一种治疗胰腺癌的中药组合物及其制备方法和应用
阅读：1发布：2022-09-21
专利汇可以提供一种治疗胰腺癌的中药组合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种 治疗 胰腺癌的中药组合物及其制备方法和应用。所述的中药组合物由以下各原料组成：山药20-25重量份、苍术4-8重量份、大枣15-20重量份、白扁豆10-20重量份、木瓜5-8重量份、巴戟天5-8重量份、天南星5-8重量份、瓜蒌10-15重量份、迎春花10-15重量份、布渣叶15-25重量份、预知子5-12重量份、山慈菇2-7重量份、九龙藤10-15重量份、小叶莲1-5重量份、藏菖蒲2-7重量份、天仙藤5-15重量份。该中药组合物具有健脾利湿、祛痰清热、化瘀活血、温胃理气等功效。动物实验显示，高、中剂量的该中药组合物可明显改善胰腺癌裸鼠移植瘤模型小鼠抑瘤率、脾指数、细胞周期、细胞凋亡，阻断Hedgehog 信号 通路关键分子的表达，同时无 副作用 。该中药组合物在治疗胰腺癌方面将具有广阔的应用前景。，下面是一种治疗胰腺癌的中药组合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种治疗胰腺癌的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：山药20-25重量份、苍术4-8重量份、大枣15-20重量份、白扁豆10-20重量份、木瓜
5-8重量份、巴戟天5-8重量份、天南星5-8重量份、瓜蒌10-15重量份、迎春花10-15重量份、布渣叶15-25重量份、预知子5-12重量份、山慈菇2-7重量份、九龙藤10-15重量份、小叶莲1-
5重量份、藏菖蒲2-7重量份以及天仙藤5-15重量份。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：山药22.5重量份、苍术6重量份、大枣17重量份、白扁豆15重量份、木瓜6.75重量份、巴戟天6.75重量份、天南星6.5重量份、瓜蒌12重量份、迎春花12.5重量份、布渣叶19.5重量份、预知子9重量份、山慈菇4.5重量份、九龙藤12重量份、小叶莲3.75重量份、藏菖蒲
4.5重量份以及天仙藤9重量份。
3.权利要求1或2所述的中药组合物在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，向权利要求1或2所述的中药组合物中加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法做成临床上适宜的各种药物制剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂为水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、片剂或口服液。
6.一种制备权利要求1或2所述的中药组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照权利要求1或2所述的重量份称取各原料；
(2)将步骤(1)称取得到的各原料混合后，加入原料总重量8-15倍的蒸馏水，浸泡1.5-
3h，之后煎煮1.5-3h，过滤，得到第一次中药组合物滤液以及残渣；
(3)向步骤(2)获得的中药组合物残渣中加入与步骤(2)相同体积的蒸馏水，浸泡中药组合物残渣1.5-3h，煎煮中药组合物残渣1.5-3h，过滤后，得到第二次中药组合物滤液；
(4)将第一次中药组合物滤液和第二次中药组合物滤液合并，混匀，即得所述的中药组合物的水煎剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括将得到的水煎剂放于蒸发容器内，并将蒸发容器放于实验室电热恒温鼓风干燥箱内72℃进行干燥6d，每天8次，每次间隔3h，得到中药组合物干膏；使用常规粉碎机将得到的中药组合物干膏进行粉碎，粉碎物经过100目
304不锈钢筛网过滤2次，400目304不锈钢筛网过滤2次，最终得到中药组合物干粉，分装，-
80℃冰箱内保存备用。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，第一次过滤分别采用6层白色纱布、17层白色纱布依次过滤，第二次过滤分别采用8层白色纱布、19层白色纱布依次过滤。
一种治疗胰腺癌的中药组合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和应用，特别涉及一种治疗胰腺癌的中药组合物及其制备方法和应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
[0002] 胰腺癌(Pancreatic Cancer)是指机体胰外分泌部发生的消化系统恶性肿瘤。近几年全世界胰腺癌发病率、患病率、死亡率均呈现上升趋势，其中，我们国家农村地区胰腺癌发病率多高于城市地区，同时，我们国家胰腺癌年度诊断率和死亡率已经超过北美发达国家(Lin QJ，Yang F，Jin C，et al.Current status and progress of pancreatic cancer in China[J].World J Gastroenterol，2015，21(26)：7988-8003.)，这些提示我们国家需要高度重视胰腺癌。
[0003] 胰腺癌起病多为隐袭，较少有特异性症状和体征，这会导致胰腺癌早期诊断、早期治疗较为困难，胰腺癌确诊时很多患者大多已有转移，容易播散至肝脏、腹膜、肺和局部淋巴结，手术治疗配伍药物治疗是胰腺癌治疗的最佳方案，但是，胰腺癌手术死亡率、术后复发率相对较高，5年存活率相对较低。因此，需要迫切提出新的治疗胰腺癌的策略。
[0004] 近年来，很多研究显示Hedgehog信号通路与胰腺癌的发生及其发展密切相关。在胚胎发育中，Hedgehog信号通路高度保守，该Hedgehog信号通路可以参与调控机体多种组织器官发育。Hedgehog信号通路包括配体(Shh)、膜受体(Ptch和Smo)、核转录因子(G1i家族)、调节因子等(Qin S，Sun D，Li H，et al.The Effect of SHH-Gli Signaling Pathway on the Synovial Fibroblast Proliferation in Rheumatoid Arthritis[J].Inflammation，2016，39(2)：503-512.)。一般而言，正常机体通常检测不到Hedgehog信号通路表达，已经证实多种恶性肿瘤与Hedgehog信号通路异常高度表达密切相关(Skoda AM，Simovic D，Karin V，et al.The role of the Hedgehog signaling pathway in cancer：
A comprehensive review[J].Bosn J Basic Med Sci，2018，18(1)：8-20.)，例如胰腺癌(Gu J，Saiyin H，Fu D，et al.Stroma A Double Edged Sword in Pancreatic Cancer：A Lesson From Targeting Stroma in Pancreatic Cancer With Hedgehog Signaling Inhibitors[J].Pancreas，2018，47(4)：382-389.)、胃癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、大肠癌、口腔癌、皮肤鳞癌等。已经证实，大部分胰腺癌患者出现Hedgehog信号通路活化，这将会改变胰腺癌生物学特征，尤其在胰腺癌患者早期就可以检测到胰腺内Hedgehog信号通路Shh、Ptch、Smo、Gli高表达，可见，Hedgehog信号通路在胰腺癌中起重要作用。
A comprehensive review[J].Bosn J Basic Med Sci，2018，18(1)：8-20.)，例如胰腺癌(Gu J，Saiyin H，Fu D，et al.Stroma A Double Edged Sword in Pancreatic Cancer：A Lesson From Targeting Stroma in Pancreatic Cancer With Hedgehog Signaling Inhibitors[J].Pancreas，2018，47(4)：382-389.)、胃癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、大肠癌、口腔癌、皮肤鳞癌等。已经证实，大部分胰腺癌患者出现Hedgehog信号通路活化，这将会改变胰腺癌生物学特征，尤其在胰腺癌患者早期就可以检测到胰腺内Hedgehog信号通路Shh、Ptch、Smo、Gli高表达，可见，Hedgehog信号通路在胰腺癌中起重要作用。
[0005] 在Hedgehog信号通路中存在三种配体Shh、Ihh和Dhh，其中，配体Shh研究较多。配体Shh是Hedgehog信号通路中高度保守的分泌型信号蛋白，其也是激活Hedgehog信号通路且起细胞间调节作用的关键蛋白，配体Shh与胆固醇转移酶作用相似，具有自我催化加工能力，还可以解除Ptch对Smo抑制并激活Smo(Du Z，Zhou F，Jia Z，et al.The hedgehog/Gli-1 signaling pathways is involved in the inhibitoryeffect of resveratrol on human colorectal cancer HCT116 cells[J].Iran J Basic Med Sci，2016，19(11)：
