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一种从衣藻提取油脂的方法

阅读：245发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种从衣藻提取油脂的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种从衣藻提取油脂的方法包括衣藻的培养、干微藻粉的制备和油脂的提取，本发明衣藻在红蓝光的相互作用下使得衣藻中油脂的积累显著升高，且蓝光占比越高，油脂积累越多，红蓝光（1:2）下油脂的积累量最高，该油脂可以制备品质较好的生物柴油，有较好的市场应用价值。，下面是一种从衣藻提取油脂的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种从衣藻提取油脂的方法，其特征在于：所述的从衣藻提取油脂的方法包括以下步骤：
步骤1：衣藻的培养：将活化后的培养至对数生长期的新鲜微藻培养液，按照10%(v/v)的接种量接种到含有新鲜配制的微藻培养基的三角烧瓶中中，用4层纱布包裹瓶口，将所述的三角烧瓶放置于光照培养箱中进行培养；
步骤2：干微藻粉的制备：计量步骤1中培养好的衣藻培养液的体积，置于离心管中第一次离心得到第一衣藻藻体沉淀和第一上清液，弃去所述的第一上清液；用蒸馏水清洗所述的第一衣藻藻体沉淀，进行第二次离心得到第二衣藻藻体沉淀和第二上清液，收集所述的第二衣藻藻体沉淀，将所述的第二衣藻藻体沉淀置于65℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，记录第二衣藻藻体沉淀干重即得所述的干微藻粉，计算干微藻粉的生物量如下：
步骤3：油脂的提取：将步骤2制备得到的干微藻粉准确称取100mg干藻粉中加入盐酸振荡混匀后，室温下放置20 40min，随后置于沸水浴中5 15min，立刻转入-100 -60℃冷冻10~ ~ ~ ~
30min，如此反复冻融3次；然后加入2倍体积的三氯甲烷和甲醇的混合液，混合均匀后离心，所述干微藻粉的油脂溶解于下层的三氯甲烷中，用移液枪吸取下层含有油脂的三氯甲烷层，将有含有油脂的三氯甲烷烘干后即得油脂，称重，计算油脂含量和油脂产量，计算公式如下：
2.根据权利要求1所述的一种从衣藻提取油脂的方法，其特征在于：步骤1中每1L所述的微藻培养基中含有NaNO30.25g、K2HPO4·3H2O0.075g 、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl2·
2H2O0.025g、KH2PO40.175g、NaCl0.025g、土壤提取液40mL 、FeCl3•6H2O0.005g、Fe-EDTA1mL。
3.根据权利要求1所述的一种从衣藻提取油脂的方法，其特征在于：所述的步骤1中所述的培养条件为：光照强度为80 120μmol·m-2·s-1，光暗周期为（14 18）h：（6 10）h，20 30~ ~ ~ ~
℃恒温培养，培养10 18d。
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4.根据权利要求3所述的一种从衣藻提取油脂的方法，其特征在于：所述的光照的光质为红光和蓝光，所述的红光和蓝光组合比例为（1 3）：（1 3）。
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5.根据权利要求1所述的一种从衣藻提取油脂的方法，其特征在于：所述的步骤2中的第一次离心和第二次离心的的转速均为4000 6000r/min，离心时间为5 15mi。
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6.根据权利要求1所述的一种从衣藻提取油脂的方法，其特征在于：所述的步骤3中盐酸的物质的量浓度为3 5mol/L，所述的干微藻粉的重量和盐酸的体积之比为100mg：（4 8）~ ~
mL。
7.根据权利要求1所述的一种从衣藻提取油脂的方法，其特征在于：所述的步骤3中的三氯甲烷和甲醇的体积比为1：（0.8 1.2）。
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8.根据权利要求1所述的一种从衣藻提取油脂的方法，其特征在于：所述的步骤3中第三次离心的转速为6000 10000r/min，所述的第三次离心的时间为3 6min。
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说明书全文

一种从衣藻提取油脂的方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物培养技术领域，特别涉及一种从衣藻提取油脂的方法。

