提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法
阅读：696发布：2020-05-08
专利汇可以提供提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法。本发明双 荧光 素酶报告基因检测或核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验的实验组采用紫外光诱导培养细胞，对照组采用常规方法培养细胞，分别对实验组和对照组进行双荧光素酶报告基因检测，分别对实验组和对照组非编码区域距离不大于50bp的SNP中相应SNP位点进行统计学差异比较，其中统计学差异P，下面是提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法专利的具体信息内容。
1.提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法，其特征在于：双荧光素酶报告基因检测前实验组的细胞培养采用紫外光诱导培养，对照组的细胞培养采用常规方法培养，分别对实验组和对照组进行双荧光素酶报告基因检测，分别对实验组和对照组非编码区域距离不大于50bp的SNP中相应SNP位点进行统计学差异比较，其中统计学差异P<0.05的SNP位点则为具有功能效应特点的SNP位点；
或核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验前实验组的细胞培养采用紫外光诱导培养，对照组的细胞培养采用常规方法培养，分别对实验组和对照组进行核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验，分别对实验组和对照组非编码区域距离不大于50bp的SNP中相应SNP位点的显影条带进行对比，其中实验组相对于对照组，显影条带出现变化所指示的SNP位点即为具有功能效应特点的SNP位点。
2.根据权利要求1所述提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法，其特征在于：双荧光素酶报告基因检测前的细胞培养采用紫外光诱导培养的具体方法为脂质体转染细胞培养4 6h后，将细胞培养液更换为磷酸缓冲盐溶液，进行~
紫外光诱导照射30 40s，再将磷酸缓冲盐溶液更换为细胞培养液继续培养。
~
3.根据权利要求1所述提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法，其特征在于：核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验前的细胞培养采用紫外光诱导培养的具体方法为细胞培养长至50% 60%，将细胞培养液更换为磷酸缓冲盐溶液，进行~
紫外光诱导照射30 40s，再将磷酸缓冲盐溶液更换为细胞培养液继续培养。
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提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点
检测准确率的方法
技术领域
背景技术
[0002] 在研究基因内的某一SNP的生物学意义的科学实验中，一些位于非编码区的SNP位点可能具有某些潜在的功能性影响，而验证这些位点是否具有潜在的功能性，往往通过双荧光报告基因检测实验和EMSA等实验来证实。
[0003] 双荧光素酶报告基因检测是测定上游刺激对下游靶基因在转录水平的影响。一般应用于验证SNP是否具有潜在启动子或增强子的调控作用。双荧光素酶报告基因检测方法操作过程相对简单，检测灵敏度较高。只需要成功将含有目标SNP的序列插入到报告载体中，然后转染至细胞并培养48h后，用适当试剂等裂解细胞，测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断目的基因的转录调控作用。但双荧光报告基因检测技术的应用上具有一定的局限性，在构建重组的报告载体时，插入的目标SNP序列中掺杂其他的SNP位点且位置较近（<50bp），则无法判定是哪一个SNP起到潜在的功能作用。
[0004] 除双荧光素酶报告基因检测分析外，凝胶迁移实验（EMSA）也可用于判断候选SNP是否具有调控作用。EMSA又称凝胶迁移实验是研究基因调控和确定蛋白与DNA之间相互作用的核心技术之一。因有调控作用的SNP序列可能结合了某种转录因子，从而调控下游基因的表达，故在EMSA实验中可观测到相应的转录因子结合的条带。
[0005] 在研究PAH基因内的候选SNP功能效应时，一些位于非编码区的SNP位点可能具有明显的功能性影响，而非编码区的SNP是否具有功能性往往通过双荧光报告基因检测实验和EMSA等实验进行验证。然而，当非编码区的SNP（<50bp）距离较近时，不能通过以上两种常规的技术手段区分哪一个是具有功能性的位点。
发明内容
[0006] 在进行SNP位点的功能验证时，会遇到距离较近的SNP的干扰，无法通过常规实验结果进行准确判断具有功能性的SNP位点。
[0007] 本发明针对非编码区的SNP（<50bp）距离较近时，不能通过以上双荧光素酶报告基因检测分析和凝胶迁移实验区分哪一个是具有功能性的位点的技术问题，提供提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法。本发明在不增加实验预算的前提下，通过在细胞培养过程中增加紫外光照射诱导培养过程，准确分析出距离较近的SNP（<50bp）中具有功能效应特点的SNP位点，提高实验结论的可靠性。
[0008] 提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法，具体步骤如下：双荧光素酶报告基因检测前实验组的细胞培养采用紫外光诱导培养，对照组的细胞培养采用常规方法培养，分别对实验组和对照组进行双荧光素酶报告基因检测，分别对实验组和对照组非编码区域距离不大于50bp的SNP中相应SNP位点进行统计学差异比较，其中统计学差异P<0.05的SNP位点则为具有功能效应特点的SNP位点；
或核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验前实验组的细胞培养采用紫外光诱导培养，对照组的细胞培养采用常规方法培养，分别对实验组和对照组进行核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验，分别对实验组和对照组非编码区域距离不大于50bp的SNP中相应SNP位点的显影条带进行对比，其中实验组相对于对照组，显影条带出现变化所指示的SNP位点即为具有功能效应特点的SNP位点。
