一种灰兜巴挥发性成分的提取方法
阅读：0发布：2021-04-04
专利汇可以提供一种灰兜巴挥发性成分的提取方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 公开了一种灰兜巴挥发性成分的提取方法，将灰兜巴剪碎后置于研钵中，加入液氮并对灰兜巴进行 研磨 ，得到灰兜巴粉末；向灰兜巴粉末中加入正己烷，放入恒温冷冻摇床中进行提取，然后过滤，分别得到滤液和滤渣；向滤渣中加入正己烷于恒温冷冻摇床中浸提，浸提完成后再对提取物进行过滤，得到二次滤液；将滤液和二次滤液合并后置于 旋转 蒸发 仪 上减压蒸馏回收正己烷，得到灰兜巴挥发性成分。本 发明 低毒高效，避免对受热不稳定成分的影响， 粉碎 效率高；制备得到的灰兜巴挥发性成分可与人胰岛素有关的 蛋白质 对接，能降低 血糖浓度 ，增加细胞对单糖、 氨 基酸和 脂肪酸 的通透性。还能 加速 肝脏中的糖酵解，戊糖 磷酸 循环和糖原合成。，下面是一种灰兜巴挥发性成分的提取方法专利的具体信息内容。
1.一种灰兜巴挥发性成分的提取及分析方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1，将灰兜巴剪碎后置于研钵中，加入液氮并对灰兜巴进行研磨，得到灰兜巴粉末；
步骤2，向步骤1得到的灰兜巴粉末中加入正己烷，放入恒温冷冻摇床中进行提取，然后过滤，分别得到滤液和滤渣；
步骤3，向步骤2得到的滤渣中加入正己烷，于恒温冷冻摇床中浸提，浸提完成后再对提取物进行过滤，得到二次滤液；
步骤4，将步骤2得到的滤液和步骤3得到的二次滤液合并后置于旋转蒸发仪上减压蒸馏回收正己烷，得到灰兜巴挥发性成分；
其中，步骤2中提取时恒温冷冻摇床的温度为30～35℃，振荡时间为30～40min，振荡完成后静置2～3h；
步骤3中浸提时间为30～40min；
步骤4中旋转蒸发仪的温度为35～40℃；
将得到的灰兜巴挥发性成分进行GC-MS分析，其中，色谱柱：HP-5MS弹性石英毛细管，
30m×0.32mm,0.25μm；进样口温度：70℃，程序升温：温度梯度10℃/min，从70℃升温至300℃，保持2min；气化室温度：250℃；载气为高纯氦气，99.999％；载气流量：1.0 mL/min；无分流进样，进样量：1μL；
质谱分析：离子源：电子轰击离子源；离子源温度：230℃；接口温度：280℃；电子能量：
70eV；质量扫描范围：50～600amu；质谱库为NIST 2011；
数据分析：通过GC-MS联用仪对灰兜巴的挥发性成分进行分析，得到总离子流色谱图，用计算机检索并与标准数据库进行对照解析，确定灰兜巴挥发油的化学成分；采用峰面积归一化法对化学成分进行相对百分含量测定，确定样品中每种化学成分的相对百分含量；
再对化学成分按烃类、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、含氮化合物进行分类，并统计各类化合物的种类数及其所占挥发油总量的百分含量。
一种灰兜巴挥发性成分的提取方法
技术领域
[0001] 本申请涉及一种挥发性成分的提取方法，具体地说，涉及一种灰兜巴挥发性成分的提取方法。
背景技术
[0002] 灰兜巴又名闭口袋、灰蔸巴，其外观形似一个布口袋，上端开口处附于老茶树的树干上，而下端藏于洞穴之中，主要产于四川省峨眉山市。有人认为灰兜巴是老茶树底下生长的一种菌科植物，但也有人认为灰兜巴是老茶树底下的一种红蜘蛛所分泌的蜘蛛丝。灰兜巴常混有红色或黄色的泥土，其颜色也有相应区别，主要是偏绿色或偏黄色，以灰黄色的品质最佳。灰兜巴主要有益气健脾，滋补肾阴，消除和缓解糖尿病症状，平衡机体阴阳，调和气血，纠正代谢紊乱等多种功效，作为一种偏方药长期在民间使用，主要用于治疗Ⅱ型糖尿病，被誉作治疗糖尿病的优良偏方，是峨眉山地区千年来世代相传的药物，拥有“仙山灵药”、“糖尿病克星”、“天然纯绿色的大自然珍宝”等多种美誉。
[0003] 灰兜巴对糖尿病长期的临床疗效以及部分实验研究表明了灰兜巴具有良好的降糖效果。已有研究表明灰兜巴的提取液、含有灰兜巴的复方制剂等具有降血糖以及清除体外自由基等作用，其作用机理可能是通过增强糖尿病患者的抗氧化能力和免疫力，防止发生脂质过氧化以及减缓肾功能衰竭等途径实现的降糖作用。许多研究者对灰兜巴降血糖作用的具体药理活性成分进行了初步探索，包括采用系统预试法，对灰兜巴不同提取液所含化学成分进行定性检验，初步推断灰兜巴可能含有的有机物成分种类；研究灰兜巴所含有的化学成分种类与其周边的茶树所含有的化学成分的区别；对灰兜巴多糖的降糖作用机理以及对灰兜巴多糖含量的测定和优化多糖提取工艺的研究；灰兜巴蛋白质的研究以及其微量金属元素含量的分析测定等。但目前未见关于灰兜巴挥发性成分的研究报道。