1171-1176.)。Ptch是膜蛋白受体，可以分为Ptch1和Ptch2，Ptch1和Ptch2均具有结合Shh和抑制Smo作用。Ptch是Hedgehog信号通路关键蛋白，Ptch表达上调是Hedgehog信号通路激活的关键因素，突变Ptch对Smo失去抑制作用，Smo激活下游Gli，引起Hedgehog信号通路靶基因激活(Wang LW，Lin H，Lu Y，et al.Sonic hedgehog expression in a rat model of chronic pancreatitis[J].World J Gastroenterol，2014，20(16)：4712-4717.)。Smo为原癌基因，其是Hedgehog信号通路关键成员。正常情况下缺失Shh时，Smo活性可以被Ptch抑制，而Smo对下游转录因子Gli活化状态又起控制作用。Gli主要包括三种分子Gli1、Gli2、Gli3且Gli1、Gli2、Gli3结构尤为相似。Gli1、Gli2、Gli3都有DNA结构域5个锌指结构，可与Hedgehog信号通路下游靶基因(GAC CAC CCA)特定序列结合而起调节作用。其中，Gli1具有强效转录激活因子作用，Gli2主要以转录激活因子形式存在，Gli3主要发挥转录抑制因子作用。
1171-1176.)。Ptch是膜蛋白受体，可以分为Ptch1和Ptch2，Ptch1和Ptch2均具有结合Shh和抑制Smo作用。Ptch是Hedgehog信号通路关键蛋白，Ptch表达上调是Hedgehog信号通路激活的关键因素，突变Ptch对Smo失去抑制作用，Smo激活下游Gli，引起Hedgehog信号通路靶基因激活(Wang LW，Lin H，Lu Y，et al.Sonic hedgehog expression in a rat model of chronic pancreatitis[J].World J Gastroenterol，2014，20(16)：4712-4717.)。Smo为原癌基因，其是Hedgehog信号通路关键成员。正常情况下缺失Shh时，Smo活性可以被Ptch抑制，而Smo对下游转录因子Gli活化状态又起控制作用。Gli主要包括三种分子Gli1、Gli2、Gli3且Gli1、Gli2、Gli3结构尤为相似。Gli1、Gli2、Gli3都有DNA结构域5个锌指结构，可与Hedgehog信号通路下游靶基因(GAC CAC CCA)特定序列结合而起调节作用。其中，Gli1具有强效转录激活因子作用，Gli2主要以转录激活因子形式存在，Gli3主要发挥转录抑制因子作用。
[0006] 资料显示，胰腺癌Hedgehog信号通路被异常激活可以伴有Gli1过度表达，并结合下游靶基因(GAC CAC CCA)特定序列结合而发挥作用(Gan H，Liu H，Zhang H，et al.SHh-Gli1 signaling pathway promotes cell survival by mediating baculoviral IAP repeat-containing 3(BIRC3)gene in pancreatic cancercells[J].Tumour Biol，2016，37(7)：9943-9950.)，形成负反馈调控环，诱使Hedgehog信号通路的Ptch转录，使靶基因活化，导致Hedgehog信号通路失控。已经证实，Gli靶基因涉及到肿瘤细胞生长、凋亡、转移、新生血管形成及上皮间质转化，例如Gli能够诱导细胞周期蛋白D1表达而促使胰腺癌细胞增殖，直接激活能够致使上皮组织成分向间质转化因子转录并增强胰腺癌细胞浸润性，直接诱导Bcl-2等抗凋亡因子表达、同时抑制Bax等促凋亡因子表达，会抑制胰腺癌细胞凋亡，最终直接调控Hedgehog信号通路的关键蛋白Ptch活化而促进胰腺癌细胞增殖。可见，有效阻断Hedgehog信号通路可抑制胰腺癌细胞生长、侵袭和转移，这是胰腺癌治疗的积极策略。
[0007] 目前，国内外诸多药物均可以治疗胰腺癌，如5-氟尿嘧啶(Wang WB，Yang Y，Zhao YP，et al.Recent studies of 5-fluorouracil resistance in pancreatic cancer[J].World J Gastroenterol，2014，20(42)：15682-15690.)、抗氧化剂、抗细胞凋亡药物、白藜芦醇(Xu Q，Zong L，Chen X，et al.Resveratrol in the treatment of pancreatic cancer[J].Ann N Y Acad Sci，2015，1348(1)：10-19.)、顺铂等，但是，很多药物均具有一定程度的副作用，会给胰腺癌患者的身体带来危害，为此，积极探寻副作用小或者无副作用，且非常有效的治疗胰腺癌药物尤为重要。
[0008] 中医理论认为，脾主运化，将会发挥转运输送、消化吸收等基本功能。脾主运化可分为运化水谷和运化水液两个方面，脾通过运化功能将会促使脏腑、经络等组织得到充分的营养。脾运化功能健旺，就能防止水湿、痰饮、湿阻、血瘀、热邪等病理产物的产生。一旦机体中焦脾功能失调将会出现脾虚，脾虚则木郁，脾虚则生湿，脾虚则运化失常，由表及里郁而化热，形成脾虚湿阻而诱发胰腺癌，故而胰腺癌需要健脾利湿。另外，机体脾虚则损脾，伴有内外湿热之邪相合，热毒内蓄，久留不去，渐成肿块，致痰、热、瘀、血结聚于脾，将会而形成癌瘤，故而胰腺癌需要祛痰清热、化痰活血。再有，机体脾虚则水谷运化失常，络脉不通，肝胆气机不利，肝胆气机受阻，肝胆疏泄失常，伴有正气亏损、外感湿热、饮食失常，最终而成癌瘤，故而胰腺癌需要理气通络。由此，经过中医理论基础的疾病病机分析可见，胰腺癌需要健脾利湿、祛痰清热、化痰活血、理气通络。
[0009] 中药具有协同效应较强、副作用较小、药物作用靶点较多、药物具有整体调节等积极特点，在延缓胰腺癌进程、增强免疫功能、提高抗氧化能力、减弱炎症反应、保护机体正常细胞等方面具有独特的积极优势，这为临床上治疗胰腺癌带来了希望(曹妮达，徐娇雅，陈彬，等.中药复方WCA-P及其拆方对人胰腺癌BxPC-3细胞悬液裸小鼠皮下接种瘤的影响[J].西部中医药，2017，30(1)：7-10.)。由此，寻找疗效较好且无副作用的中药组合物开展胰腺癌的治疗工作就显得尤为重要。
发明内容
[0010] 本发明的目的在于提供一种治疗胰腺癌的中药组合物及其制备方法。
[0011] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0012] 本发明选择16种中药如山药、苍术、大枣、白扁豆、木瓜、巴戟天、天南星、瓜蒌、迎春花、布渣叶、预知子、山慈菇、九龙藤、小叶莲、藏菖蒲、天仙藤组成治疗胰腺癌的中药组合物。为了证明该中药组合物治疗胰腺癌的效果，本发明进行了以下试验：
[0013] 实验观察了中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株的生长情况。结果显示，随着中药组合物浓度的增加及其中药组合物干预时间的延长，中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株的抑制作用也逐渐增强，说明中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株的药理作用存在剂量-效应关系。经过中药组合物积极干预后，中药组合物高、中剂量对胰腺癌BxPC-3细胞株生长具有抑制作用；同时，与5-氟尿嘧啶组比较，中药组合物高、中剂量组第3、4、5、6、7d时间点上胰腺癌BxPC-3细胞株活细胞计数改变不明显(P＞0.05)，而中药组合物低剂量组第3、4、5、6、7d时间点上胰腺癌BxPC-3细胞株活细胞计数明显增加(P＞0.05)，预示中药组合物高、中剂量和5-氟尿嘧啶对胰腺癌BxPC-3细胞株的抑制作用等效，而中药组合物低剂量治疗胰腺癌BxPC-3细胞株的效果较差。综合显示，中药组合物高、中剂量可以抑制胰腺癌BxPC-3细胞株生长，且这种抑制作用与5-氟尿嘧啶相同。
[0014] 实验测定了中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株的运动能力水平的影响。结果表明，经过中药组合物和5-氟尿嘧啶治疗后，中药组合物高剂量、中药组合物中剂量、5-氟尿嘧啶对胰腺癌BxPC-3细胞株运动能力具有很强的抑制作用，随着剂量增加，中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株的运动能力影响就会更加明显；同时，中药组合物低剂量对胰腺癌BxPC-3细胞株的运动能力影响较差。综合显示，中药组合物高、中剂量可以抑制胰腺癌BxPC-3细胞株的运动能力，这种积极的干预作用较为明显。
[0015] 本研究选取胰腺癌BxPC-3细胞株构建胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠。与模型组比较，中药组合物高剂量、中药组合物中剂量、中药组合物低剂量和5-氟尿嘧啶对胰腺癌裸鼠移植瘤均明显抑制作用(P<0.05)，其中，中药组合物高剂量组抑瘤效果很好。各实验组抑瘤率均大于30％，依据中草药抗肿瘤有效性标准及《现代肿瘤治疗药物学》相关标准规定(抑瘤率>30％)，初步认为中药组合物高剂量、中药组合物中剂量、中药组合物低剂量对胰腺癌BxPC-3移植瘤具有抑制作用。一般而言，脾主要产生B细胞，通过测定脾可以评价机体的免疫功能，本实验使用电子天平检测小鼠脾指数。实验结果显示，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组小鼠脾指数较高，说明中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组小鼠脾主要产生B细胞较多，提示中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组小鼠体液免疫水平较强，提示机体的免疫功能较强；5-氟尿嘧啶组小鼠脾指数降低，说明5-氟尿嘧啶组小鼠体液免疫水平降低，提示机体的免疫功能较差，副作用较大。综合显示，中药组合物高剂量、中药组合物中剂量、中药组合物低剂量具有抗肿瘤作用，副作用较小。
