓶装入250mL，放入高温高压灭菌锅中，于121.3℃中灭菌25分钟。

[0025] 2、甲醛溶液标准曲线的制定

[0026] (1)分别配制不同甲醛浓度(如：1-100mg/L不同的浓度)的MS液体培养基；(2)取含甲醛的MS液体培养基1mL，加入4mL Nash 试剂(即：称取乙酸铵150g，双蒸馏水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1000mL。Nash试剂均现配现用)。30℃水浴加热30min，利用紫外分光光度计，在413nm下测定光密度(OD)值，并制备标准曲线。

[0027] 3、花卉植物甲醛代谢能力的测定

[0028] (1)取62.5μL液态甲醛(饱和的甲醛试剂)加入500mL MS液体培养基中，制成含有50mg/L甲醛的MS液体培养液，50mg/L培养液用于不同花卉植物的处理。(2)取植物(实验材料部分所述植物)离体叶片各0.5g，放入密封的培养瓶中；向培养瓶中加入40mL含50mg/L甲醛的MS液体培养基。(3)将培养瓶放于19±2℃光照环境下培养。(4)在培养24h、48h、72h、
96h后分别取样1mL；加入4mL Nash试剂，30℃水浴加热30min，利用紫外分光光度计，在
413nm下测定光密度(OD)值。(5)与甲醛溶液的标准曲线进行比较，获取培养液中甲醛浓度，进一步比较不同植物对甲醛的代谢能力。

[0029] (三)、实验结果

[0030] 1、甲醛标准曲线

[0031] 测定的不同甲醛浓度和光密度之间的相关系数如下表1。其对应的标准曲线如图1。

[0032] 表1甲醛浓度和光密度的相关系数

[0033]

[0034] 2、不同花卉植物对甲醛的代谢能力

[0035] 不同花卉植物叶片培养24h、48h、72h、96h后培养液在A413nm处的吸光度见表2。

[0036] 表2不同花卉植物叶片处理液的光密度

[0037]

[0038] 根据测定的光密度与制定的甲醛浓度的标准曲线进行比对，获得不同花卉植物在不同处理时间后，培养液中甲醛的剩余含量。分析结果显示，不同花卉植物对甲醛的吸收代谢均具有一定的代谢能力；在起始24小时阶段，虽然不同花卉植物对甲醛的吸收代谢具有一定的差异，但其差异不甚明显。随着时间的延长，不同花卉对甲醛的吸收代谢能力出现较大的变化。具体结果见表3。在96小时后，培养液中剩余的甲醛含量从多到少依次为：铁线蕨、滴水观音、矮牵牛、常春藤、吊兰，即表明，吊兰对甲醛的代谢能力最强，96小时后在培养液中的剩余甲醛含量为7.55mg/L；铁线蕨对甲醛的代谢能力相当较弱，培养液中剩余甲醛的含量相对仍然较高，在为30.38mg/L；而矮牵牛居中，培养液中剩余甲醛的含量为23.84mg/L。

[0039] 表3不同花卉植物叶片处理液中甲醛的剩余含量

[0040]

[0041] 二、不同花卉植物中FALDH基因的克隆以及不同花卉植物中FALDH基因的荧光定量PCR分析

[0042] 谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶，其编码基因是FALDH，是植物中自身存在的与甲醛异化作用有关的一个酶(Achkor H,Díaz M,Fernández MR,Biosca JA,Parés X,Martínez MC.Enhanced formaldehyde detoxification by overexpression of glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase from Arabidopsis.Plant Physiol,2003,132(4):2248-225)。

[0043] 1、引物的设计

[0044] 根据在GenBank中收录的FALDH基因的序列(如：AB618795.1等)以及肌动蛋白actin基因的序列(如：DQ115881.1等)，利用ClustalW 软件和DNAstar软件分析同源区段序列，并在此基础上分别设计多个引物。设计的引物如表4。

[0045] 表4 FALDH基因和actin基因的引物序列

[0046]

[0047]