背景技术

[0002] 全球能源的供应主要依靠石油、天然气和煤炭等化石资源，随着经济的不断发展，化石能源的需求和消耗增长迅速，能源危机已成为全球性问题，发展可替代能源迫在眉睫。此外，化石能源燃烧后排放的大量污染物，会对人类健康和环境造成恶劣影响。生物柴油相对化石能源具有闪点高、运动粘度高、环境污染小、可再生等优点，是非常有潜力的替代能源。微藻因具有光合效率高、生产周期短、油脂含量高、不受季节和气候限制等优点，已成为生产生物柴油最有潜力的原料之一，以微藻制备生物柴油已经成为当前的研究热点。另外，微藻油脂在食品、保健品、医药和化妆品等领域也有广泛应用。光照是影响微藻细胞生长发育及细胞生化成分的重要环境因子之一，它会影响微藻的生长发育、光合作用、细胞形态和代谢产物的合成等。光照主要从光质、光强度和光周期等几个方面影响藻类的生长。因为光强度和光周期更容易进行调节，之前有关光影响微藻油脂积累的研究主要集中在光强和光周期，而不同光质对微藻油脂积累影响的研究较少。

[0003] Sun等研究发现当光强从50 μmol·m-2·s-1增加到 200 μmol·m-2·s-1时，Neoohloris oleoabundans 的生物量、脂肪酸含量显著升高。Solovchenko等研究发现高光强能显著提高Parietochlorisincisa总脂肪酸中C20:4的相对含量。Abomohra 等研究发现Scenedesmus obliquus在红光下生物量最高，蓝光下油脂产率最高，蓝红光下微藻的生长和油脂的生产显著提高。陈爱玲研究发现红光和白光能促进类波氏真眼点藻总脂的积累，而蓝光会明显抑制总脂的积累。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术的不足，本发明的采用红蓝光复合的方式进行照射，从而提高衣藻中油脂的含量，本发明的内容如下：本发明的目的在于提供一种从衣藻提取油脂的方法，其技术点在于：所述的从衣藻提取油脂的方法包括以下步骤：
步骤1：衣藻的培养：将活化后的培养至对数生长期的新鲜微藻培养液，按照10%(v/v)的接种量接种到含有新鲜配制的微藻培养基的三角烧瓶中中，用4层纱布包裹瓶口，将所述的三角烧瓶放置于光照培养箱中进行培养；
步骤2：干微藻粉的制备：计量步骤1中培养好的衣藻培养液的体积，置于离心管中第一次离心得到第一衣藻藻体沉淀和第一上清液，弃去所述的第一上清液；用蒸馏水清洗所述的第一衣藻藻体沉淀，进行第二次离心得到第二衣藻藻体沉淀和第二上清液，收集所述的第二衣藻藻体沉淀，将所述的第二衣藻藻体沉淀置于65℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，记录第二衣藻藻体沉淀干重即得所述的干微藻粉，计算干微藻粉的生物量如下：
步骤3：油脂的提取：将步骤2制备得到的干微藻粉准确称取100mg干藻粉中加入盐酸振荡混匀后，室温下放置20 40min，随后置于沸水浴中5 15min，立刻转入-100 -60℃冷冻10~ ~ ~ ~
30min，如此反复冻融3次；然后加入2倍体积的三氯甲烷和甲醇的混合液，混合均匀后离心，所述干微藻粉的油脂溶解于下层的三氯甲烷中，用移液枪吸取下层含有油脂的三氯甲烷层，将有含有油脂的三氯甲烷烘干后即得油脂，称重，计算油脂含量和油脂产量，计算公式如下：
在本发明的有的实施例中，步骤1中每1L所述的微藻培养基中含有NaNO30.25g、K2HPO4·3H2O0.075g 、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl2·2H2O0.025g、KH2PO40.175g、NaCl0.025g、土壤提取液40mL 、FeCl3•6H2O0.005g、Fe-EDTA1mL。

