[0010] 具体步骤如下:惰性气氛下,将α-D-甘露糖单体M1、β-D-葡萄糖单体M2和Grubbs三代催化剂在
溶剂中,40-60℃条件下反应6-10h,之后加入乙烯基乙醚终止聚合反应,再经后处理得到含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))。
[0011] 本发明中,α-D-甘露糖单体M1、β-D-葡萄糖单体M2和Grubbs三代催化剂的摩尔比为(1~3):(1~3):(0.9~1.8)。
[0012] 本发明中,溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
[0013] 本发明中,后处理步骤如下:向乙烯基乙醚终止后反应液中加入甲醇进行搅拌沉降,析出的固体洗涤、干燥,得到含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))。
[0014] 本发明中,α-D-甘露糖单体M1、β-D-葡萄糖单体M2的合成路线如下式所示:
[0015]
[0016] 其具体步骤如下:
[0017] 步骤1)取呋喃和马来酸酐于溶剂中室温反应生成化合物1;
[0018] 步骤2)化合物1和乙醇胺反应生成化合物2;
[0019] 步骤3)化合物2和炔丙基溴在
碱作用下反应生成化合物3;
[0020] 步骤4)化合物3与α-D-甘露糖叠氮化合物溶于叔丁醇/
水的混合溶剂中,随后加入催化剂五水合
硫酸铜和
抗坏血酸钠,75-85℃的
温度下搅拌10-14h后,过滤除去不溶物后柱层析得到白色固体,即为α-D-甘露糖单体M1;
[0021] 步骤5)取化合物3与β-D-葡萄糖叠氮化合物溶于叔丁醇/水的混合溶剂中,随后加入催化剂五水合硫酸铜和抗坏血酸钠,75-85℃的温度下搅拌10-14h后,过滤除去不溶物后柱层析得到白色固体,即为β-D-葡萄糖单体M2。
[0022] 本发明中,步骤4)中,化合物3、α-D-甘露糖叠氮化合物、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比例为(1.1-1.2):1:(0.4-0.6):1,叔丁醇与水的体积比为1:2~2:1;步骤5)中,化合物3、β-D-葡萄糖叠氮化合物、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比例为(1.1-1.2):1:(0.4-0.6):1,叔丁醇与水的体积比为1:2~2:1。
[0023] 与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
[0024] 1.本发明利用CuAAC反应和开环易位聚合相结合的方法,简单、高效的制备出了含双类糖的无规共聚物,分子量可控且较窄的分子量分布宽度。
[0025] 2.本发明所合成的含双异类糖共聚物结构明确,可与生物蛋白特异识别,应用于生物医药领域。
[0026] 3.本发明制备含糖共聚物的方法还可适用于半乳糖、海藻糖等含糖聚合物的制备。
附图说明
[0027] 图1为
实施例1中2-炔-7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙醚7-ox-NB-alkyne的核磁氢谱图。
[0028] 图2为实施例1中2-炔-7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙醚7-ox-NB-alkyne的核磁
碳谱图。
[0029] 图3为实施例1中含α-D-甘露糖单体7-ox-NB-man核磁氢谱图。
[0030] 图4为实施例1中含α-D-甘露糖单体7-ox-NB-man核磁碳谱图。
[0031] 图5为实施例1中含β-D-葡萄糖单体7-ox-NB-glu核磁氢谱图。
[0032] 图6为实施例1中含β-D-葡萄糖单体7-ox-NB-glu核磁碳谱图。
[0033] 图7为实施例1得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))核磁氢谱图。
[0034] 图8为实施例1得到的含糖共聚物P(50%(7-ox-NB-man)-r-50%(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。
[0035] 图9为实施例2得到的含糖共聚物P(75%(7-ox-NB-man)-r-25%(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。
[0036] 图10为实施例2得到的含糖共聚物P(25%(7-ox-NB-man)-r-75%(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。
[0037] 图11为实施例2得到的含葡萄糖均聚物P(7-ox-NB-glu)核磁氢谱图。
[0038] 图12为实施例2得到的含葡萄糖均聚物P(7-ox-NB-glu)的凝胶渗透色谱图。
[0039] 图13
浊度法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A识别的吸光值变化谱图。
具体实施方式
[0040] 下面将结合附图和实施例,来详细说明本发明的技术方案。
[0041] 实施例中,含α-D-甘露糖和β-D-葡萄糖的无规共聚物的合成路线如下式所示:
[0042]
[0043] 实施例1
[0044] 1. 7-氧杂降冰片烯二酸酐7-ox-NB的合成
[0045] 在干燥的圆底烧瓶中加入马来酸酐(50g,0.51mol),并加入乙醚250mL。待马来酸酐溶解之后加入呋喃(125mL,1.72mol)。在室温条件下反应24h,反应结束后,过滤除去乙醚和呋喃,用乙醚洗涤三次,得到白色固体76g,产率为90%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ=6.58(s,2H),5.47(s,2H),3.18(s,2H).
