一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母及构建方法及其应用
阅读：843发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母及构建方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种具有脱毒功能的基因重组酿酒 酵母 ，所述基因重组 酿酒酵母 含有外源性 醛 还原酶基因，所述外源性醛还原酶基因是如SEQ ID NO：1所示序列的醛还原酶基因。所述外源性醛还原酶基因是以树干毕赤酵母(Pichia stipitis)基因组DNA为模板进行PCR扩增，同时在C端和N端分别引入Xho I和Not I两个酶切位点而获得，将GRE2基因 片段 连接到pYES2/NTA质粒载体上，得到重组质粒pYES2/NTA-GRE2，然后转化到酿酒酵母中得到具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母。该酿酒酵母菌不仅可对木质 纤维 素的预处理物料进行高效 发酵 生产 燃料 乙醇 ，同时能够去除发酵过程产生抑制或毒害的醛类物质，实现对木质 纤维素 预处理物料中发酵抑制物的“脱毒”，以保证纤维素发酵产乙醇工艺的顺利和高效。，下面是一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母及构建方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母，其特征在于，所述基因重组酿酒酵母含有外源性醛还原酶基因，所述外源性醛还原酶基因是如SEQ ID NO：1所示序列的醛还原酶基因。
2.根据权利要求1所述的一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母，其特征在于，所述外源性醛还原酶基因是以树干毕赤酵母(Pichia stipitis)基因组DNA为模板进行PCR扩增，同时在C端和N端分别引入Xho I和NotI两个酶切位点而获得，所述树干毕赤酵母已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC 1960。
3.根据权利要求1所述的一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母，其特征在于，酿酒酵母出发菌株为菌株ZR-1，菌株ZR-1分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于
2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.18090，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
4.根据权利要求1所述的一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母，其特征在于，所述具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.17923；于2019年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院
3号。
5.一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取树干毕赤酵母基因组DNA；
S2.以提取的树干毕赤酵母基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增后回收并纯化PCR产物；
S3.从PCR产物上切下目的基因条带，纯化，得到GRE2基因片段；
S4.对GRE2基因片段和pYES2/NTA质粒进行NotI和Xho I双酶切，然后将GRE2基因片段连接到pYES2/NTA质粒载体上，得到新的重组质粒pYES2/NTA-GRE2；
S5.将重组质粒pYES2/NTA-GRE2转化到酿酒酵母中，构建基因重组酿酒酵母。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述引物包括：
上游引物为：
TCGCGGCCGCATGACCTCCGTTTTCGTATCAGGTGCCACCGGCT TTAT；下划线为NotI酶切位点；
下游引物为：
TCCTCGAGCCTTGATTCGGCATTTGGACCTAGACCCATTATTTT；
下划线为XhoI酶切位点。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，采用刀片从PCR产物上切下目的基因条带，并用缓冲液溶化、吸附柱吸附、离心、超纯水解吸、离心，得到纯化的GRE2基因片段。
8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中，采用Gibson连接方法将GRE2基因连接到pYES2/NTA载体上，得到新的重组质粒。
9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S5的转化过程包括：向酿酒酵母的菌悬液中加入重组质粒pYES2/NTA-GRE2，混匀后冰浴，转入已预冷的电转杯中，采用
1500V电击，得到转化子；
所述步骤S5还包括：通过挑取酿酒酵母的单克隆转化子进行培养并提取质粒，以NotI和Xho I酶对提取的质粒进行双酶切和凝胶电泳，验证重组质粒是否成功转化到酿酒酵母中。
10.一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母(保藏编号为CGMCCNo.17923)在木质纤维素发酵制乙醇中的应用。