[0005] 在本发明的有的实施例中，所述的步骤1中所述的培养条件为：光照强度为80 120~μmol·m-2·s-1，光暗周期为（14 18）h：（6 10）h，20 30℃恒温培养，培养10 18d。
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[0006] 在本发明的有的实施例中，所述的光照的光质为红光和蓝光，所述的红光和蓝光组合比例为（1 3）：（1 3）。~ ~

[0007] 在本发明的有的实施例中，所述的步骤2中的第一次离心和第二次离心的的转速均为4000 6000r/min，离心时间为5 15min。~ ~

[0008] 在本发明的有的实施例中，所述的步骤3中盐酸的物质的量浓度为3 5mol/L，所述~的干微藻粉的重量和盐酸的体积之比为100mg：（4 8）mL。
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[0009] 在本发明的有的实施例中，所述的步骤3中的三氯甲烷和甲醇的体积比为1：（0.8~1.2）。

[0010] 在本发明的有的实施例中，所述的步骤3中第三次离心的转速为6000 10000r/~min，所述的第三次离心的时间为3 6min。
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[0011] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的一种从衣藻提取油脂的方法包括衣藻的培养、干微藻粉的制备和油脂的提取，本发明衣藻在红蓝光的相互作用下使得衣藻中油脂的积累显著升高，且蓝光占比越高，油脂积累越多，红蓝光（1:2）下油脂的积累量最高，该油脂可以制备品质较好的生物柴油，有较好的市场应用价值。

具体实施方式

[0012] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0013] 实施例1一种从衣藻提取油脂的方法包括以下步骤：
步骤1：衣藻的培养：将活化后的培养至对数生长期的新鲜微藻培养液，按照10%(v/v)的接种量接种到含有新鲜配制的微藻培养基的三角烧瓶中中，用4层纱布包裹瓶口，将所述的三角烧瓶放置于光照培养箱中进行培养；
步骤2：干微藻粉的制备：计量步骤1中培养好的衣藻培养液的体积，置于离心管中第一次离心得到第一衣藻藻体沉淀和第一上清液，弃去所述的第一上清液；用蒸馏水清洗所述的第一衣藻藻体沉淀，进行第二次离心得到第二衣藻藻体沉淀和第二上清液，收集所述的第二衣藻藻体沉淀，将所述的第二衣藻藻体沉淀置于65℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，记录第二衣藻藻体沉淀干重即得所述的干微藻粉，计算干微藻粉的生物量如下：
步骤3：油脂的提取：将步骤2制备得到的干微藻粉准确称取100mg干藻粉中加入盐酸振荡混匀后，室温下放置30min，随后置于沸水浴中10min，立刻转入-80℃冷冻20min，如此反复冻融3次；然后加入2倍体积的三氯甲烷和甲醇的混合液，混合均匀后离心，所述干微藻粉的油脂溶解于下层的三氯甲烷中，用移液枪吸取下层含有油脂的三氯甲烷层，将有含有油脂的三氯甲烷烘干后即得油脂，称重，计算油脂含量和油脂产量，计算公式如下：
其中，步骤1中每1L所述的微藻培养基中含有NaNO30.25g、K2HPO4·3H2O0.075g 、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl2·2H2O0.025g、KH2PO40.175g、NaCl0.025g、土壤提取液40mL 、FeCl3•6H2O0.005g、Fe-EDTA1mL。