[0016] 本研究通过流式细胞仪分析显示，在中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组与模型组比较中，胰腺癌BxPC-3移植瘤细胞周期发生了明显变化，其中，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组胰腺癌BxPC-3移植瘤G1期明显上升，G2期明显下降(P<0.05)，表明中药组合物高、中剂量作用后胰腺癌BxPC-3移植瘤细胞周期G2缩短，G1期延长，提示胰腺癌细胞阻滞于G1期。同时，在中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组与模型组中比较中，胰腺癌BxPC-3移植瘤细胞凋亡率均明显升高(P<0.05)。综合显示，中药组合物高剂量、中药组合物中剂量通过将胰腺癌BxPC-3移植瘤细胞周期阻滞于G1期及其降低细胞凋亡率来发挥抗肿瘤作用。
[0017] 资料显示，Hedgehog信号通路高度保守，在正常人体中通常检测不到Hedgehog表达，而胰腺癌Hedgehog信号通路高表达，胰腺癌与Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo异常表达密切相关(Dosch JS，Pasca di Magliano M，Simeone DM.Pancreatic cancer and hedgehog pathway signaling：new insights[J].Pancreatology，2010，10(3)：151-157.)。已经证实，恶性肿瘤细胞能够分泌Shh，其作为分泌性信号分子对自身及周围细胞产生作用。在胰腺癌发生早期，Hedgehog信号传递途径被激活，引起胰腺导管上皮发生恶性转变，Ptch1在Hedgehog信号通路上作为膜蛋白受体，是Hedgehog信号通路的接受者又是传递者，解除Ptch1对Smo抑制作用，使Smo将信号传递细胞内，激活下游转录因子Gli家族，调节相关靶基因表达。Gli1激活后，可从细胞质进入细胞核，使Glil激活下游基因表达上调，以此诱发胰腺癌。本研究从体内角度，采用免疫组织化学、Real-time PCR和Western blot方法，探讨中药组合物抗胰腺癌作用是否通过此信号通路起作用。免疫组织化学结果显示，Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo定位于细胞质和/或细胞膜，Gli1定位于细胞质和/或细胞核。在胰腺癌BxPC-3移植瘤模型中检测到Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo高表达，经过中药组合物干预后，与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3移植瘤模型Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo均低表达(P<0.05)，而中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3移植瘤模型Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo高表达，说明中药组合物高剂量、中药组合物中剂量可以下调胰腺癌BxPC-3移植瘤模型Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo表达。
[0018] 本研究采用Real-time PCR及Western blot更为准确地定量检测Hedgehog信号通路活化水平。结果显示，模型组胰腺癌BxPC-3移植瘤模型Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo、Gli1高表达。当Shh异常高表达时，Shh与Ptch1结合解除对Smo的抑制，促使锌指转绿因子与Sufu分离，使细胞质中Gli与Cos2形成复合物和微管分离，Gli进入细胞核激活靶基因转录引起胰腺癌细胞增殖，说明胰腺癌BxPC-3移植瘤模型Hedgehog信号通路Shh高表达是激活Hedgehog通路的诱因之一。经过中药组合物和5-氟尿嘧啶治疗后，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组干预后促使胰腺癌BxPC-3移植瘤模型Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo、Gli1在各组中表达均下调，从而抑制Hedgehog信号通路激活。但是，中药组合物低剂量对胰腺癌BxPC-3移植瘤模型Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo、Gli1干预作用较弱。综合显示，中药组合物高剂量、中药组合物中剂量可以下调胰腺癌BxPC-3移植瘤模型Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo、Gli1表达，可见，Hedgehog信号通路Shh、Ptch、Smo、Gli1在胰腺癌发生发展过程中起着重要作用。
[0019] 为了有效评价中药组合物的副作用，本实验还测定了胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的脑、心、肝、肾和肺指数和小鼠体重不同时间点的变化水平。本实验结果表明，相较于模型组，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的脑、心、肝、肾和肺指数改变不明显(P＞0.05)；说明中药组合物高、中、低剂量对胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠重要脏器无影响。同时在各组小鼠给药过程中，胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠体重呈现上升趋势，说明中药组合物高、中、低剂量对胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠体重无影响。与模型组比较，中药组合物高、中、低剂量组胰腺癌BxPC-3移植瘤小鼠0d、7d、14d、28d体重改变不明显(P＞0.05)；也通过统计分析说明中药组合物高、中、低剂量对胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠体重无影响。最终显示，中药组合物治疗胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的同时不会改变胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠重要脏器指数和体重，说明中药组合物无副作用，即可以放心使用中药组合物高、中剂量开展治疗胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠。
[0020] 以上实验表明，中药组合物高、中剂量(43.48g/kg、21.74g/kg)可明显改善胰腺癌裸鼠移植瘤模型小鼠抑瘤率、脾指数、细胞周期、细胞凋亡，还可以改善对胰腺癌裸鼠移植瘤模型小鼠Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1表达，更对胰腺癌裸鼠移植瘤模型小鼠脑指数、心指数、肝指数、肾指数、肺指数和体重无影响，最终评价说明中药组合物治疗胰腺癌有效，并且中药组合物无副作用，说明该中药组合物在治疗胰腺癌方面将具有广阔的应用前景。
[0021] 在上述研究的基础上，本发明提出了一种治疗胰腺癌的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：山药20-25重量份、苍术4-8重量份、大枣15-20重量份、白扁豆10-20重量份、木瓜5-8重量份、巴戟天5-8重量份、天南星5-8重量份、瓜蒌10-15重量份、迎春花10-15重量份、布渣叶15-25重量份、预知子5-12重量份、山慈菇2-7重量份、九龙藤10-15重量份、小叶莲1-5重量份、藏菖蒲2-7重量份、天仙藤5-15重量份。
[0022] 其中，山药，性平，味甘，归脾经、胃经、肾经，具有健脾生津、养胃益肺、补肾涩精的功效；苍术，性温，味辛、苦，归脾经、胃经、肝经，具有健脾祛风、燥湿散寒、明目解郁的功效；大枣，性温，味甘，归脾经、胃经，具有健脾补气、安神养血、缓和药性的功效；白扁豆，性平，味甘、淡，归脾经、胃经，具有利湿消肿、健脾利尿、和中消暑的功效；木瓜，性温，味酸、涩，归肝经、脾经、胃经，具有利湿和胃、舒肝止痛、利尿消肿的功效；巴戟天，性微温，味辛、甘，归肝经、肾经，具有利湿补肾、祛风强筋的功效；天南星，性温，味苦、辛，归肝经、肺经、脾经，具有祛痰消肿、祛风燥湿、定惊散结的功效；瓜蒌，性寒，味甘、苦，归肺经、胃经、大肠经，具有祛痰清热、散结宽胸、润燥滑肠、利气消肿的功效；迎春花，性平，味甘、涩，归肾经、膀胱经，具有清热解毒、利尿消肿、活血止痛的功效；布渣叶，性平，味酸，归脾经、肝经、胃经，具有清热化滞、消食利湿的功效；预知子，性寒，味苦，归胃经、肝经、胆经、膀胱经，具有化瘀疏肝、理气活血、利尿杀虫的功效；山慈菇，性寒，味甘、微辛，归肝经、脾经，具有化瘀祛痰、清热解毒的功效；九龙藤，性平，味苦、辛，归脾经、肝经、胃经，具有活血祛风、除湿止痛、行气化瘀的功效；小叶莲，性温，味苦，归胃经、肝经、肺经，具有活血除湿、祛风止咳、解毒止痛的功效；藏菖蒲，性温，味苦、辛，归胃经、心经，具有温胃止痛、补阳消炎的功效；天仙藤，性温，味苦，归脾经、肝经，具有理气止痛、活血利水的功效。