一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母及构建方法及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 随着石油资源日趋短缺、储量日益下降，利用农业秸秆为原料发酵生产燃料乙醇及各种化工产品，以满足人类社会发展需求，被认为是一个可代替石油的清洁化能源。专家认为以农作物秸秆为代表的木质纤维素类生物质生产乙醇有良好的发展前景，同时有助于解决农业生产废弃物的处理问题，这样不仅缓解了资源危机和粮食危机，对环境污染也有很重要的意义，更为可持续发展提供了保证。
[0003] 木质纤维素(lignocellulose)是自然界可再生获得的最丰富资源，蕴含着巨大的生物质能。利用木质纤维素生产乙醇主要经过物料预处理、酶解糖化、发酵和精馏等过程。其中，物料预处理工艺主要以水热分解、蒸汽爆破、酸[Almeida JRM，Modig T，Petersson A，Hahn-Hagerdal B，Liden G，GorwaGrauslund MF.Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae.J Chem Technol Biotechnol.2007，82：340-349]或碱[Saha BC，Cotta MA.Comparison of pretreatment strategies for enzymatic saccharification and fermentation of barley straw to ethanol.New Biotechnol.2010，27：10-15.]水解为主，这些方法在木质纤维素预处理过程中都或多或少地生成糠醛、羟甲基糠醛、酚类和有机酸等有毒物质，这些物质对酶解和乙醇发酵都会产生抑制，造成酶解不充分和发酵不完全，从而制约纤维素乙醇及相关产业的发展。
[0004] 因此，有效脱除预处理物料中所含的抑制物，即“脱毒”是改善酶解和发酵性能的必需步骤。目前，对预处理后物料进行脱毒方式通常划分为三种类型，分别是物理法、化学法和生物法。主要的理化方法包括：旋转蒸发[Llano T，Quijorna N，Coz A.Detoxification of a lignocellulosic waste from a pulp mill to enhance its fermentation prospects.Energies，2017，10(3)：348.]、过滤、活性碳吸附[李允超，王贤华，杨海平，等.竹炭表面结构及其对糠醛的吸附特性[J].农业工程学报，2012，28(12)：257-263.]、过量的碱性试剂[Alriksson B，Horváth I S， A，et al.Ammonium hydroxide detoxification of spruce acid hydrolysates.Applied Biochemistry Biotechnology，2005，124(1-3)：911-922.]、大孔树脂吸附[焦磊.糠醛废液净化及其稀酸糖蜜发酵酒精的研究[D].南宁：广西大学，2014.]、离子交换[Alriksson B，Cavka A，L J.Improving the fermentability of enzymatic hydrolysates of
lignocellulose through chemical in-situ detoxification with reducing agents.Bioresource Technology，2011，102(2)：1254-1263.]或是将这些方法组合使用。
但是，理化脱毒方法有其难以克服的缺点：单一方法不能除去理化性质不同的抑制物；联合运用多种理化手段则大幅度提高脱毒成本，复杂的脱毒工艺在生产上变得不可行；一些理化脱毒手段还会产生新的污染物。
lignocellulose through chemical in-situ detoxification with reducing agents.Bioresource Technology，2011，102(2)：1254-1263.]或是将这些方法组合使用。
但是，理化脱毒方法有其难以克服的缺点：单一方法不能除去理化性质不同的抑制物；联合运用多种理化手段则大幅度提高脱毒成本，复杂的脱毒工艺在生产上变得不可行；一些理化脱毒手段还会产生新的污染物。
[0005] 生物法主要是利用微生物或酶去降解消除抑制物。包括三个方面：一是在发酵前添加能降解抑制物的外源微生物；二是对发酵微生物进行选育驯化，包括运用基因工程技术，对发酵微生物进行基因重组，提高对抑制物的耐受性，甚至具有降解抑制物的能力；三是添加生物酶进行脱毒处理。Nichols等研究了玉米秸秆稀酸水解液中接种真菌Coniochaeta ligniaria NRRL30616，对培养后的水解液中成分定量分析，发现多种芳香族化合物、脂肪酸、糠醛等抑制物都显著降低，优化了乙醇发酵过程中对木糖的利用能力[Nichols N N，Sharma L N，Mowery R A，et al.Fungal metabolism of fermentation inhibitors present in corn stover dilute acid hydrolysate.Enzyme Microbial Technology，2008，42(7)：624-630.]。Saravanakumar T等通过将漆酶固定在纳米纤维上，40℃反应36h能够完全脱除木质纤维素水解产物中的糠醛、乙酰丁香酮和松柏醛。上述研究对于与处理过程中产生的副产物的脱除具有很好的借鉴作用[Saravanakumar T，Park H S，Mo A Y，et al.Detoxification of furanic and phenolic lignocellulose derived inhibitors of yeast using laccase immobilized on bacterial cellulosic nanofibers[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic，2016，134：196-205.]。