[0014] 其中，步骤1中所述的培养条件为：光照强度为100μmol·m-2·s-1，光暗周期为16：8h，25℃恒温培养，培养14d。

[0015] 其中，光照的光质为红光和蓝光，所述的红光和蓝光组合比例为1：1。

[0016] 其中，步骤2中的第一次离心和第二次离心的的转速均为5000r/min，离心时间为10min。

[0017] 其中，步骤3中盐酸的物质的量浓度为4mol/L，所述的干微藻粉的重量和盐酸的体积之比为100mg：6mL。

[0018] 其中，步骤3中的三氯甲烷和甲醇的体积比为1：1。

[0019] 其中，步骤3中第三次离心的转速为8000r/min，所述的第三次离心的时间为4min。

[0020] 实施例2一种从衣藻提取油脂的方法包括以下步骤：
步骤1：衣藻的培养：将活化后的培养至对数生长期的新鲜微藻培养液，按照10%(v/v)的接种量接种到含有新鲜配制的微藻培养基的三角烧瓶中中，用4层纱布包裹瓶口，将所述的三角烧瓶放置于光照培养箱中进行培养；
步骤2：干微藻粉的制备：计量步骤1中培养好的衣藻培养液的体积，置于离心管中第一次离心得到第一衣藻藻体沉淀和第一上清液，弃去所述的第一上清液；用蒸馏水清洗所述的第一衣藻藻体沉淀，进行第二次离心得到第二衣藻藻体沉淀和第二上清液，收集所述的第二衣藻藻体沉淀，将所述的第二衣藻藻体沉淀置于65℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，记录第二衣藻藻体沉淀干重即得所述的干微藻粉，计算干微藻粉的生物量如下：
步骤3：油脂的提取：将步骤2制备得到的干微藻粉准确称取100mg干藻粉中加入盐酸振荡混匀后，室温下放置20min，随后置于沸水浴中5min，立刻转入-100℃冷冻10min，如此反复冻融3次；然后加入2倍体积的三氯甲烷和甲醇的混合液，混合均匀后离心，所述干微藻粉的油脂溶解于下层的三氯甲烷中，用移液枪吸取下层含有油脂的三氯甲烷层，将有含有油脂的三氯甲烷烘干后即得油脂，称重，计算油脂含量和油脂产量，计算公式如下：
其中，步骤1中每1L所述的微藻培养基中含有NaNO30.25g、K2HPO4·3H2O0.075g 、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl2·2H2O0.025g、KH2PO40.175g、NaCl0.025g、土壤提取液40mL 、FeCl3•6H2O0.005g、Fe-EDTA1mL。

[0021] 其中，步骤1中所述的培养条件为：光照强度为80 120μmol·m-2·s-1，光暗周期为~14：10h，20℃恒温培养，培养10 18d。
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[0022] 其中，光照的光质为红光和蓝光，所述的红光和蓝光组合比例为1：2。

[0023] 其中，步骤2中的第一次离心和第二次离心的的转速均为4000r/min，离心时间为15min。

[0024] 其中，步骤3中盐酸的物质的量浓度为3mol/L，所述的干微藻粉的重量和盐酸的体积之比为100mg：8mL。

[0025] 其中，步骤3中的三氯甲烷和甲醇的体积比为1：0.8。

[0026] 其中，步骤3中第三次离心的转速为6000r/min，所述的第三次离心的时间为6min。

[0027] 实施例3一种从衣藻提取油脂的方法包括以下步骤：
步骤1：衣藻的培养：将活化后的培养至对数生长期的新鲜微藻培养液，按照10%(v/v)的接种量接种到含有新鲜配制的微藻培养基的三角烧瓶中中，用4层纱布包裹瓶口，将所述的三角烧瓶放置于光照培养箱中进行培养；
步骤2：干微藻粉的制备：计量步骤1中培养好的衣藻培养液的体积，置于离心管中第一次离心得到第一衣藻藻体沉淀和第一上清液，弃去所述的第一上清液；用蒸馏水清洗所述的第一衣藻藻体沉淀，进行第二次离心得到第二衣藻藻体沉淀和第二上清液，收集所述的第二衣藻藻体沉淀，将所述的第二衣藻藻体沉淀置于65℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，记录第二衣藻藻体沉淀干重即得所述的干微藻粉，计算干微藻粉的生物量如下：
步骤3：油脂的提取：将步骤2制备得到的干微藻粉准确称取100mg干藻粉中加入盐酸振荡混匀后，室温下放置40min，随后置于沸水浴中15min，立刻转入-60℃冷冻30min，如此反复冻融3次；然后加入2倍体积的三氯甲烷和甲醇的混合液，混合均匀后离心，所述干微藻粉的油脂溶解于下层的三氯甲烷中，用移液枪吸取下层含有油脂的三氯甲烷层，将有含有油脂的三氯甲烷烘干后即得油脂，称重，计算油脂含量和油脂产量，计算公式如下：
其中，步骤1中每1L所述的微藻培养基中含有NaNO30.25g、K2HPO4·3H2O0.075g 、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl2·2H2O0.025g、KH2PO40.175g、NaCl0.025g、土壤提取液40mL 、FeCl3•6H2O0.005g、Fe-EDTA1mL。