[0046] 2. 7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙基醇7-ox-NB-OH的合成
[0047] 取经高温处理后冷却的单口圆底瓶,加入7-氧杂降冰片烯二酸酐(20g,0.12mol),甲醇(210mL),在0℃条件下搅拌。然后乙醇胺(11mL,0.18mmol)溶于30mL甲醇滴入反应体系中,滴加时间不小于30min,接着继续0℃条件搅拌1h,移去冰浴在室温条件下反应1h,再加热至65℃回流12h。待反应结束后冷却至室温,减压蒸馏除去大量甲醇后重结晶,过滤用石油醚洗涤得到白色固体16g,产率为64%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ=6.52(s,2H),5.28(s,2H),3.76(s,2H),3.70(s,2H),2.89(s,2H),2.15(s,1H).
[0048] 3. 2-炔-7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙醚7-ox-NB-alkyne的合成
[0049] 将7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙基醇(1.05g,5.02mmol)溶于30mL的N,N-二甲基甲酰胺中,在0℃条件下缓慢滴入炔丙基溴(1.08mL,10.04mmol),继续反应10min后,加入氢氧化
钾(0.56g,10.04mmol)。继续在0℃条件反应1h,接着移去冰浴,在室温条件下搅拌24h。反应结束后,加入20mL的乙酸乙酯和20mL的去离子水,水相用乙酸乙酯洗涤三次,之后收集有机相用饱和食盐水洗涤三次。有机相用无水硫酸钠干燥,产品由
硅胶色谱纯化,得到白色固体0.68g,产率为55%。图1和图2分别是2-炔-7-氧杂降冰片烯二甲酰胺乙醚7-ox-NB-alkyne的核磁氢谱图和核磁碳谱图。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ=6.53(s,2H),5.29(s,2H),4.16(d,J=2.3Hz,2H),3.71(dd,J=6.6,3.9Hz,4H),2.88(s,2H),2.43(t,J=2.3Hz,1H)
13
. C NMR(125MHz,CDCl3)δ=176.11,136.56,80.91,79.25,74.78,65.64,57.91,47.47,
38.13.HRMS(ESI):C13H13NO4H(M+H+)calc.for248.091734;found:248.092064.[0050] 4.含α-D-甘露糖的7-氧杂降冰片烯衍生物单体7-ox-NB-man的合成[0051] 取干燥的反应瓶,分别加入α-D-甘露糖叠氮化合物(0.11g,0.53mmol),并加入7-ox-NB-alkyne(0.15g,0.63mmol)溶于4mL的叔丁醇/水的混合溶剂中(体积比为1:1),接着加入五水合硫酸铜(0.13g,0.53mmol)和抗坏血酸钠(0.21g,1.06mmol),80℃条件下搅拌
12h,过滤除去不溶物,用甲醇洗涤,直接过硅胶柱,得到白色固体0.17g,产率为74%。图3、图4分别为含α-D-甘露糖单体7-ox-NB-man核磁氢谱图和核磁碳谱图。1H NMR(500MHz,D2O)δ=8.19(s,1H),6.57(s,2H),6.14(s,1H),5.28(d,J=3.4Hz,2H),4.65(s,2H),4.14(dd,J=
8.9,3.0Hz,1H),3.90–3.79(m,3H),3.66(dd,J1=14.2,J2=7.2Hz,J3=3H),3.34(d,J=
3.3Hz,1H),3.11(s,2H).13C NMR(125MHz,D2O)δ=179.20,144.47,136.37,124.21,87.56,
81.02,78.99,76.06,72.39,69.09,66.25,62.88,60.59,47.43,38.41.HRMS(ESI):
C13H13NO4H(M+H+)calc.for:453.161605;found:453.161643.
[0052] 5.含β-D-葡萄糖的7-氧杂降冰片烯衍生物单体7-ox-NB-glu的合成[0053] 取干燥的反应瓶,分别加入β-D-葡萄糖叠氮化合物(0.10g,0.48mmol),并加入7-ox-NB-alkyne(0.15g,0.57mmol)溶于4mL的叔丁醇/水的混合溶剂中(体积比为1:1),接着加入五水合硫酸铜(0.12g,0.48mmol)和抗坏血酸钠(0.19g,0.96mmol),80℃的条件下搅拌反应2h,过滤除去不溶物,用甲醇洗涤,直接过硅胶柱,得到白色固体0.16g,产率为78%。图5、图6分别为含α-D-甘露糖单体7-ox-NB-man核磁氢谱图和核磁碳谱图。1H NMR(500MHz,D2O)δ=8.06(s,1H),6.45(s,2H),6.01(s,1H),5.15(d,J=3.4Hz,2H),4.52(s,2H),4.01(dd,J1=8.9,J2=3.0Hz,2H),3.80–3.62(m,1H),3.61–3.43(m,9H),3.36–3.13(m,1H),2.98(s,2H).13C NMR(125MHz,D2O)δ=179.26,144.44,136.38,124.68,86.76,81.03,76.29,
70.63,68.39,66.64,66.21,62.83,60.55,47.45,38.39.HRMS(ESI):C13H13NO4H(M+H+)calc.for:453.161605;found:453.161731.