[0006] 近些年来，人们针对具有“脱毒”能力的微生物进行了广泛的研究。研究发现，一些酵母菌株具有良好的脱毒能力。在实际工业生产中，人们也已经开始利用酵母菌为工程菌株对木质纤维素进行发酵生产燃料乙醇研究。但目前尚未获得一种既可对木质纤维素预处理产生的抑制物实现有效脱除，又能高效发酵木质纤维素生物质生产燃料乙醇的菌株。
[0007] 本实验室前期通过菌种筛选改造技术得到了一株能够高效利用木糖的酿酒酵母菌株ZR-1，菌株ZR-1分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.18090，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。但是，该菌种在发酵木质纤维素水解液时，木糖利用率很低，主要原因是水解液中的各种抑制物抑制了该菌株对木糖的利用。本研究通过将具有“脱毒”功能的外源基因GRE2导入到ZR-1菌种中，使其具有抑制物耐受性，以达到能够高效利用水解液中木糖的目的。
发明内容
[0008] (一)要解决的技术问题
[0009] 为了解决现有技术的上述问题，本发明的目的是提供一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母的构建方法，具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母和其应用。
[0010] (二)技术方案
[0011] 为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
[0012] 一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母，所述基因重组酿酒酵母含有外源性醛还原酶基因，所述外源性醛还原酶基因是如SEQ ID NO：1所示序列的醛还原酶基因。
[0013] 优选地，所述外源性醛还原酶基因是以树干毕赤酵母(Pichia stipitis)基因组DNA为模板进行PCR扩增，同时在C端和N端分别引入Xho I和Not I两个酶切位点而获得，所述树干毕赤酵母已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC 1960。
[0014] 本发明的酿酒酵母出发菌株为菌株ZR-1，菌株ZR-1分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.18090，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0015] 本发明的具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.17923；于2019年06月13保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0016] 本发明还涉及一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母的构建方法，其包括如下步骤：
[0017] S1.提取树干毕赤酵母基因组DNA；
[0018] S2.以提取的树干毕赤酵母基因组DNA为模版，设计引物进行PCR扩增，扩增后回收并纯化PCR产物；
[0019] S3.从PCR产物上切下目的基因条带，纯化，得到GRE2基因片段；
[0020] S4.对GRE2基因片段和pYES2/NTA质粒进行Not I和Xho I双酶切，然后将GRE2基因片段连接到pYES2/NTA载体上，得到新的重组质粒pYES2/NTA-GRE2；
[0021] S5.将重组质粒pYES2/NTA-GRE2转化到酿酒酵母中，构建基因重组酿酒酵母。
[0022] 优选地，所述步骤S2中，所述引物包括：
[0023] 上游引物为：
[0024] TCGCGGCCGCATGACCTCCGTTTTCGTATCAGGTGCCACCGGCTTTAT；下划线为Not I酶切位点；
[0025] 下游引物为：
[0026] TCCTCGAGCCTTGATTCGGCATTTGGACCTAGACCCATTATTTT；下划线为Xho I酶切位点。
[0027] 优选地，所述步骤S3中，采用刀片从PCR产物上切下目的基因条带，并用缓冲液溶化、吸附柱吸附、离心、超纯水解吸、离心，得到纯化的GRE2基因片段。
[0028] 优选地，所述步骤S4中，采用Gibson连接方法将GRE2基因连接到pYES2/NTA载体上，得到新的重组质粒。
[0029] 优选地，所述步骤S5的转化过程包括：向酿酒酵母的菌悬液中加入重组质粒pYES2/NTA-GRE2，混匀后冰浴，转入已预冷的电转杯中，采用1500V电击，得到转化子。
[0030] 优选地，所述步骤S5还包括：通过挑取酿酒酵母的单克隆转化子进行培养并提取质粒，以Not I和Xho I酶对提取的质粒进行双酶切和凝胶电泳，验证重组质粒是否成功转化到酿酒酵母中。
[0031] 本发明还涉及一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母在木质纤维素发酵制乙醇中的应用。
[0032] 实验证明，所述具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母，在以糠醛和羟甲基糠醛作为底物，以NADPH为辅酶进行诱导表达时，可产生大量的醛还原酶。因此，所述具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母可将应用于木质纤维素发酵制乙醇工艺生产中，不但能高效发酵木质纤维素的预处理物料生产燃料乙醇，同时还具有去除预处理物料中糠醛、羟甲基糠醛等对乙醇发酵有毒害作用的醛类有机物，以保证纤维素发酵更加彻底、发酵工艺更高效。
[0033] (三)有益效果
[0034] 本发明的有益效果是：
[0035] 通过向酿酒酵母转入GRE2醛还原酶基因(1151bp)得到一种具有醛还原功能的基因重组酿酒酵母，该酿酒酵母菌不仅可对木质纤维素的预处理物料进行高效发酵生产燃料乙醇，同时还可以在具有糠醛和羟甲基糠醛压力条件下，使酿酒酵母中的GRE2基因得以表达产生大量醛还原酶，使原本对发酵过程产生抑制或毒害的糠醛和羟甲基糠醛等有机醛被还原转化成其他对发酵无毒害的物质(实现脱毒)，以保证纤维素发酵产乙醇工艺的顺利和高效进行。附图说明