或核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验前实验组的细胞培养采用紫外光诱导培养，对照组的细胞培养采用常规方法培养，分别对实验组和对照组进行核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验，分别对实验组和对照组非编码区域距离不大于50bp的SNP中相应SNP位点的显影条带进行对比，其中实验组相对于对照组，显影条带出现变化所指示的SNP位点即为具有功能效应特点的SNP位点。
[0009] 进一步的，所述双荧光素酶报告基因检测前的细胞培养采用紫外光诱导培养的具体方法为脂质体转染细胞培养4 6h后，将细胞培养液更换为磷酸缓冲盐溶液，进行紫外光~诱导照射30 40s，再将磷酸缓冲盐溶液更换为细胞培养液继续培养。
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[0010] 进一步的，所述核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验前的细胞培养采用紫外光诱导培养的具体方法为细胞培养长至50% 60%，将细胞培养液更换为磷酸缓冲盐溶液，进行紫外光~诱导照射30 40s，再将磷酸缓冲盐溶液更换为细胞培养液继续培养。
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[0011] 本发明的有益效果是：（1）本发明在不增加实验预算的前提下，通过在细胞培养过程中增加紫外光照射诱导培养过程，准确分析出距离较近的SNP（<50bp）中具有功能效应特点的SNP位点，提高实验结论的可靠性；
（2）本发明方法所确定的SNP位点，该位点在EMSA实验中确定的条带可直接进行下一步实验，如通过蛋白质谱分析该SNP所结合的转录因子；
（3）可对所筛选出的SNP位点做下一步的功能分析，如SNP在基因中起到某种调控作用（如增强子作用或启动子作用等的判断）。
附图说明
（2）本发明方法所确定的SNP位点，该位点在EMSA实验中确定的条带可直接进行下一步实验，如通过蛋白质谱分析该SNP所结合的转录因子；
（3）可对所筛选出的SNP位点做下一步的功能分析，如SNP在基因中起到某种调控作用（如增强子作用或启动子作用等的判断）。
附图说明
[0012] 图1为对比例1已有HEK293细胞的PAH基因上非转录编码区SNP位点双荧光素酶报告基因检测的体外功能实验结果；图2为对比例2已有HEK293细胞核蛋白抽提物的PAH基因SNP1位点EMSA实验结果；
图3为对比例2已有HEK293细胞核蛋白抽提物的PAH基因SNP2位点EMSA实验结果；
图4为实施例1已有HEK293细胞经紫外光照射诱导培养的实验组与对照组的双荧光素酶报告基因检测荧光值对比图；
图5为实施例2已有HEK293细胞经紫外光照射诱导培养的实验组与对照组的核蛋白抽提物的EMSA对比实验结果。
图3为对比例2已有HEK293细胞核蛋白抽提物的PAH基因SNP2位点EMSA实验结果；
图4为实施例1已有HEK293细胞经紫外光照射诱导培养的实验组与对照组的双荧光素酶报告基因检测荧光值对比图；
图5为实施例2已有HEK293细胞经紫外光照射诱导培养的实验组与对照组的核蛋白抽提物的EMSA对比实验结果。
具体实施方式
[0013] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
[0014] 本发明实施例和对比例所述SNP1，SNP2的生物素标记探针从基因合成技术公司合成，其中SNP1探针如下SNP1-C等位基因型标记探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：
ccttgggctaccagacgaccacagggcctct；
SNP1-C等位基因型标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：
agaggccctgtggtcgtctggtagcccaagg；
SNP1-T等位基因型标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：
ccttgggctaccagatgaccacagggcctct；
SNP1-T等位基因型标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.4所示：
agaggccctgtggtcatctggtagcccaagg；
SNP1-C等位基因型未标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.5所示：
ccttgggctaccagacgaccacagggcctct；
SNP1-C等位基因型未标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.6所示：
agaggccctgtggtcgtctggtagcccaagg；
SNP1-T等位基因型未标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.7所示：
ccttgggctaccagatgaccacagggcctct；
SNP1-T等位基因型未标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.8所示：
agaggccctgtggtcatctggtagcccaagg；
其中SNP2探针如下
SNP2-C等位基因型标记探针的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示：
cagggcctctgtagccgtccatgtggagtac；
SNP2-C等位基因型标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.10所示：
gtactccacatggacggctacagaggccctg；
SNP2-T等位基因型标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.11所示：