[0023] 其中，优选的，所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：山药22.5重量份、苍术6重量份、大枣17重量份、白扁豆15重量份、木瓜6.75重量份、巴戟天6.75重量份、天南星6.5重量份、瓜蒌12重量份、迎春花12.5重量份、布渣叶19.5重量份、预知子9重量份、山慈菇4.5重量份、九龙藤12重量份、小叶莲3.75重量份、藏菖蒲4.5重量份以及天仙藤9重量份。
[0024] 进一步的，本发明还提出了中药组合物在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
[0025] 其中，优选的，向本发明所述的中药组合物中加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法做成临床上适宜的各种药物制剂。
[0026] 其中，优选的，所述的药物制剂为水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、片剂或口服液。
[0027] 更进一步的，本发明还提出了一种制备所述的中药组合物的方法，包括以下步骤：
[0028] (1)按照以上所述的重量份称取各原料；
[0029] (2)将步骤(1)称取得到的各原料混合后，加入原料总重量8-15倍的蒸馏水，浸泡1.5-3h，之后煎煮1.5-3h，过滤，得到第一次中药组合物滤液以及残渣；
[0030] (3)向步骤(2)获得的中药组合物残渣中加入与步骤(2)相同体积的蒸馏水，浸泡中药组合物残渣1.5-3h，煎煮中药组合物残渣1.5-3h，过滤后，得到第二次中药组合物滤液；
[0031] (4)将第一次中药组合物滤液和第二次中药组合物滤液合并，混匀，即得所述的中药组合物的水煎剂。
[0032] 在所述的方法中，优选的，还包括将得到的水煎剂放于蒸发容器内，并将蒸发容器放于实验室电热恒温鼓风干燥箱内72℃进行干燥6d，每天8次，每次间隔3h，得到中药组合物干膏；使用常规粉碎机将得到的中药组合物干膏进行粉碎，粉碎物经过100目304不锈钢筛网过滤2次，400目304不锈钢筛网过滤2次，最终得到中药组合物干粉，分装，-80℃冰箱内保存备用。
[0033] 在所述的方法中，优选的，第一次过滤分别采用6层白色纱布、17层白色纱布依次过滤，第二次过滤分别采用8层白色纱布、19层白色纱布依次过滤。
[0034] 相较于现有技术，本发明的有益效果是：
[0035] 本发明发明人根据中医理论基础，结合胰腺癌的疾病病机，选择山药、苍术、大枣、白扁豆、木瓜、巴戟天、天南星、瓜蒌、迎春花、布渣叶、预知子、山慈菇、九龙藤、小叶莲、藏菖蒲、天仙藤组成治疗胰腺癌的中药组合物，其中山药、苍术、大枣、白扁豆、木瓜、巴戟天可以发挥健脾利湿的功效，天南星、瓜蒌、迎春花、布渣叶可以发挥祛痰清热的功效，预知子、山慈菇、九龙藤、小叶莲可以发挥化瘀活血的功效，选择藏菖蒲、天仙藤可以发挥温胃理气的功效。综合显示该中药组合物具有健脾利湿、祛痰清热、化瘀活血、温胃理气等功效。本发明的提出为胰腺癌的治疗提供了一种新的，有效的技术手段。附图说明
[0036] 图1中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株生长情况的影响；
[0037] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05；
[0038] 图2中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株划痕距离的影响；
[0039] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05；
[0040] 图3中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠肿瘤质量的影响；
[0041] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05；
[0042] 图4中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠脾指数的影响；
[0043] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05；
[0044] 图5中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型细胞周期的影响；
[0045] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05；
[0046] 图6中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型细胞凋亡率的影响；
[0047] 注：与模型组比较：*P<0.05；
[0048] 图7中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1表达的影响；
[0049] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05；
[0050] 图8中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白相对表达量的影响；
[0051] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05；
[0052] 图9中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1基因的影响；
[0053] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05；
[0054] 图10中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型重要脏器指数的影响；
[0055] 注：与模型组比较：*P＞0.05；与高剂量组比较，#P＞0.05；
[0056] 图11中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠体重的影响。
[0057] 注：与模型组比较：*P＞0.05；与高剂量组比较，#P＞0.05。
具体实施方式
[0058] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将随着描述而更为清楚，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0059] 实施例1中药组合物的制备
[0060] 所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：山药22.5重量份、苍术6重量份、大枣17重量份、白扁豆15重量份、木瓜6.75重量份、巴戟天6.75重量份、天南星6.5重量份、瓜蒌12重量份、迎春花12.5重量份、布渣叶19.5重量份、预知子9重量份、山慈菇4.5重量份、九龙藤12重量份、小叶莲3.75重量份、藏菖蒲4.5重量份以及天仙藤9重量份。
[0061] 实施例2中药组合物的制备
[0062] 所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：山药20重量份、苍术4重量份、大枣15重量份、白扁豆12重量份、木瓜8重量份、巴戟天5重量份、天南星6重量份、瓜蒌14重量份、迎春花10重量份、布渣叶25重量份、预知子10重量份、山慈菇2重量份、九龙藤15重量份、小叶莲5重量份、藏菖蒲2重量份、天仙藤10重量份。
[0063] 实施例3中药组合物的制备
[0064] 所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：山药25重量份、苍术8重量份、大枣20重量份、白扁豆20重量份、木瓜5重量份、巴戟天8重量份、天南星7重量份、瓜蒌10重量份、迎春花15重量份、布渣叶15重量份、预知子5重量份、山慈菇5重量份、九龙藤10重量份、小叶莲2重量份、藏菖蒲7重量份、天仙藤5重量份。
[0065] 实施例4中药组合物(干粉)的制备
[0066] (1)按照以下所述的重量称取各原料：
[0067] 山药22.5g、苍术6g、大枣17g、白扁豆15g、木瓜6.75g、巴戟天6.75g、天南星6.5g、瓜蒌12g、迎春花12.5g、布渣叶19.5g、预知子9g、山慈菇4.5g、九龙藤12g、小叶莲3.75g、藏菖蒲4.5g、天仙藤9g，共16种原药材，每份中药组合物的原药材重量为167.25g，配制4倍量的中药组合物(原药材669g)。
[0068] (2)将669g中药组合物放入15000mL实验用中型圆底烧瓶中，加入双蒸水7500mL，将原药材669g中药组合物浸泡双蒸水7500mL中2.5h，之后使用双蒸水7500mL煎煮中药组合物2.5h，经过6层白色医用纱布、17层白色医用纱布分别进行过滤，将会得到中药组合物原药材669g的第一次中药组合物过滤液以及残渣。