[0036] 图1为树干毕赤酵母基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为maker条带，1、2为树干毕赤酵母基因组DNA条带。
[0037] 图2为GRE2醛还原酶基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为maker条带，1为GRE2基因条带。
[0038] 图3为重组质粒pYES2/NTA-GRE2已转化到大肠杆菌T1感受态细胞的菌液PCR琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为maker条带，1-5为GRE2基因条带，说明重组质粒pYES2/NTA-GRE2能够转化到细菌宿主中。
[0039] 图4为对重组质粒pYES2/NTA-GRE2已转化到酿酒酵母的转化子提取质粒进行双酶切的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为maker条带，1-5为质粒双酶切条带。
[0040] 图5为含有GRE2基因的酿酒酵母在以糠醛和羟甲基糠醛作为底物，以NADPH为辅酶进行诱导表达时，GRE2酶(醛还原酶)的SDS-PAGE凝胶电泳图；其中：M为maker条带，1为基因重组酿酒酵母表达的蛋白条带。
具体实施方式
[0041] 为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
[0042] 为了得到一种具有脱毒功能的基因重组酿酒酵母，可按照如下方法进行：
[0043] (一)提取树干毕赤酵母基因组DNA
[0044] 采用索莱宝公司的酵母基因组DNA提取试剂盒提取树干毕赤酵母基因组DNA，提取完成后用1％的琼脂糖凝胶电泳验证，具体操作步骤如下：
[0045] (1)取酵母细胞1-5ml，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。
[0046] (2)向酵母菌体中加入470ul山梨醇Buffer。充分悬浮菌体，加入25ul酵母破壁酶和5ul巯基还原剂，充分混匀。30℃处理1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。
[0047] (3)12000rpm离心1min，弃上清，收集沉淀。
[0048] (4)向沉淀中加入200ul溶液A，充分悬浮沉淀，向悬浮液中加入20ul的RNaseA(10mg/ml)，充分颠倒混匀，室温放置10min。
[0049] (5)加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分颠倒混匀。65℃水浴消化15-30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。
[0050] (6)加入200ul溶液B，再加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，室温放置2min。
[0051] (7)12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
[0052] (8)向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)。12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
[0053] (9)向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
[0054] (10)12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。
[0055] (11)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。
[0056] (12)离心所得洗脱液再加入吸附柱中，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。
[0057] 如图1所示，树干毕赤酵母基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为maker条带，1、2为树干毕赤酵母基因组DNA条带。
[0058] (二)以毕赤酵母基因组DNA为模板进行PCR扩增
[0059] 以提取的树干毕赤酵母基因组DNA为模板，设计引物进行PCR，通过跑1％琼脂糖凝胶验证。
[0060] 上游(N端)引物GRE2-F：
[0061] TCGCGGCCGCATGACCTCCGTTTTCGTATCAGGTGCCACCGGCTTTAT(下划线为Not I酶切位点)
[0062] 下游(C端)引物GRE2-R：
[0063] TCCTCGAGCCTTGATTCGGCATTTGGACCTAGACCCATTATTTT(下划线为Xho I酶切位点)[0064] PCR反应体系：DNA mix 10L，上、下游引物(10ng/L)各0.4 1，DNA模版(10ng/L)0.2 1，DMSO 0.8L，灭菌水8.2L，总体积为20L。
[0065] PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，50℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存。反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳。
[0066] 如图2所示，GRE2醛还原酶基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为maker条带，1为GRE2基因条带。
[0068]
[0069]
[0070] (三)PCR产物回收、切胶及纯化