cagggcctctgtagctgtccatgtggagtac；
SNP2-T等位基因型标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.12所示：
gtactccacatggacagctacagaggccctg；
SNP2-C等位基因型未标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.13所示：
cagggcctctgtagccgtccatgtggagtact；
SNP2-C等位基因型未标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.14所示：
gtactccacatggacggctacagaggccctg；
SNP2-T等位基因型未标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.15所示：
cagggcctctgtagctgtccatgtggagtac；
SNP2-T等位基因型未标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.16所示：
gtactccacatggacagctacagaggccctg；
双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：RG027）从上海碧云天生物技术有限公司购得；
核蛋白抽提试剂盒（货号：P0027）从上海碧云天生物技术有限公司购得；LightShift化学发光EMSA试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司（货号：20148）；细胞使用实验室已有HEK293细胞系。
ccttgggctaccagacgaccacagggcctct；
SNP1-C等位基因型标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：
agaggccctgtggtcgtctggtagcccaagg；
SNP1-T等位基因型标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：
ccttgggctaccagatgaccacagggcctct；
SNP1-T等位基因型标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.4所示：
agaggccctgtggtcatctggtagcccaagg；
SNP1-C等位基因型未标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.5所示：
ccttgggctaccagacgaccacagggcctct；
SNP1-C等位基因型未标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.6所示：
agaggccctgtggtcgtctggtagcccaagg；
SNP1-T等位基因型未标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.7所示：
ccttgggctaccagatgaccacagggcctct；
SNP1-T等位基因型未标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.8所示：
agaggccctgtggtcatctggtagcccaagg；
其中SNP2探针如下
SNP2-C等位基因型标记探针的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示：
cagggcctctgtagccgtccatgtggagtac；
SNP2-C等位基因型标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.10所示：
gtactccacatggacggctacagaggccctg；
SNP2-T等位基因型标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.11所示：
cagggcctctgtagctgtccatgtggagtac；
SNP2-T等位基因型标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.12所示：
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SNP2-C等位基因型未标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.13所示：
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SNP2-C等位基因型未标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.14所示：
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SNP2-T等位基因型未标记探针序列核苷酸序列如SEQIDNO.15所示：
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SNP2-T等位基因型未标记探针互补链序列核苷酸序列如SEQIDNO.16所示：
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双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：RG027）从上海碧云天生物技术有限公司购得；
核蛋白抽提试剂盒（货号：P0027）从上海碧云天生物技术有限公司购得；LightShift化学发光EMSA试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司（货号：20148）；细胞使用实验室已有HEK293细胞系。
[0015] 对比例1：PAH基因上非编码区SNP位点的重组报告载体转入实验室现有HEK293细胞中的双荧光素酶报告基因检测，具体步骤为：1.1 双荧光素酶报告基因检测前的已有HEK293细胞的培养