[0069] (3)将中药组合物原药材669g的第一次中药组合物过滤后获得的中药组合物残渣放到15000mL实验用中型圆底烧瓶中，加入双蒸水7500mL，浸泡第一次中药组合物过滤后获得的中药组合物残渣2.5h，煎煮2.5h，经过8层白色医用纱布、19层白色医用纱布分别进行过滤后，将会得到第二次中药组合物过滤液。
[0070] (4)合并第一次中药组合物过滤液和第二次中药组合物过滤液；
[0071] (5)二者混匀后，将所有过滤液放于蒸发容器内，并将蒸发容器放于实验室电热恒温鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)内进行干燥6d(温度为72℃)，每天8次(每次间隔3h)查看干燥箱内的液体蒸发情况，最终将会得到相当于中药组合物原药材669g的中药组合物干膏201.32g，此相当于中药组合物原药材669g的中药组合物出膏率＝[中药组合物干膏(g)/中药组合物原药材(g)]×100％，按照公式经过计算得到(201.32g/669g)×100％＝30.09％，可见，相当于中药组合物原药材669g的中药组合物出膏率为30.09％。
[0072] (6)使用常规粉碎机将步骤(5)得到的中药组合物干膏进行彻底粉碎，粉碎物经过304不锈钢筛网(100目)过滤2次，304不锈钢筛网(400目)过滤2次，最终得到相当于中药组合物原药材669g的中药组合物干粉195.27g，相当于原药材669g的中药组合物出粉率＝[中药组合物干粉(g)/中药组合物原药材(g)]×100％，经过计算得到(195.27g/669g)×100％＝29.19％，可见，相当于中药组合物原药材669g的中药组合物出粉率为29.19％。
[0073] 实验配制中药组合物原药材重量为669g，最终得到中药组合物干膏201.32g，中药组合物干粉195.27g，即粉碎机粉碎及筛网过滤损失6.05g，中药组合物损失率＝[中药组合物干膏(g)－中药组合物干粉(g)]/中药组合物干粉(g)×100％，经过计算得到[(201.32g-195.27g)/201.32g]×100％＝3.01％，可见，中药组合物原药材重量为669g的中药组合物损失率为3.01％。
[0074] 最终，4倍的中药组合物原药材669g经过双蒸水煎煮后可以获得中药组合物干粉195.27g，即1g中药组合物干粉相当于中药组合物原药材3.43g。将中药组合物干粉195.27g进行分装，20g/袋，最后1袋15.27g，共计10袋，同时标记每袋中药组合物干粉重量，-80℃冰箱内保存备用。
[0075] 实施例5中药组合物在治疗胰腺癌中的应用
[0076] 1材料
[0077] 1.1动物
[0078] 实验用雄性70只4-6周BALB/c裸鼠，体质量(18±2)g，由哈尔滨医科大学基础医学院解剖教研室吴树亮教授购买于上海斯莱克动物实验有限公司，实验用动物许可证号为SCXK(沪)2012-0002，所有实验用动物均在黑龙江中医药大学药物安全性评价中心适宜的温度和湿度下由黑龙江中医药大学安全评价中心李宝龙副主任常规无菌条件下(SPF级)饲养、灌胃给药。
[0079] 1.2药物
[0080] 实施例4制备得到的干粉。另外，本发明阳性对照药物5-氟尿嘧啶由齐齐哈尔医学院张英博副教授购买于美国Sigma公司。
[0081] 1.3试剂
[0082] RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购自于HyClone公司；定影粉(CW0062)、高灵敏度化学发光检测试剂盒(CW0049A)、anti-GAPDH(CW0100A)购自于康为世纪生物科技有限公司；BxPC-3人源性胰腺癌细胞株购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；医用X射线胶片(034402311)购买于厦门锐珂医疗器材有限公司；RNeasy Mini试剂盒购自于QIAGEN公司；Anti-Shh(2207)、anti-Gli1(3538)购自于美国INT公司；Anti-Ptch1(ab39266)、anti-Smo(ab72130)购自于美国abcam公司；SDS(L5750)、Tween20(P1379)购自于Sigma公司；PrimeScript RT试剂盒购自于中国大连TaKaRa Biotechnology公司；蛋白抽提试剂A(P0028-1)购自于碧云天公司；其他国产分析纯均由齐齐哈尔医学院张英博副教授提供。
[0083] 1.4仪器
[0084] 电热恒温鼓风干燥箱购自于天津市泰斯特仪器有限公司；HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统购自于武汉千屏影像技术有限公司；PLZOZ-S电子天平购自于梅特勒-托利多仪器有限公司；SIMF124制冰机购自于日本SANYO公司；组织展片机购自于德国Leica公司；TGL-16G台式离心机购自于上海安亭科学仪器厂；组织脱水机购自于德国Leica公司；流式细胞仪购自于美国BD公司；蛋白印记电泳仪购自于中国北京市六一仪器厂；CO2培养箱购自于美国Thermo公司；超净操作台购自于中国北京东联哈尔仪器制造有限公司；实验动物气体交换机购自于苏州仪器设备厂；实时定量PCR检测仪购自于美国伯乐公司等。
[0085] 2方法
[0086] 2.1中药组合物剂量的设定
[0087] 中药组合物包括山药22.5g、苍术6g、大枣17g、白扁豆15g、木瓜6.75g、巴戟天6.75g、天南星6.5g、瓜蒌12g、迎春花12.5g、布渣叶19.5g、预知子9g、山慈菇4.5g、九龙藤
12g、小叶莲3.75g、藏菖蒲4.5g、天仙藤9g，共16种原药材，每份中药组合物的原药材重量为
167.25g/成人标准体重。167.25g/成人标准体重是经过黑龙江中医药大学周忠光教授和黑龙江中医药大学附属第一医院内分泌科栗明副主任医师鉴定后的常规剂量。该167.25g/成人标准体重按照小鼠和人体表面积比值(0.0026：1)计算，获得中药组合物剂量＝(167.25g×0.0026)/0.02kg＝21.74g/kg，可见中药组合物中剂量为21.74g/kg。按照中药组合物高剂量是中药组合物中剂量的2倍，而中药组合物低剂量是中药组合物中剂量的1/2，因此，实验设定中药组合物高剂量为(21.74g/kg)×2＝43.48g/kg，中药组合物低剂量为(21.74g/kg)/2＝10.87g/kg。最终，本发明分别设定中药组合物高、中、低剂量分别为43.48g/kg、
21.74g/kg、10.87g/kg。
12g、小叶莲3.75g、藏菖蒲4.5g、天仙藤9g，共16种原药材，每份中药组合物的原药材重量为
167.25g/成人标准体重。167.25g/成人标准体重是经过黑龙江中医药大学周忠光教授和黑龙江中医药大学附属第一医院内分泌科栗明副主任医师鉴定后的常规剂量。该167.25g/成人标准体重按照小鼠和人体表面积比值(0.0026：1)计算，获得中药组合物剂量＝(167.25g×0.0026)/0.02kg＝21.74g/kg，可见中药组合物中剂量为21.74g/kg。按照中药组合物高剂量是中药组合物中剂量的2倍，而中药组合物低剂量是中药组合物中剂量的1/2，因此，实验设定中药组合物高剂量为(21.74g/kg)×2＝43.48g/kg，中药组合物低剂量为(21.74g/kg)/2＝10.87g/kg。最终，本发明分别设定中药组合物高、中、低剂量分别为43.48g/kg、
21.74g/kg、10.87g/kg。
[0088] 2.2阳性药物剂量的设定
[0089] 阳性药物5-氟尿嘧啶常规剂量为150～300mg，依据小鼠和人的体表面积比值为(0.0026：1)进行计算，将会获得阳性药物5-氟尿嘧啶常规剂量的最小值为(150×0.0026×50)mg/kg＝19.5mg/kg且最大值为(300×0.0026×50)mg/kg＝39mg/kg，换算成分子是单位g后，获得阳性药物5-氟尿嘧啶常规剂量最小值为0.0195g/kg且最大值为0.039g/kg，经过黑龙江中医药大学周忠光教授和黑龙江中医药大学附属第一医院内分泌科栗明副主任医师评定，本实验选择阳性药物5-氟尿嘧啶0.03g/kg作为常规剂量开展实验工作。
[0090] 2.3细胞培养
[0091] 本实验取出装有胰腺癌BxPC-3细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供)的冻存管，置于37℃水中迅速融化，使用TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)2000rpm/10min离心，弃去冻存液，加入10倍预冷RPMI1640完全培养液冲洗1次，接种于培养瓶，置于5％CO2、37℃、饱和湿度的CO2培养箱(美国Thermo公司)中培养，隔日换液。培养胰腺癌BxPC-3细胞株成单层并且胰腺癌BxPC-3细胞株处于对数生长期后，用0.25％胰蛋白酶(含EDTA)消化、传代、收集胰腺癌BxPC-3细胞株。
[0092] 2.4测定细胞生长
[0093] 依据台盼蓝可以穿透死亡或者坏死细胞的细胞膜并结合DNA特点，可以将这些不被台盼蓝染色的细胞即活细胞区分出来。本实验采用台盼蓝染色检测胰腺癌BxPC-3细胞株的生长，鉴定出活细胞并且评价药物对胰腺癌BxPC-3细胞株的初步作用效果。实验取处于对数生长期的胰腺癌BxPC-3细胞株单细胞悬液，胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液洗涤3次，制备胰腺癌BxPC-3细胞株，调整细胞的浓度为1×104个细胞/mL，选择300μL接种在24孔培养板，加入不同的药物，于5％CO2、37℃的无菌CO2培养箱(美国Thermo公司)培养1、2、3、4、5、6、7d。每d取单细胞悬液，按照单细胞悬液与台盼蓝的比例为9：1，加入4％台盼蓝混合，3min内计数，收集数据统计分析，评价胰腺癌BxPC-3细胞株的生长情况。