[0071] 采用NEB公司DNA Gel Extraction Kit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按照步骤(二)中得到图2的方式进行电泳，然后切胶，具体操作步骤为：
[0072] (1)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5mL离心管中，称量其重量，加入等重量的Binding Buffer，放于65℃水浴中至胶完全溶化；
[0073] (2)将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心1min；
[0074] (3)将离心下来的收集管中的液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
[0075] (4)向吸附柱中加入700L SPW Wash Buffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；
[0076] (5)将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min；
[0077] (6)向空吸附柱中加入30L超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min；
[0078] (7)离心管中的溶液即为含有模板基因条带的DNA片段的水溶液；
[0079] (8)取3L进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
[0080] (四)GRE2基因、pYES2/NTA质粒酶切和构建重组质粒
[0081] 对PCR扩增得到的GRE2基因片段和pYES2/NTA质粒(购自淼灵质粒平台，货号：P1680)进行Not I和Xho I双酶切，然后采用Gibson连接方法将GRE2基因连接到pYES2/NTA载体上，得到新的重组质粒pYES2/NTA-GRE2。
[0082] 双酶切体系：Not I和Xho I酶各1.5L，cut smart Buffer 5L，DNA 2g(依浓度计算)水补齐至50L，37℃，3h。
[0083] Gibson连接体系：酶6L，载体和片段共4L，比例为1∶3～5，金属浴50℃，1h。
[0084] (五)将重组质粒pYES2/NTA-GRE2转化到大肠杆菌T1中
[0085] 将上一步中的10L连接产物与100L的大肠杆菌T1感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s，立即重置于冰上3-5min，再加入800LLB液体培养基，37℃培养50-60min；涂布于LB固体平板(含10g/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。
[0086] (六)菌液PCR初步鉴定
[0087] 用移液抢挑取转化子单克隆至LB液体培养基中培养6-8h后，进行菌液PCR。
[0088] 上游引物F：5′-ATGTCAGTTTTCGTTTCAGG-3′
[0089] 下游引物R：5′-TTATATTCTGCCCTCAAATT-3′
[0090] 菌液PCR体系：酶5L，上、下游引物各0.5L，菌液0.5L，灭菌水3.5L总体积为10L。
[0091] 菌液PCR过程：预变性94℃ 10min，变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 2min，再延伸72℃ 10min，30个循环，4℃保存。反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳检测验证，验证正确的菌落。
[0092] 如图3所示为重组质粒pYES2/NTA-GRE2已转化到大肠杆菌T1感受态细胞的菌液PCR琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为maker条带，1-5为GRE2基因条带。由图3可知，通过菌液PCR验证已存在GRE2基因条带，说明重组质粒成功转化到大肠杆菌T1感受态细胞中。
[0093] (七)重组质粒DNA测序
[0094] 将菌落PCR鉴定为阳性克隆的转化子进行5mLLB液体试管培养12-16h，并送往擎科生物(北京)股份有限公司进行DNA测序；将测序后获得的序列用DNAMAN软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性。测序结果表明，所获得的DNA片段含有醛还原酶编码区基因，说明重组质粒构建成功。
[0095] (八)pYES2/NTA-GRE2重组质粒的提取
[0096] 采用NEB公司Plamid Miniprep Kit试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：
[0097] (1)将验证正确的含有pYES2/NTA-GRE2质粒的大肠杆菌T1接种到到5mL含有氨苄青霉素(100g/mL)的液体LB培养基中，振荡培养10h左右；
[0098] (2)取出菌液加到1.5mL离心管中，常温，12000rpm离心1min，弃尽上清；
[0099] (3)加入250L溶液I，吹打混匀；加入250L溶液II，上下轻轻颠倒数次，混匀，常温静置2min；
[0100] (4)加入350L溶液III，上下轻轻颠倒数次，使裂解物分散均匀，常温静置2min，常温12000rpm离心10min；
[0101] (5)转移上清至吸附柱中，静置5min，常温，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
[0102] (6)加入700L DNA Wash Buffer到吸附柱中，常温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；
[0103] (7)然后将空吸附柱于12000rpm离心2min，室温晾干15min；