（1）HEK293细胞铺板：取24孔板细胞培养皿，每孔细胞铺板5万HEK293细胞；
（2）将HEK293细胞培养长至80%左右；
（3）将以构建好的重组报告载体（该载体中插入的目的基因中包含SNP1和SNP2两个突变性位点，距离相差21bp，且两位点存在连锁不平衡效应），分别为空载报告载体P，重组报告载体P(C-C)（SNP1等位基因型为C，SNP2等位基因型为C）和重组报告载体P(T-T)（SNP1等位基因型为T，SNP2等位基因型为T），通过脂质体转染至HEK293细胞当中，每4 6h后更换细~
胞培养液；
（4）继续培养48h后取出细胞，进行下一步实验；
1.2双荧光素酶报告基因检测
实验操作参考上海碧云天生物技术有限公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：
RG027）说明书，具体步骤为：
（1）裂解细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀后，每孔加入报告基因细胞裂解液
200ul,充分裂解后，转速为10000-12000rpm离心3 5min，取上清用于测定；
~
（2）融解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温，海肾萤光素酶检测底物(100×)置于冰盒上备用；
（3）按照每个样品100ul的量，取1.2ml海肾萤光素酶检测缓冲液，按照海肾萤光素酶检测底物与海肾萤光素酶检测缓冲液的体积比为1:100的比例，在海肾萤光素酶检测缓冲液中加入12 ul海肾萤光素酶检测底物配制成海肾萤光素酶检测工作液；
（4）按仪器操作说明书开启具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为
2s，测定时间设为10s；
（5）每个样品测定时，取样品100ul，加入100ul萤火虫萤光素酶检测试剂，用微量移液器打匀后测定荧光值，以报告基因细胞裂解液为空白对照；
在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入100ul海肾萤光素酶检测工作液，用微量移液器打匀后测定荧光值；
1.3测定的荧光值应用GraphPad Prism绘图统计软件进行t-test算法分析，如图1所示；
在应用双荧光素酶报告基因检测技术验证SNP是否具有潜在的功能性，由图1统计分析结果可以看出，P（C-C）与P（T-T）之间P=0.0149(t-test检验，P<0.05即存在显著差异)；但已构建好的重组报告载体通过测序已知（该载体中插入的目的片段中包含SNP1和SNP2两个突变性位点，距离相差21bp，且两位点存在连锁），重组报告载体P(C-C)-SNP1等位基因型为C，SNP2等位基因型为C；重组报告载体P（T-T）-SNP1等位基因型为T，SNP2等位基因型为T，给功能验证分析增加了可疑性，无法判断出是由哪一SNP位点所带来的潜在的功能影响；当出现以上状况时，因SNP1，SNP2距离仅相差21bp，在重组报告载体中无法用技术手段将两位点分开。
（1）HEK293细胞铺板：取24孔板细胞培养皿，每孔细胞铺板5万HEK293细胞；
（2）将HEK293细胞培养长至80%左右；
（3）将以构建好的重组报告载体（该载体中插入的目的基因中包含SNP1和SNP2两个突变性位点，距离相差21bp，且两位点存在连锁不平衡效应），分别为空载报告载体P，重组报告载体P(C-C)（SNP1等位基因型为C，SNP2等位基因型为C）和重组报告载体P(T-T)（SNP1等位基因型为T，SNP2等位基因型为T），通过脂质体转染至HEK293细胞当中，每4 6h后更换细~
胞培养液；
（4）继续培养48h后取出细胞，进行下一步实验；
1.2双荧光素酶报告基因检测
实验操作参考上海碧云天生物技术有限公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：
RG027）说明书，具体步骤为：
（1）裂解细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀后，每孔加入报告基因细胞裂解液
200ul,充分裂解后，转速为10000-12000rpm离心3 5min，取上清用于测定；
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（2）融解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温，海肾萤光素酶检测底物(100×)置于冰盒上备用；
（3）按照每个样品100ul的量，取1.2ml海肾萤光素酶检测缓冲液，按照海肾萤光素酶检测底物与海肾萤光素酶检测缓冲液的体积比为1:100的比例，在海肾萤光素酶检测缓冲液中加入12 ul海肾萤光素酶检测底物配制成海肾萤光素酶检测工作液；
（4）按仪器操作说明书开启具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为
2s，测定时间设为10s；
（5）每个样品测定时，取样品100ul，加入100ul萤火虫萤光素酶检测试剂，用微量移液器打匀后测定荧光值，以报告基因细胞裂解液为空白对照；
在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入100ul海肾萤光素酶检测工作液，用微量移液器打匀后测定荧光值；
1.3测定的荧光值应用GraphPad Prism绘图统计软件进行t-test算法分析，如图1所示；
在应用双荧光素酶报告基因检测技术验证SNP是否具有潜在的功能性，由图1统计分析结果可以看出，P（C-C）与P（T-T）之间P=0.0149(t-test检验，P<0.05即存在显著差异)；但已构建好的重组报告载体通过测序已知（该载体中插入的目的片段中包含SNP1和SNP2两个突变性位点，距离相差21bp，且两位点存在连锁），重组报告载体P(C-C)-SNP1等位基因型为C，SNP2等位基因型为C；重组报告载体P（T-T）-SNP1等位基因型为T，SNP2等位基因型为T，给功能验证分析增加了可疑性，无法判断出是由哪一SNP位点所带来的潜在的功能影响；当出现以上状况时，因SNP1，SNP2距离仅相差21bp，在重组报告载体中无法用技术手段将两位点分开。
[0016] 对比例2：PAH基因上非转录编码区SNP位点EMSA功能试验，具体操作步骤：2.1核蛋白抽提物的制备：