[0094] 2.5测定细胞运动能力
[0095] 本实验取对数生长期胰腺癌BxPC-3细胞株，胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液洗涤3次，制备胰腺癌BxPC-3细胞株单细胞悬液，调整细胞的浓度为1×105个细胞/mL。黑色笔在6孔培养板背后，每隔0.8cm划横线，每孔至少穿过3条线。在每孔中加入胰腺癌BxPC-3细胞株约1×105个细胞/mL，培养1d后，垂直于6孔培养板背后，使用横线画划痕。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次/孔，去除划下胰腺癌BxPC-3细胞株，于5％CO2、37℃的无菌CO2培养箱(美国Thermo公司)培养。对照组加入正常完全培养基，其他各组加入不同的药物，继续培养2d。按0h、24h、48h取细胞样品，拍摄划痕处，测量胰腺癌BxPC-3细胞株的细胞划痕的之间距离，胰腺癌BxPC-3细胞株的运动能力可以使用胰腺癌BxPC-3细胞株的细胞愈合程度来评价。
[0096] 计算细胞愈合程度：细胞愈合程度(值)＝l-(48h划痕距离/0h划痕距离)。
[0097] 2.6建立模型
[0098] 参考文献黑龙江中医药大学周忠光教授发表的文章(Zhou ZG，Zhang CY，Fei HX，et al.Phenolic alkaloids from Menispermum dauricum inhibits BxPC-3 pancreatic cancer cells by blocking of Hedgehog signaling pathway[J].Pharmacogn Mag，2015，11(44)：690-697.)建立胰腺癌BxPC-3移植瘤模型。本实验收集胰腺癌BxPC-3细胞株，用RPMI1640完全培养基调整浓度为5×106个/mL细胞悬液备用。每只鼠0.2mL(约含细胞数5×106个)接种于裸鼠右腋部皮下，建立胰腺癌BxPC-3移植瘤模型。同时，设定空白组(仅仅注射生理盐水)于裸鼠右腋部皮下，进一步验证胰腺癌BxPC-3移植瘤模型。当胰腺癌BxPC-3细胞株(5×106个/mL)接种7～10d裸鼠右腋皮下扁平或圆形肿块，且空白组裸鼠右腋皮下未出现扁平或圆形肿块，说明胰腺癌BxPC-3移植瘤模型建立成功。
[0099] 2.7动物分组
[0100] 本实验确定50只胰腺癌BxPC-3移植瘤模型，采用随机数字表随机将50只胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠分为五组，10只/组，包括模型组、中药组合物高剂量组(简称高剂量组)、中药组合物中剂量组(简称中剂量组)、中药组合物低剂量组(简称低剂量组)、5-氟尿嘧啶组。另外，本实验需要选择同背景、同月龄裸鼠10只为对照组。
[0101] 2.8动物给药
[0102] 模型组：接种胰腺癌BxPC-3细胞株5×106个/mL，经小鼠口腔灌胃等体积生理盐6
水；中药组合物高剂量组：接种胰腺癌BxPC-3细胞株5×10个/mL，经小鼠口腔灌胃中药组合物43.48g/kg；中药组合物中剂量组：接种胰腺癌BxPC-3细胞株5×106个/mL，经小鼠口腔灌胃中药组合物21.74g/kg；中药组合物低剂量组：接种胰腺癌BxPC-3细胞株5×106个/mL，经小鼠口腔灌胃中药组合物10.87g/kg；5-氟尿嘧啶组：接种胰腺癌BxPC-3细胞株5×106个/mL，经小鼠口腔灌胃阳性药物5-氟尿嘧啶0.03g/kg。本实验经小鼠口腔灌胃连续给药
28d。
水；中药组合物高剂量组：接种胰腺癌BxPC-3细胞株5×10个/mL，经小鼠口腔灌胃中药组合物43.48g/kg；中药组合物中剂量组：接种胰腺癌BxPC-3细胞株5×106个/mL，经小鼠口腔灌胃中药组合物21.74g/kg；中药组合物低剂量组：接种胰腺癌BxPC-3细胞株5×106个/mL，经小鼠口腔灌胃中药组合物10.87g/kg；5-氟尿嘧啶组：接种胰腺癌BxPC-3细胞株5×106个/mL，经小鼠口腔灌胃阳性药物5-氟尿嘧啶0.03g/kg。本实验经小鼠口腔灌胃连续给药
28d。
[0103] 2.9测定抑瘤率及脾指数
[0104] 各组胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠药物干预28d后，使用PLZOZ-S电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)次日称重，脱颈处死胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠，酒精消毒，在超净操作台(中国北京东联哈尔仪器制造有限公司)无菌操作完整剥离胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的瘤体及脾，生理盐水冲洗，滤纸吸干，称量胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的肿瘤及脾重量。
[0105] 计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(模型组肿瘤质量-实验组肿瘤质量)/模型组平均肿瘤质量×100％；
[0106] 计算脾指数：脾指数(mg/g)＝脾质量(mg)/小鼠体重(g)。
[0107] 2.10测定细胞周期
[0108] 实验结束后，切取各组胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的瘤组织块，在超净操作台(中国北京东联哈尔仪器制造有限公司)无菌操作完整剥离瘤体，剔除肿瘤表面纤维包膜，置于冰盘上，剪碎、研磨，制备成胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的瘤体单细胞悬液，调至细胞浓度为2×106/mL。将细胞接种在6孔板中并用中药组合物、5-氟尿嘧啶或生理盐水处理24h。并在-20℃下用70％乙醇固定过夜，洗涤。取1mL悬液加RNase 1.6mL(1mg/mL)，37℃水浴孵育30min，1500rpm/min离心5min，沉淀加0.4mL磷酸盐缓冲液，震荡混匀。用碘化丙锭(100μg/mL；Sigma-Aldrich)染色10min，并用流式细胞仪(美国BD公司)进行检测分析胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的肿瘤细胞周期。
[0109] 2.11测定细胞凋亡
[0110] 实验结束后，在超净操作台(中国北京东联哈尔仪器制造有限公司)切取胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的瘤组织块，制备胰腺癌BxPC-3移植瘤的单细胞悬液，调至细胞浓度为2×106/mL，将细胞接种在6孔板中，用中药组合物、5-氟尿嘧啶或生理盐水处理24h，加入荧光染液，孵育30min，避光并不时振动。根据制造商方案用Annexin-V：FITC凋亡检测试剂盒I测定胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的肿瘤细胞凋亡水平。
[0111] 2.12免疫组化检测蛋白表达
[0112] 实验结束后，在超净操作台(中国北京东联哈尔仪器制造有限公司)取材胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的肿瘤组织，10％福尔马林固定4h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明30min，软蜡45℃浸泡1h，硬蜡55℃浸泡1h，包埋器包埋，切片机将组织切成4μm厚度切片，多聚-L-赖氨酸载玻片捞片，60℃烘片12h，二甲苯脱蜡至水，3％H2O2室温孵育10min，蒸馏水冲洗，微波炉加热修复5min，室温冷却，血清室温孵育20min，弃去血清，按试剂说明书滴加一抗，37℃孵育2h，PBS冲洗5min，加入二抗37℃孵育30min，PBS冲洗3min，DAB显色10min，流水冲洗，复染5min，经过脱水、透明、封片，镜下观察胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的肿瘤Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1表达水平，采用HMIAS高清晰度彩色医学图文系统(武汉千屏影像技术有限公司)进行分析Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1的OD值。
[0113] 2.13 Western blot检测蛋白表达
[0114] 实验结束后，取胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的肿瘤组织冰上匀浆，4℃离心，12000rpm离心10min，蛋白样本-20℃冰箱保存，采用BCA法进行蛋白定量，在标准曲线上计算得蛋白浓度，沸水中变性5min，分装﹣80℃保存，配制SDS聚丙烯酰胺凝胶，75V电泳1h，电泳后平衡20min，75V电转膜2h，4℃封闭过夜。加入一抗：GAPDH(1：3000)、Shh(1：800)、Ptch(1：1000)、Smo(1：2000)、Gli1(1：2000)，37℃孵育2h。去除一抗，冲洗。加入二抗，37℃孵育
1h。去除二抗，冲洗。在暗室经过X光胶片曝光、显影、定影、清水冲洗，采用HMIAS高清晰度彩色医学图文系统(武汉千屏影像技术有限公司)进行分析胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1的相对表达量。