[0048] 2、提取RNA，合成cDNA第一链，RT-PCR和荧光定量PCR扩增

[0049] 首先利用Trizol方法提取不同植物的总RNA，步骤如下：(1)取不同植物的幼嫩叶片100mg，分别置于RNase-free 1.5mL EP管中，加入液氮，研磨成粉末。(2)加入1mL Trizol，剧烈摇晃混合均匀，置冰上10min，4℃，12000r/min，离心15min。(3)取上层裂解液，加入0.2mL的氯仿，充分颠倒混匀，冰上孵育1-5min，4℃，12000r/min，离心10min。(4)小心吸取0.4mL上层水相转移到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，冰上孵育10min，沉淀RNA。4℃，12000r/min，离心10min。(5)弃上清，立即加入1mL 75％酒精(DEPC处理水配制)洗涤沉淀，4℃，12000r/m，离心5min，根据需要可重复一次。(6)尽可能吸上清，超净台上吹干，用20μL DEPC处理水溶解。(7)取1μL，稀释10倍测浓度，取3μL进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余-80℃保存或进行后续实验。

[0050] 利用分光光度法测定提取的不同植物的RNA的含量和浓度，并调整为到0.1μg/μL。利用逆转录试剂盒(若Takara公司的产品)，按照试剂盒的说明方法，对获得的mRNA进行逆转录，生成cDNA，作为扩增FALDH基因的模板。另一方面，调配提取的不同植物RNA浓度，取不同植物的相同浓度的RNA各10μL均匀混合，逆转录获得的cDNA作为每种植物actin基因扩增的模板。然后按照常规方法，进行RT-PCR和荧光定量PCR扩增。

[0051] 3、结果：

[0052] (1)FALDH基因的克隆

[0053] 选取具有代表性的5种花卉植物进行RT-PCR扩增。扩增反应结束后，扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统观察并拍照保存。各对引物克隆不同植物里的FALDH基因的情况如表5。所得到预期的大小DNA片段，属于FALDH基因的片段，将产物放置4℃备用。

[0054] 表5不同引物对FALDH基因扩增的结果

[0055]

[0056] 在开始设计的FALDH-P1～FALDH-P6这3对引物中，不能从所有的5种植物中克隆获取FALDH基因。考虑到这个因素，将从矮牵牛中克隆的FALDH基因序列进行blast对比，从GenBank数据库中找出10条相似度高的序列(如：DQ115881、KC963103.1、KC963106.1、NM_123761.3、NM_001203539.1、XM_015771683.1、NC_029257.1、XM_009631265.1、XM_
015232743.1、HQ620558.1等)，并进一步找出这10条序列最保守的基因序列，设计简并引物，即重设计获得FALDH-P7/P8这对引物。利用这对引物进行扩增，均能从所有的植物中扩增出目的基因。将扩增的目的基因送去测序，其中矮牵牛的序列为583bp，如SEQ ID NO.1所示。把得到的序列片段进行blast对比，表明获得的为FALDH基因序列。

[0057] SEQ ID NO.1：

[0058] ggagtggtaaggatcctgagggtcttttcccatgtattcttggtcatgaggctgctggaatagtcgaaagtgttggtgaaggcgtgactgaagttcagcctggagaccatgttataccttgttaccaggcagaatgcagggaatgcaagttttgcaagtcagggaagacaaacctttgtggaaaagtgaggggagctactggagttggagttatgatgagtgatcgcaagactcgtttctcaataaacggaaaaccgctctaccatttcatgggaacttcaacttttagtcagtacactgttgtccatgatgttagtgttgccaagattgatccaaaagctcctttggagaaagtttgccttcttggttgtggtattccaactggacttggagcagtttggaacaccgccaaagtagaaccaggttccattgttgctgtttttggtcttgggactgttggtcttgcagtggctgagggtgcaaaagcagcgggtgcttcacgaataattggcatagatattgacagcaaaaagtacgagagagcaaagaactttggtgtcaccgaatttgtgaacccaaagga。