实验操作参考上海碧云天生物技术有限公司细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（货号：P0027）说明书，具体步骤为：
（1）HEK293细胞培养：将实验室现有的HEK293细胞，10cm规格的培养皿中铺板50万HEK293细胞，细胞培养至90% 95%取出用于抽提核蛋白；
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（2）在超净工作台中，将取出的细胞进行消化处理，使用离心机在条件为4℃，转速
300rpm离心3min获得沉淀的细胞；
（3）加入300ul已加入PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A；在漩涡混匀器上最高速剧烈Vortex10s，将细胞沉淀完全悬浮并分散；
（4）冰浴15min，每管加入细胞浆蛋白抽提试剂B10ul，再以最高速Vortex5s，冰浴1min；
（5）再次最高速剧烈Vortex5s，在温度为4℃，转速12000rpm离心5min得到细胞沉淀；
（6）细胞沉淀中加入50ul已加入PMSF的细胞核蛋白抽提试剂，最高速剧烈Vortex30s，冰浴15s；重复操作30min；
（7）使用离心机在温度为4℃，最大转速离心10min；上清液为所需的的核蛋白抽提物，分装至预冷的EP管中（-80℃保存），待进行下一步实验时取出；
2.2EMSA-SNP1探针与核蛋白抽提物的结合反应
2.2.1SNP1结合反应组别设置如下：
（1）阴性对照组（分别包括SNP1的C或T等位基因型的生物素标记探针，在泳道1和2）（2）实验组（分别括含SNP1的C或T等位基因型的生物素标记探针＋核蛋白抽提物，在泳道3和6）
（3）特异竞争组（分别包括SNP1的C或T等位基因型的生物素标记探针＋200倍SNP1的C和T未标记探针+核蛋白抽提物，在泳道4和7）
（4）非特异竞争组（分别包括SNP1的C或T等位基因型的生物素标记探针＋200倍SNP1的T和C未标记探针+核蛋白抽提物，在泳道5和8）
结合反应：在加入生物素标记的探针前，先将其他成分混匀，然后加入生物素标记的探针（所有实验样品中所加探针均为变性后的双链探针），用移液器轻轻吹打混匀各成分，在室温状态下孵育30min后上样电泳；
2.2.2电泳分析
（1）6.5%非变性PAGE凝胶制备：4.6ml无菌超纯水，0.7ml5×TBE溶液，1.54ml40%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液，56ul 30%甘油，63ul 10%APS，7ul TEMED；
（2）将孵育好的样本加入LoadingBuffer后，上样至制备好的6.5%非变性PAGE凝胶中；
（2）应用电泳仪，0.5×TBE溶液作为电泳缓冲液，设置电压120V，电泳65min；
2.2.3转膜及紫外交联
（1）将待用的尼龙膜裁剪至应用大小，放入0.5×TBE缓冲溶液中浸泡10min；
（2）应用半干转膜仪，在转膜仓中，按照三层转膜滤纸-尼龙膜-胶-三层转膜滤纸的方式，依次将其铺平在转膜仓上，最后再盖上电极并锁好，选择Bio-Rad半干转系统中的high-gel程序，转膜10min；
（3）转膜过程结束之后，将膜转移到干净的盒子中，在超净台中放置在距紫外灯10-
12cm的地方，打开紫外灯交联10min；
（4）关闭紫外灯，开通风30min，使膜完全干燥；
2.2.4化学显影实验操作（洗膜）
参考ThermoFisherScientific公司的化学发光显影试剂盒（货号：20148）操作说明书；
（1）在实验之前，检查各试剂有无絮状沉淀，如出现则在42℃水浴锅中将其融解；
（2）取15ml blocking buffer，沿载有膜的盒子边缘加入，轻轻晃动使膜完全润湿；然后放置在脱色摇床上，设置转速50rpm，时长为15min；
（3）配制：blockingbuffer与conjugate的体积比为300:1的比例配制15ml混合试剂；更换conjugate/blockingbuffer，在转速为50rpm的脱色摇床上洗膜15min；
（4）配制1×washingbuffer：稀释10ml 4×washingbuffer定量于50ml，上下颠倒使其混匀更换1×washingbuffer，在转速为50的脱色摇床上洗膜5min（每次12ml），重复4次；
（5）更换SubstrateEquilibrationBuffer（20ml），在转速为50rpm的脱色摇床上洗膜
5min；
（6）将4ml Luminol/EnhancerSolution加入到4ml的StablePeroxideSolution，配置显影工作液workingbuffer；将workingbuffer均匀的滴在膜的表面，使膜表面充分接触workingbuffer；
（7）在显影仪上进行显影；设置程序为noLighter，movie(拍照间隔为30s一张，一共拍摄5min)；
2.3 EMSA-SNP2探针与核蛋白抽提物的结合反应
2.3.1SNP2结合反应组别设置如下：
（1）阴性对照组（分别包括SNP2的C或T等位基因型的生物素标记探针，在泳道1和2）（2）实验组（分别括含SNP2的C或T等位基因型的生物素标记探针＋核蛋白抽提物，在泳道3和6）
（3）特异竞争组（分别包括SNP2的C或T等位基因型的生物素标记探针＋200倍SNP2的C或T未标记探针+核蛋白抽提物，在泳道4和7）
（4）非特异竞争组（分别包括SNP2的C或T等位基因型的生物素标记探针＋200倍SNP2的T或C未标记探针+核蛋白抽提物，在泳道5和8）
结合反应：在加入生物素标记的探针前，先将其他成分混匀，然后再加入生物素标记的探针，用移液器轻轻吹打混匀各成分，在室温状态下孵育30min后上样电泳；
其余操作步骤见2.2.2-2.2.4；
本对比例实验中，分别得到SNP1的EMSA实验结果如图2所示，SNP2的EMSA结果如图3所示；图中C*/T*代表生物素标记探针，C/T代表未做标记的探针，NE代表核蛋白抽提物，+表示加入对应物质，-号代表未加对应物质；由图2的结果只能分析出SNP1的T等位基因可能与转录因子特异性结合，如（6,7,8）泳道的条带一，条带二和条带三所示，因SNP1T*生物素标记探针与某种转录因子特异性结合，会被SNP1T未标记探针所替代，可判断出图2结果为SNP1T等位基因可与某种转录因子特异结合；根据图3显示（与图2分析过程相同），通过EMSA结果判断出SNP2C等位基因可与某种转录因子结合，综合图2和3的结果也不能够解决对比例1中的问题，分辨不出哪一SNP位点是具有功能性的位点