1h。去除二抗，冲洗。在暗室经过X光胶片曝光、显影、定影、清水冲洗，采用HMIAS高清晰度彩色医学图文系统(武汉千屏影像技术有限公司)进行分析胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1的相对表达量。
[0115] 2.14 RT-PCR检测基因表达
[0116] 实验结束后，取胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的肿瘤组织按照Trizol试剂盒说明书提取mRNA。引物由上海生工生物工程公司合成设计，其中，GAPDH：上游5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3’，下游5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3’；Shh：上游5’-GCT CGG TGA AAG CAG AGA ACT-3’，下游5’-CCA GGA AAG TGA GGA AGT CG-3’；Smo：上游5’-CTG GTG TGG TTT GGT TTG TG-3’，下游5’-CAG GTG GAA GTA GGA GGT CTT G-3’；Ptch1：上游5’-CTC CTT TGC GGT GGA CAA-3’，下游5’-CCT CAG CCT TAT TCA GCA TTT C-3’；Gli1：上游5’-ATC CTT ACC TCC CAA CCT CTG T-3’，下游5’-CCA ACT TCT GGC TCT TCC TGT A-3’。
按照试剂盒说明书程序操作，配制PCR反应体系，使用实时定量PCR检测仪(美国伯乐公司)进行测定，采用 法数据处理实验数据并分析胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的肿瘤Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1的mRNA相对表达量。
按照试剂盒说明书程序操作，配制PCR反应体系，使用实时定量PCR检测仪(美国伯乐公司)进行测定，采用 法数据处理实验数据并分析胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的肿瘤Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1的mRNA相对表达量。
[0117] 2.15检测体重和脏器指数
[0118] 各组胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠检测结束后，使用PLZOZ-S电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)称量胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠体重，统计胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠在给药过程中体重数据变化，并进行分析。另外，实验结束后，抓取小鼠，断头处死小鼠，在超净操作台(中国北京东联哈尔仪器制造有限公司)上解剖小鼠，取材胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠的脑、心、肺、肾、肝等脏器，洗涤脏器、吸干水分，使用PLZOZ-S电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)称量脏器质量，按照脏器指数计算公式开始计算胰腺癌BxPC-3移植瘤模型小鼠脏器指数。
[0119] 计算公式：脏器指数(mg/g)＝脏器质量(mg)/小鼠体重(g)。
[0120] 2.16统计分析
[0121] 采用SPSS19.0软件分析数据，实验数据采用x±s表示，计量资料进行正态性检验分析，多组间比较采用单因素方差分析数据，P<0.05表示差异具有统计学意义，P＞0.05表示差异不具有统计学意义。
[0122] 3结果
[0123] 3.1中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株生长情况的影响
[0124] 结果表明，与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组第3、4、5、6、7d时间点上胰腺癌BxPC-3细胞株活细胞计数明显减少(P<0.05)，而中药组合物低剂量组第3、4、5、6、7d时间点上胰腺癌BxPC-3细胞株活细胞计数改变不明显(P＞0.05)。(见表1、图1)。
[0125] 表1中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株生长情况的影响( n＝6，1×104)
[0126]
[0127] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05
[0128] 3.2中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株运动能力的影响
[0129] 结果表明，与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3细胞株48h划痕距离明显增加(P<0.05)，细胞愈合程度明显降低(P<0.05)，而中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3细胞株48h划痕距离及细胞愈合程度改变不明显(P＞0.05)。(见表2、图2)。
[0130] 表2中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞株运动能力的影响( n＝9)
[0131]
[0132] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05
[0133] 3.3中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型抑瘤率的影响
[0134] 结果表明，与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组、中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠肿瘤质量明显降低(P<0.05)。中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、阳性药物5-氟尿嘧啶组的抑瘤率分别为(47.8372±6.7827)％、(36.8352±8.4470)％、(32.2523±
5.3657)％、(54.7148±7.1300)％。可见，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠均具有抑制作用，空白组未产生胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤。其中，中药组合物高剂量组和5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠的抑瘤效果很好。(见表3、图3)。
5.3657)％、(54.7148±7.1300)％。可见，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠均具有抑制作用，空白组未产生胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤。其中，中药组合物高剂量组和5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠的抑瘤效果很好。(见表3、图3)。
[0135] 表3中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠肿瘤质量和抑瘤率的影响(n＝10)
[0136]
[0137] 注：与模型组比较：*P<0.05
[0138] 3.4中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型脾指数的影响
[0139] 结果表明，与模型组比较，5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠脾指数明显降低(P<0.05)，而中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠脾指数无统计学差异(P>0.05)。(见表4、图4)。
[0140] 表4中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠脾指数的影响( n＝8)[0141]
[0142] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05
[0143] 3.5中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型细胞周期影响
[0144] 结果表明，与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠G1期明显增加(P＜0.05)，G2期明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠G1期改变不明显(P＞