[0054] 6.含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))的合成
[0055] 取α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg,0.044mmol)、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg,0.044mmol)和Grubbs 3代催化剂(3.5mg,0.0039mmol),塞入
橡胶塞,并用
封口膜封住,通入氮气10min后,通入无水二甲基甲酰胺(1mL)。在水浴50℃条件下反应8h后,加入0.1mL的乙烯基乙醚,继续搅拌半小时后,在10mL的甲醇中沉降出灰白色固体36mg,产率为90%。图7为得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))核磁氢谱图。图8为得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。该聚合物的数均分子量为24543,分子量分布为1.30。1H NMR(500MHz,D2O)δ=8.14(d,J=
31.4Hz,1H),5.89(dd,J1=133.8,J2=47.3Hz,3H),4.56(s,2H),4.08(s,1H),3.93(s,1H),
3.75–3.54(m,7H),3.26(s,1H),2.99(s,2H).
[0056] 实施例2
[0057] α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体的制备同实施例1。
[0058] 取α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg,0.044mmol)、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(7mg,0.015mmol)和Grubbs 3代催化剂(2.3mg,0.0026mmol),塞入橡胶塞,并用封口膜封住,通入氮气10min后,通入无水二甲基甲酰胺(0.8mL)。在水浴50℃条件下反应12h后,加入0.1mL的乙烯基乙醚,继续搅拌半小时后,在10mL的甲醇中沉降出灰白色固体25mg,产率为92%。图9为得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。该聚合物的数均分子量为17089,分子量分布为1.27。
[0059] 实施例3
[0060] α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体的制备同实施例1。
[0061] 取α-D-甘露糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(7mg,0.015mmol)、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg,0.044mmol)和Grubbs 3代催化剂(2.3mg,0.0026mmol),塞入橡胶塞,并用封口膜封住,通入氮气10min后,通入无水二甲基甲酰胺(0.8mL)。在水浴25℃条件下反应20h后,加入0.1mL的乙烯基乙醚,继续搅拌半小时后,在10mL的甲醇中沉降出灰白色固体26mg,产率为96%。图10为得到的含糖共聚物P((7-ox-NB-man)-r-(7-ox-NB-glu))的凝胶渗透色谱图。该聚合物的数均分子量为24648,分子量分布为1.30。
[0062] 对比例1
[0063] 取β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(20mg,0.044mmol)和Grubbs 3代催化剂(1.8mg,0.0019mmol),塞入橡胶塞,并用封口膜封住,通入氮气10min后,通入无水二甲基甲酰胺(0.8mL)。在水浴50℃条件下反应12h后,加入0.1mL的乙烯基乙醚,继续搅拌半小时后,在10mL的甲醇中沉降出灰白色固体19mg,产率为95%。图11为得到的含葡萄糖均聚物P(7-ox-NB-glu)核磁氢谱图。图12为得到的含葡萄糖均聚物P(7-ox-NB-glu)的凝胶渗透色谱图。该聚合物的数均分子量为22229,分子量分布为1.25。1H NMR(500MHz,D2O)δ=8.18(s,1H),6.07–5.61(m,3H),4.56(s,2H),4.04–3.43(m,10H),3.01(s,2H)。
[0064] 应用实施例 浊度法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A的特异性识别作用[0065] 配制刀豆蛋白A(1mg/mL)的HBS缓冲溶液(HEPES,10mmol/L),pH=7.4,NaCl(50mmol/L),CaCl2(5mmol/L),MnCl2(5mmol/L)和四种含糖聚合物(分别根据实施例1-3、对比例1条件制备得到)的HBS缓冲溶液(1mg/mL)。测试时取400μL的刀豆蛋白A溶液置于比色皿中,接着加入100μL的含糖聚合物溶液,混匀后迅速放入样品池中,每3s记录一次420nm处的吸光值,并持续记录至10min。图13为浊度法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A识别的吸光值变化谱图。结果显示,含甘露糖的共聚物与刀豆蛋白A混合后很快变浑浊,而且吸光值也随着时间的增长而增长。只含β-D-葡萄糖的均聚物与刀豆蛋白A的混合溶液没有变化,吸光值也没有改变,其中含甘露糖比例越多的共聚物其与豆蛋白A的结合越快,这些结果表明含α-D-甘露糖的共聚物能与刀豆蛋白A发生特异性识别,而只含β-D-葡萄糖的均聚物不能与其识别,共聚物中甘露糖占比越大其与刀豆蛋白A的结合速率越快。