实施例1：本实施例细胞为已有HEK293细胞；
提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法，具体步骤如下：双荧光素酶报告基因检测前实验组的细胞培养采用紫外光诱导培养，对照组的细胞培养采用常规方法培养，分别对实验组和对照组进行双荧光素酶报告基因检测，分别对实验组和对照组非编码区域距离不大于50bp的SNP中相应SNP位点进行统计学差异比较，其中统计学差异P<0.05的SNP位点则为具有功能效应特点的SNP位点；
具体步骤如下：
3.1双荧光素酶报告基因检测前的HEK293细胞的UV诱导培养
（1）HEK293细胞铺板：取2板24孔板细胞培养皿，每孔细胞铺板5万HEK293细胞，其中一板HEK293细胞标记UV实验组，另一板HEK293细胞标记正常对照组；
（2）将细胞培养长至80%左右；
（3）将已构建好的重组报告载体，分别为空载报告载体P，P(C-C)（SNP1等位基因型为C，SNP2等位基因型为C），重组报告载体P(T-T)（SNP1等位基因型为T，SNP2等位基因型为T），通过脂质体转染至细胞当中；
（4）脂质体转染细胞继续培养4 6h后，UV实验组更换1×PBS，并应用手提式紫外线分析~
仪，紫外光照30s后，将PBS更换成细胞培养液继续培养，正常对照组直接更换细胞培养液；
（5）UV实验组和正常对照组细胞继续培养48h，分别将UV实验组和正常对照组取出，进行下一步实验；
实验组和正常对照组的实验其余操作与对比例1中的步骤1.2-1.3相同；
本实施例的双荧光检测结果如图4所示，将正常对照组与UV实验组的荧光值应用GraphPad Prism绘图统计软件进行对比分析，因为脂质体转染细胞在UV诱导条件下培养，具有潜在功能性的位点的表达会呈现出变化，通过对比变化趋势，筛选可能的功能性位点；
由图4可看出在增加UV诱导细胞培养条件的实验后，具有变化趋势的是P（C-C）与UV-P（C-C）两组荧光值之间具有统计学上的显著差异（P<0.05，t-test），结合经典EMSA结果可以得出，SNP2的C等位基因可以特意性结合某种核蛋白；因此可以证明最可能具有功能性位点的是SNP2；在不增加任何实验经费和繁琐的实验下，可精准判断最可能的SNP功能位点。
实验操作参考上海碧云天生物技术有限公司细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（货号：P0027）说明书，具体步骤为：
（1）HEK293细胞培养：将实验室现有的HEK293细胞，10cm规格的培养皿中铺板50万HEK293细胞，细胞培养至90% 95%取出用于抽提核蛋白；
~
（2）在超净工作台中，将取出的细胞进行消化处理，使用离心机在条件为4℃，转速
300rpm离心3min获得沉淀的细胞；
（3）加入300ul已加入PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A；在漩涡混匀器上最高速剧烈Vortex10s，将细胞沉淀完全悬浮并分散；
（4）冰浴15min，每管加入细胞浆蛋白抽提试剂B10ul，再以最高速Vortex5s，冰浴1min；
（5）再次最高速剧烈Vortex5s，在温度为4℃，转速12000rpm离心5min得到细胞沉淀；
（6）细胞沉淀中加入50ul已加入PMSF的细胞核蛋白抽提试剂，最高速剧烈Vortex30s，冰浴15s；重复操作30min；
（7）使用离心机在温度为4℃，最大转速离心10min；上清液为所需的的核蛋白抽提物，分装至预冷的EP管中（-80℃保存），待进行下一步实验时取出；
2.2EMSA-SNP1探针与核蛋白抽提物的结合反应
2.2.1SNP1结合反应组别设置如下：
（1）阴性对照组（分别包括SNP1的C或T等位基因型的生物素标记探针，在泳道1和2）（2）实验组（分别括含SNP1的C或T等位基因型的生物素标记探针＋核蛋白抽提物，在泳道3和6）
（3）特异竞争组（分别包括SNP1的C或T等位基因型的生物素标记探针＋200倍SNP1的C和T未标记探针+核蛋白抽提物，在泳道4和7）
（4）非特异竞争组（分别包括SNP1的C或T等位基因型的生物素标记探针＋200倍SNP1的T和C未标记探针+核蛋白抽提物，在泳道5和8）
结合反应：在加入生物素标记的探针前，先将其他成分混匀，然后加入生物素标记的探针（所有实验样品中所加探针均为变性后的双链探针），用移液器轻轻吹打混匀各成分，在室温状态下孵育30min后上样电泳；
2.2.2电泳分析
（1）6.5%非变性PAGE凝胶制备：4.6ml无菌超纯水，0.7ml5×TBE溶液，1.54ml40%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液，56ul 30%甘油，63ul 10%APS，7ul TEMED；
（2）将孵育好的样本加入LoadingBuffer后，上样至制备好的6.5%非变性PAGE凝胶中；
（2）应用电泳仪，0.5×TBE溶液作为电泳缓冲液，设置电压120V，电泳65min；
2.2.3转膜及紫外交联
（1）将待用的尼龙膜裁剪至应用大小，放入0.5×TBE缓冲溶液中浸泡10min；
（2）应用半干转膜仪，在转膜仓中，按照三层转膜滤纸-尼龙膜-胶-三层转膜滤纸的方式，依次将其铺平在转膜仓上，最后再盖上电极并锁好，选择Bio-Rad半干转系统中的high-gel程序，转膜10min；
（3）转膜过程结束之后，将膜转移到干净的盒子中，在超净台中放置在距紫外灯10-
12cm的地方，打开紫外灯交联10min；
（4）关闭紫外灯，开通风30min，使膜完全干燥；
2.2.4化学显影实验操作（洗膜）
参考ThermoFisherScientific公司的化学发光显影试剂盒（货号：20148）操作说明书；
（1）在实验之前，检查各试剂有无絮状沉淀，如出现则在42℃水浴锅中将其融解；
（2）取15ml blocking buffer，沿载有膜的盒子边缘加入，轻轻晃动使膜完全润湿；然后放置在脱色摇床上，设置转速50rpm，时长为15min；
（3）配制：blockingbuffer与conjugate的体积比为300:1的比例配制15ml混合试剂；更换conjugate/blockingbuffer，在转速为50rpm的脱色摇床上洗膜15min；