0.05)；与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠S期明显降低(P＜0.05)，中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠S期改变不明显(P＞0.05)；与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠G2期明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠G2期改变不明显(P＞0.05)。(见表5、图5)。
0.05)；与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠S期明显降低(P＜0.05)，中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠S期改变不明显(P＞0.05)；与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠G2期明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠G2期改变不明显(P＞0.05)。(见表5、图5)。
[0145] 表5中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型细胞周期的影响( n＝6)[0146]
[0147] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05
[0148] 3.6中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型细胞凋亡率的影响
[0149] 结果表明，模型组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠的细胞凋亡率分别为(5.2933±0.9249)％、(7.5717±0.6930)％、(8.1983±0.7523)％、(8.1667±0.7392)％、(8.0067±
1.0206)％。与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组、中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型细胞凋亡率均明显降低(P＜0.05)。(见表
6、图6)。
1.0206)％。与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组、中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型细胞凋亡率均明显降低(P＜0.05)。(见表
6、图6)。
[0150] 表6中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型细胞凋亡率的影响
[0151]
[0152]
[0153] 注：与模型组比较：*P<0.05
[0154] 3.7中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表达的影响
[0155] 结果表明，与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表达OD值明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表达OD值改变不明显(P＞0.05)。(见表7、图7)。
[0156] 表7中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1表达的影响( n＝8，OD值)
[0157]
[0158] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05
[0159] 3.8中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白相对表达量的影响
[0160] 结果表明，与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白相对表达量明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白相对表达量改变不明显(P＞0.05)。(见表8、图8)。
[0161] 表8中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白相对表达量的影响( n＝7)
[0162]
[0163]
[0164] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05
[0165] 3.9中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1基因的影响
[0166] 结果表明，与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1 mRNA表达量表达明显降低(P＜0.05)，而中药组合物低剂量组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1mRNA表达量表达改变不明显(P＞0.05)。(见表9、图9)。
[0167] 表9中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型Hedgehog信号通路关键分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1基因的影响( n＝7，2-△△Ct)
[0168]
[0169] 注：与模型组比较：*P<0.05，#P＞0.05
[0170] 3.10中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型重要脏器指数的影响
[0171] 结果表明，与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型脑、心、肝、肾和肺指数改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物高、中、低剂量和5-氟尿嘧啶均对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型重要脏器无影响；与中药组合物高剂量组比较，中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型脑、心、肝、肾和肺指数改变不明显(P＞0.05)，说明即使增加中药组合物剂量，中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型脑、心、肝、肾和肺指数也无影响。(见表10、表11、图10)。
[0172] 表10中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠脑指数、心指数、肝指数的影响( n＝8)
[0173]
[0174] 注：与模型组比较：*P＞0.05；与高剂量组比较，#P＞0.05
[0175] 表11中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠肾指数、肺指数的影响(n＝8)
[0176]
[0177] 注：与模型组比较：*P＞0.05；与高剂量组比较，#P＞0.05
[0178] 3.11中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型体重的影响
[0179] 结果表明，各组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠给药过程中，胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠体重呈现上升趋势，说明中药组合物高、中、低剂量对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠体重无影响。与模型组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠0d、7d、14d、28d体重改变不明显(P＞0.05)，进一步说明中药组合物高、中、低剂量对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠体重无影响，说明中药组合物高、中、低剂量与5-氟尿嘧啶均对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠体重无影响；与中药组合物高剂量组比较，中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、5-氟尿嘧啶组胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠体重改变不明显(P＞0.05)，说明即使增加中药组合物剂量，中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠体重也无影响。(见表12、图11)。
[0180] 表12中药组合物对胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤模型小鼠体重的影响( n＝8)[0181]
[0182] 注：与模型组比较：*P＞0.05；与高剂量组比较，#P＞0.05。
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