[0104] (8)向空吸附柱中加入30L超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min；离心管中的溶液即为质粒DNA水溶液；
[0105] (9)取3L进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置出现明显条带，将剩余DNA样品于-20℃贮存。
[0106] 由此，验证了重组质粒pYES2/NTA-GRE2具有转化到宿主细胞中的能力。
[0107] (九)重组质粒电击转化到酿酒酵母中
[0108] 该酿酒酵母出发菌株为菌株ZR-1，菌株ZR-1分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.18090，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0109] 重组质粒转化至酿酒酵母的方法如下：
[0110] (1)接种酿酒酵母酵母至30mL YPD液体培养基，30℃培养12h；
[0111] (2)取培养物以1％的接种量转接到30mL新鲜YPD液体培养基中，30℃培养8h，使菌体达到同步生长状态；
[0112] (3)将酵母培养物置于冰上放置30min后，6000rpm离心5min收集菌体；
[0113] (4)弃上清，加入已预冷的15mL超纯水洗涤菌体一次；
[0114] (5)6000rpm离心5min收集菌体，用15mL 1mol/L山梨醇重复洗涤菌体三次；
[0115] (6)离心收集菌体，加入200L 1mol/L山梨醇重悬浮菌体，取200L的菌悬液至1.5mL离心管中；
[0116] (7)在制得的菌悬液中加入20L(≤5g)待转化的重组质粒，轻轻混匀后冰浴10min；
[0117] (8)将冰浴后的菌悬液转入已预冷的电转杯中，1500V电击5ms；
[0118] (9)加入适量体积的1mol/L山梨醇将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，取200L涂布相应的抗性平板；
[0119] (10)30℃培养3-5天挑选转化子。
[0120] (十)提取酿酒酵母重组质粒用于验证
[0121] 挑取(九)中的单克隆转化子进行培养，并提取质粒，方法如下：
[0122] (1)取1-5ml酵母培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。
[0123] (2)向酵母菌体中加入470ul山梨醇Buffer，充分悬浮菌体，加入25ul酵母破壁酶和5ul巯基还原剂，充分混匀，30℃处理1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm离心1min，弃上清，收集沉淀。向沉淀中加入250ulYP1(请先检查是否已加入RNaseA)，充分悬浮沉淀。
[0124] (3)向离心管中加入250ul YP2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
[0125] (4)向离心管中加入350ul YP3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
[0126] (5)将上一步所得上清液加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0127] (6)向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
[0128] (7)向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
[0129] (8)12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟。
[0130] (9)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。
[0131] (10)为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
[0132] (十一)重组质粒的双酶切验证
[0133] 以NotI和XhoI酶对提取的重组质粒进行双酶切验证，1％琼脂糖凝胶电泳验证。
[0134] 双酶切体系：Not I和Xho I酶各1.5L，cut smart Buffer 5L，DNA 2g(依浓度计算)水补齐至50L，37℃，3h。电泳结果如图4所示。
[0135] 图4为对重组质粒pYES2/NTA-GRE2已转化到酿酒酵母的转化子提取质粒进行双酶切的琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为maker条带，1-5为质粒双酶切条带。由图4可知，对提取的重组质粒进行双酶切并跑胶(电泳)验证，1-5均存在两条特异性条带，说明重组质粒构建成功，并成功转化到了酿酒酵母中。
[0136] (十二)基因重组酿酒酵母中GRE2基因的表达与验证
[0137] 以糠醛和羟甲基糠醛作为底物，以NADPH为辅酶进行诱导表达，并以野生型菌株作为对照，酶活力结果如下表：
[0138] 表1.不同抑制物诱导下对照菌株与重组菌株的GRE2酶活力比较
[0139]
[0140] 图5所示为对基因重组酿酒酵母在前述环境下产生的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳实验结果。GRE2醛还原酶(蛋白)的分子量大小为42kDa。如图所示，在略大于40kDa的附近出现明显条带，说明有大量GRE2酶产生，基因重组酿酒酵母中所含GRE2基因可良好表达。
[0141] (十三)基因重组酿酒酵母对纤维素水解液中木糖利用的验证
[0142] 以酿酒酵母出发菌株为对照菌株，验证基因重组菌株对稀酸预处理水解液中木糖的利用情况，结果如下：
[0143] 表2.对照菌株与重组菌株对水解液中木糖利用情况比较
[0144]
[0145]
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