（4）配制1×washingbuffer：稀释10ml 4×washingbuffer定量于50ml，上下颠倒使其混匀更换1×washingbuffer，在转速为50的脱色摇床上洗膜5min（每次12ml），重复4次；
（5）更换SubstrateEquilibrationBuffer（20ml），在转速为50rpm的脱色摇床上洗膜
5min；
（6）将4ml Luminol/EnhancerSolution加入到4ml的StablePeroxideSolution，配置显影工作液workingbuffer；将workingbuffer均匀的滴在膜的表面，使膜表面充分接触workingbuffer；
（7）在显影仪上进行显影；设置程序为noLighter，movie(拍照间隔为30s一张，一共拍摄5min)；
2.3 EMSA-SNP2探针与核蛋白抽提物的结合反应
2.3.1SNP2结合反应组别设置如下：
（1）阴性对照组（分别包括SNP2的C或T等位基因型的生物素标记探针，在泳道1和2）（2）实验组（分别括含SNP2的C或T等位基因型的生物素标记探针＋核蛋白抽提物，在泳道3和6）
（3）特异竞争组（分别包括SNP2的C或T等位基因型的生物素标记探针＋200倍SNP2的C或T未标记探针+核蛋白抽提物，在泳道4和7）
（4）非特异竞争组（分别包括SNP2的C或T等位基因型的生物素标记探针＋200倍SNP2的T或C未标记探针+核蛋白抽提物，在泳道5和8）
结合反应：在加入生物素标记的探针前，先将其他成分混匀，然后再加入生物素标记的探针，用移液器轻轻吹打混匀各成分，在室温状态下孵育30min后上样电泳；
其余操作步骤见2.2.2-2.2.4；
本对比例实验中，分别得到SNP1的EMSA实验结果如图2所示，SNP2的EMSA结果如图3所示；图中C*/T*代表生物素标记探针，C/T代表未做标记的探针，NE代表核蛋白抽提物，+表示加入对应物质，-号代表未加对应物质；由图2的结果只能分析出SNP1的T等位基因可能与转录因子特异性结合，如（6,7,8）泳道的条带一，条带二和条带三所示，因SNP1T*生物素标记探针与某种转录因子特异性结合，会被SNP1T未标记探针所替代，可判断出图2结果为SNP1T等位基因可与某种转录因子特异结合；根据图3显示（与图2分析过程相同），通过EMSA结果判断出SNP2C等位基因可与某种转录因子结合，综合图2和3的结果也不能够解决对比例1中的问题，分辨不出哪一SNP位点是具有功能性的位点
实施例1：本实施例细胞为已有HEK293细胞；
提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法，具体步骤如下：双荧光素酶报告基因检测前实验组的细胞培养采用紫外光诱导培养，对照组的细胞培养采用常规方法培养，分别对实验组和对照组进行双荧光素酶报告基因检测，分别对实验组和对照组非编码区域距离不大于50bp的SNP中相应SNP位点进行统计学差异比较，其中统计学差异P<0.05的SNP位点则为具有功能效应特点的SNP位点；
具体步骤如下：
3.1双荧光素酶报告基因检测前的HEK293细胞的UV诱导培养
（1）HEK293细胞铺板：取2板24孔板细胞培养皿，每孔细胞铺板5万HEK293细胞，其中一板HEK293细胞标记UV实验组，另一板HEK293细胞标记正常对照组；
（2）将细胞培养长至80%左右；
（3）将已构建好的重组报告载体，分别为空载报告载体P，P(C-C)（SNP1等位基因型为C，SNP2等位基因型为C），重组报告载体P(T-T)（SNP1等位基因型为T，SNP2等位基因型为T），通过脂质体转染至细胞当中；
（4）脂质体转染细胞继续培养4 6h后，UV实验组更换1×PBS，并应用手提式紫外线分析~
仪，紫外光照30s后，将PBS更换成细胞培养液继续培养，正常对照组直接更换细胞培养液；
（5）UV实验组和正常对照组细胞继续培养48h，分别将UV实验组和正常对照组取出，进行下一步实验；
实验组和正常对照组的实验其余操作与对比例1中的步骤1.2-1.3相同；
本实施例的双荧光检测结果如图4所示，将正常对照组与UV实验组的荧光值应用GraphPad Prism绘图统计软件进行对比分析，因为脂质体转染细胞在UV诱导条件下培养，具有潜在功能性的位点的表达会呈现出变化，通过对比变化趋势，筛选可能的功能性位点；
由图4可看出在增加UV诱导细胞培养条件的实验后，具有变化趋势的是P（C-C）与UV-P（C-C）两组荧光值之间具有统计学上的显著差异（P<0.05，t-test），结合经典EMSA结果可以得出，SNP2的C等位基因可以特意性结合某种核蛋白；因此可以证明最可能具有功能性位点的是SNP2；在不增加任何实验经费和繁琐的实验下，可精准判断最可能的SNP功能位点。
[0017] 实施例2：本实施例细胞为已有HEK293细胞；核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验前实验组的细胞培养采用紫外光诱导培养，对照组的细胞培养采用常规方法培养，分别对实验组和对照组进行核蛋白抽提物凝胶迁移EMSA实验，分别对实验组和对照组非编码区域距离不大于50bp的SNP中相应SNP位点的显影条带进行对比，其中实验组相对于对照组，显影条带出现变化所指示的SNP位点即为具有功能效应特点的SNP位点；
具体步骤如下：
4.1核蛋白抽提物的制备：
实验操作参考上海碧云天生物技术有限公司细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（货号：P0027）说明书，具体步骤为：
（1）HEK293细胞培养：将实验室现有的HEK293细胞，2板10cm规格的培养皿中均铺板50万HEK293细胞，一板细胞标记正常对照组，一板细胞标记UV实验组；
（2）当培养细胞长至50%-60%时，UV实验组更换1×PBS，并应用手提式紫外线分析仪，紫外光照30s后，将PBS更换成细胞培养液继续培养，正常对照组直接更换细胞培养液；UV实验组和正常对照组细胞均培养至90% 95%取出用于抽提核蛋白；
~
（3）在超净工作台中，分别将取出的UV实验组和正常对照组细胞进行消化，使用离心机在条件为4℃，转速300rpm离心3min获得沉淀的UV实验组细胞和正常对照组细胞；
（4）分别将300ul已加入PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A加入到UV实验组细胞和正常对照组细胞中，在漩涡混匀器上最高速剧烈Vortex10s，将细胞沉淀完全悬浮并分散；