[0028] 其中，步骤1中所述的培养条件为：光照强度为80 120μmol·m-2·s-1，光暗周期为~18h：6h，30℃恒温培养，培养18d。

[0029] 其中，光照的光质为红光和蓝光，所述的红光和蓝光组合比例为1：3。

[0030] 其中，步骤2中的第一次离心和第二次离心的的转速均为6000r/min，离心时间为5min。

[0031] 其中，步骤3中盐酸的物质的量浓度为5mol/L，所述的干微藻粉的重量和盐酸的体积之比为100mg：4mL。

[0032] 其中，步骤3中的三氯甲烷和甲醇的体积比为1：1.2。

[0033] 其中，步骤3中第三次离心的转速为10000r/min，所述的第三次离心的时间为3min。

[0034] 实施例4一种从衣藻提取油脂的方法包括以下步骤：
步骤1：衣藻的培养：将活化后的培养至对数生长期的新鲜微藻培养液，按照10%(v/v)的接种量接种到含有新鲜配制的微藻培养基的三角烧瓶中中，用4层纱布包裹瓶口，将所述的三角烧瓶放置于光照培养箱中进行培养；
步骤2：干微藻粉的制备：计量步骤1中培养好的衣藻培养液的体积，置于离心管中第一次离心得到第一衣藻藻体沉淀和第一上清液，弃去所述的第一上清液；用蒸馏水清洗所述的第一衣藻藻体沉淀，进行第二次离心得到第二衣藻藻体沉淀和第二上清液，收集所述的第二衣藻藻体沉淀，将所述的第二衣藻藻体沉淀置于65℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，记录第二衣藻藻体沉淀干重即得所述的干微藻粉，计算干微藻粉的生物量如下：
步骤3：油脂的提取：将步骤2制备得到的干微藻粉准确称取100mg干藻粉中加入盐酸振荡混匀后，室温下放置25min，随后置于沸水浴中8min，立刻转入-90℃冷冻15min，如此反复冻融3次；然后加入2倍体积的三氯甲烷和甲醇的混合液，混合均匀后离心，所述干微藻粉的油脂溶解于下层的三氯甲烷中，用移液枪吸取下层含有油脂的三氯甲烷层，将有含有油脂的三氯甲烷烘干后即得油脂，称重，计算油脂含量和油脂产量，计算公式如下：
其中，步骤1中每1L所述的微藻培养基中含有NaNO30.25g、K2HPO4·3H2O0.075g 、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl2·2H2O0.025g、KH2PO40.175g、NaCl0.025g、土壤提取液40mL 、FeCl3•6H2O0.005g、Fe-EDTA1mL。

[0035] 其中，步骤1中所述的培养条件为：光照强度为80 120μmol·m-2·s-1，光暗周期为~15：9h，25℃恒温培养，培养14d。

[0036] 其中，光照的光质为红光和蓝光，所述的红光和蓝光组合比例为2：1。

[0037] 其中，步骤2中的第一次离心和第二次离心的的转速均为4500r/min，离心时间为12min。

[0038] 其中，步骤3中盐酸的物质的量浓度为5mol/L，所述的干微藻粉的重量和盐酸的体积之比为100mg：5mL。

[0039] 其中，步骤3中的三氯甲烷和甲醇的体积比为1：0.9。

[0040] 其中，步骤3中第三次离心的转速为7000r/min，所述的第三次离心的时间为5min。

[0041] 试验例计算实施例1 4所述的生物量、油脂含量和油脂产量，具体见表1。
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[0042] 表1本发明仅仅提供了一种从衣藻提取油脂的方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围，本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

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