[0059] (2)荧光定量PCR结果

[0060] 根据我们克隆的5种植物的FALDH基因序列，以及数据库中的具有相似性的10条序列(如：DQ115881、KC963103.1、KC963106.1、NM_123761.3、NM_001203539.1、XM_015771683.1、NC_029257.1、XM_009631265.1、XM_015232743.1、HQ620558.1等)，我们进行比对后，根据它们的保守区段，重新设计荧光定量PCR的引物(即：用于荧光定量PCR的引物)，FALDH基因的引物为：FALDH-QP1、FALDH-QP2、FALDH-QP3、FALDH-QP4。同时，设计肌动蛋白基因的引物，即：actin基因的引物为：CK-P1、CK-P2。具体序列见前述的表4。利用这些引物进行荧光定量PCR分析，分析不同植物中FALDH基因的相对表达量(即待测植物FALDH基因扩增产物表达量和actin基因扩增产物表达量比值)，进一步比较不同植物对甲醛的代谢能力。

[0061] 提取这5种植物总的RNA，进行逆转录。首先进行普通RT-PCR扩增，其中FALDH-QP1、FALDH-QP2只在矮牵牛和常春藤中扩增出条带；而FALDH-QP3、FALDH-QP4能在所有植物中扩增出条带，且与预期大小相同。CK-P1、CK-P2在所有植物中均能扩增出条带，且与预期相同。因此，选用FALDH-QP3、FALDH-QP4作为扩增FALDH基因的引物，CK-P1、CK-P2作为扩增内参acitn基因的引物，进行荧光定量PCR分析。

[0062] 荧光定量PCR实验步骤如下：提取RNA的方法和cDNA链的合成的方法同前。把合成的cDNA稀释10倍，用于荧光定量实验，按照DBI Bioscience公司的Bestar SybrGreen qPCR Mastermix试剂盒配制反应体系，使用Step One PlusTM Real-Time PCR System荧光定量PCR仪器，采用两步法PCR反应程序进行扩增，即95℃预变性10min，按照95℃变性15s，60℃退火60s，进行39个循环，溶解曲线设置为95℃15min，60℃1min，95℃15s。荧光定量反应PCR体系如下：

[0063]

[0064] 获得的FALDH基因的相对表达量如图2。FALDH的相对表达量中，吊兰>常春藤>矮牵牛>滴水观音>铁线蕨。实验结果显示，荧光定量PCR分析的实验结果中，FALDH的相对表达量的大小与该植物代谢甲醛的能力大小成正比，而且与生理指标测定的实验结果是相一致的。

[0065] 综上所述，利用设计的FALDH基因的引物FALDH-QP3：5’-tggacttggagcagtttgga-3’，FALDH-QP4：5’-gccaattattcgtgaagcacc-3’；内参肌动蛋白基因引物CK-P1：5’-cctccaatccagacactgta-3’和CK-P2：5’-ggagaagatctggcatcaca-3’。利用这些引物对植物的叶片进行荧光定量PCR扩增，根据FALDH基因的相对表达量可以快速准确判断植物对甲醛的代谢能力的高低。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种促进植物生长发育及强化积累污染土壤重金属的生物修复试剂及修复方法	2020-05-08	530
一株降解PAEs的植物内生菌及在修复PAEs污染土壤中的应用	2020-05-11	387
一种适用于多地区重金属污染土壤的生态修复方法	2020-05-16	198
一种酸性土壤重金属镉污染的植物吸附联合修复方法	2020-05-13	241
一种翻斗式助力曝气生态修复系统	2020-05-13	361
一种用于植物修复土壤的络合剂微胶囊及其制备方法	2020-05-15	828
一种去除和回收污染土壤中重金属的方法	2020-05-16	663
一种利用草龙修复镉锌污染土壤的方法	2020-05-14	661
一种混合种植多年生湿地植物修复潮土类型植被的方法	2020-05-14	911
一种污染土壤植物修复及物理修复的辅助施工装置	2020-05-11	79

一种利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法

一种利用荧光定量PCR检测植物对甲醛代谢能力的方法

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：