（4）冰浴15min，每管加入细胞浆蛋白抽提试剂B10ul，再以最高速Vortex5s，冰浴1min；
（5）再次最高速剧烈Vortex5s，在温度为4℃，转速12000rpm离心5min得到UV实验组细胞和正常对照组细胞沉淀；
（6）分别将50ul已加入PMSF的细胞核蛋白抽提试剂加入到UV实验组细胞和正常对照组细胞沉淀中，最高速剧烈Vortex30s，冰浴15s；重复操作30min；
（7）分别使用离心机在温度为4℃，最大转速离心10min所得上清液为所需的UV实验组细胞核蛋白抽提物和正常对照组细胞核蛋白抽提物，分装至预冷的EP管中（-80℃保存），待进行下一步实验时取出；
4.2 UV诱导培养细胞的EMSA对比实验
SNP1/SNP2探针与核蛋白抽提物的结合反应，
结合反应组别设置如下：
（1）泳道1（包括SNP1的C等位基因型的生物素标记探针+HEK293UV照射核蛋白抽提物）；
（2）泳道2（括含SNP1的T等位基因型的生物素标记探针＋HEK293UV照射核蛋白抽提物）；
（3）泳道3（包括SNP2的C等位基因型的生物素标记探针＋HEK293核蛋白抽提物）；
（4）泳道4（包括SNP2的T等位基因型的生物素标记探针＋HEK293核蛋白抽提物）（5）泳道5（包括SNP1的C等位基因型的生物素标记探针＋HEK293核蛋白抽提物）；
（6）泳道6（括含SNP1的T等位基因型的生物素标记探针＋HEK293核蛋白抽提物）；
（7）泳道7（包括SNP2的C等位基因型的生物素标记探针＋HEK293UV照射核蛋白抽提物）；
（8）泳道8（包括SNP2的T等位基因型的生物素标记探针＋HEK293UV照射核蛋白抽提物）；
结合反应：在加入生物素标记的探针前，先将其他成分混匀，然后再加入生物素标记的探针，用微量移液器轻轻吹打混匀各成分，在室温状态下孵育30min后上样电泳；
其余操作步骤与对比例2的步骤2.2.2-2.2.4相同；
本实施例增加UV诱导细胞培养后的EMSA实验结果如图5所示，图中C*/T*代表生物素标记探针，NE代表对照组的核蛋白抽提物，UV-NE代表实验组的核蛋白抽提物；根据图5的EMSA实验的4个对比组分别为泳道1和5，泳道2和6，泳道3和7以及泳道4和8观察出，在增加UV条件而发生明显改变的是泳道3和7的条带3，在UV的介导下SNP2的C等位基因结合更多的转录因子蛋白(条带3)；与实施例1所获得的结果一致。
具体步骤如下：
4.1核蛋白抽提物的制备：
实验操作参考上海碧云天生物技术有限公司细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（货号：P0027）说明书，具体步骤为：
（1）HEK293细胞培养：将实验室现有的HEK293细胞，2板10cm规格的培养皿中均铺板50万HEK293细胞，一板细胞标记正常对照组，一板细胞标记UV实验组；
（2）当培养细胞长至50%-60%时，UV实验组更换1×PBS，并应用手提式紫外线分析仪，紫外光照30s后，将PBS更换成细胞培养液继续培养，正常对照组直接更换细胞培养液；UV实验组和正常对照组细胞均培养至90% 95%取出用于抽提核蛋白；
~
（3）在超净工作台中，分别将取出的UV实验组和正常对照组细胞进行消化，使用离心机在条件为4℃，转速300rpm离心3min获得沉淀的UV实验组细胞和正常对照组细胞；
（4）分别将300ul已加入PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A加入到UV实验组细胞和正常对照组细胞中，在漩涡混匀器上最高速剧烈Vortex10s，将细胞沉淀完全悬浮并分散；
（4）冰浴15min，每管加入细胞浆蛋白抽提试剂B10ul，再以最高速Vortex5s，冰浴1min；
（5）再次最高速剧烈Vortex5s，在温度为4℃，转速12000rpm离心5min得到UV实验组细胞和正常对照组细胞沉淀；
（6）分别将50ul已加入PMSF的细胞核蛋白抽提试剂加入到UV实验组细胞和正常对照组细胞沉淀中，最高速剧烈Vortex30s，冰浴15s；重复操作30min；
（7）分别使用离心机在温度为4℃，最大转速离心10min所得上清液为所需的UV实验组细胞核蛋白抽提物和正常对照组细胞核蛋白抽提物，分装至预冷的EP管中（-80℃保存），待进行下一步实验时取出；
4.2 UV诱导培养细胞的EMSA对比实验
SNP1/SNP2探针与核蛋白抽提物的结合反应，
结合反应组别设置如下：
（1）泳道1（包括SNP1的C等位基因型的生物素标记探针+HEK293UV照射核蛋白抽提物）；
（2）泳道2（括含SNP1的T等位基因型的生物素标记探针＋HEK293UV照射核蛋白抽提物）；
（3）泳道3（包括SNP2的C等位基因型的生物素标记探针＋HEK293核蛋白抽提物）；
（4）泳道4（包括SNP2的T等位基因型的生物素标记探针＋HEK293核蛋白抽提物）（5）泳道5（包括SNP1的C等位基因型的生物素标记探针＋HEK293核蛋白抽提物）；
（6）泳道6（括含SNP1的T等位基因型的生物素标记探针＋HEK293核蛋白抽提物）；
（7）泳道7（包括SNP2的C等位基因型的生物素标记探针＋HEK293UV照射核蛋白抽提物）；
（8）泳道8（包括SNP2的T等位基因型的生物素标记探针＋HEK293UV照射核蛋白抽提物）；
结合反应：在加入生物素标记的探针前，先将其他成分混匀，然后再加入生物素标记的探针，用微量移液器轻轻吹打混匀各成分，在室温状态下孵育30min后上样电泳；
其余操作步骤与对比例2的步骤2.2.2-2.2.4相同；
本实施例增加UV诱导细胞培养后的EMSA实验结果如图5所示，图中C*/T*代表生物素标记探针，NE代表对照组的核蛋白抽提物，UV-NE代表实验组的核蛋白抽提物；根据图5的EMSA实验的4个对比组分别为泳道1和5，泳道2和6，泳道3和7以及泳道4和8观察出，在增加UV条件而发生明显改变的是泳道3和7的条带3，在UV的介导下SNP2的C等位基因结合更多的转录因子蛋白(条带3)；与实施例1所获得的结果一致。
[0018] 通过本发明方法，在验证非编码区SNP的体外功能实验，遇到临近干扰的其他SNP位点时，可以找到最可能具有功能效应的SNP位点，增加了实验结论的可靠性。本发明实验方法操作简单，没有额外的实验经费支出。
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