[0005] 有鉴于此，本申请针对上述存在的问题，提供了一种灰兜巴挥发性成分的提取方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本申请公开了一种灰兜巴挥发性成分的提取方法，具体按照以下步骤实施：
[0008] 步骤2，向步骤1得到的灰兜巴粉末中加入正己烷，放入恒温冷冻摇床中进行提取，然后过滤，分别得到滤液和滤渣；
[0009] 步骤3，向步骤2得到的滤渣中加入正己烷，于恒温冷冻摇床中浸提，浸提完成后再对提取物进行过滤，得到二次滤液；
[0012] 进一步地，步骤3中浸提时间为30～40min。
[0013] 进一步地，步骤4中旋转蒸发仪的温度为35～40℃。
[0014] 与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
[0015] 1)本发明正己烷低毒高效，有利于劳动保护。
[0016] 2)本发明采用了低温提取浓缩工艺，避免对受热不稳定成分的影响。
[0017] 3)本发明采用摇床振荡提取，提高提取效率。
[0018] 4)本发明液氮研末，避免粉碎受热对成分的影响，且粉碎效率高。
[0020] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0021] 图1是本发明高海拔灰兜巴挥发油的总离子流色谱图；
[0022] 图2是本发明低海拔灰兜巴挥发油的总离子流色谱图；
[0023] 图3是本发明ferruginol，α-patchoulene，vitamin A aldehyde，phytol和α-copaen与蛋白质对接图；其中，A.Ferruginol；B.α-patchoulene；C.Vitamin A aldehyde；D.phytol；E.α-copaene。
具体实施方式
[0024] 以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0025] 本发明公开了一种灰兜巴挥发性成分的提取方法，具体按照以下步骤实施：
[0026] 步骤1，将灰兜巴剪碎后置于研钵中，加入液氮并对灰兜巴进行研磨，得到灰兜巴粉末；
[0027] 步骤2，向步骤1得到的灰兜巴粉末中加入正己烷，放入恒温冷冻摇床中进行提取，在30～35℃条件下振荡时间为30～40min，振荡完成后静置2～3h，然后过滤，分别得到滤液和滤渣；
[0028] 步骤3，向步骤2得到的滤渣中加入正己烷，于恒温冷冻摇床中浸提30～40min，浸提完成后再对提取物进行过滤，得到二次滤液；
[0029] 步骤4，将步骤2得到的滤液和步骤3得到的二次滤液合并后置于旋转蒸发仪上以35～40℃条件减压蒸馏回收正己烷，得到灰兜巴挥发性成分。
[0030] 实施例1
[0031] 称取灰兜巴样品各100g，用剪刀剪碎后置于研钵中。加入适量的液氮于研钵中并对样品及时进行研磨。待药材磨为粉末后分别置于1000mL的锥形瓶中，做好标记，各加入500mL正己烷，放入磁石，将锥形瓶放入恒温冷冻摇床中进行提取，以30℃的条件振荡
30min，振荡完成后静置2h。用滤纸对提取物进行过滤，取滤液。并对滤渣进行第二次提取，向滤渣中各加入500mL正己烷，于恒温冷冻摇床中浸提30min，浸提完成后再对提取物进行过滤，合并2次滤液于圆底烧瓶中。将滤液置于旋转蒸发仪上以35℃的条件减压蒸馏回收正己烷得到浓缩的样品提取液。最后分别转移浓缩液于密闭试剂瓶中，将样品提取液置于4℃的冰箱中冷藏备用。
30min，振荡完成后静置2h。用滤纸对提取物进行过滤，取滤液。并对滤渣进行第二次提取，向滤渣中各加入500mL正己烷，于恒温冷冻摇床中浸提30min，浸提完成后再对提取物进行过滤，合并2次滤液于圆底烧瓶中。将滤液置于旋转蒸发仪上以35℃的条件减压蒸馏回收正己烷得到浓缩的样品提取液。最后分别转移浓缩液于密闭试剂瓶中，将样品提取液置于4℃的冰箱中冷藏备用。
[0032] 实施例2
[0033] 一种灰兜巴挥发性成分的提取方法，具体按照以下步骤实施：将灰兜巴剪碎后置于研钵中，加入液氮并对灰兜巴进行研磨，得到灰兜巴粉末；向得到的灰兜巴粉末中加入正己烷，放入恒温冷冻摇床中进行提取，在35℃条件下振荡时间为40min，振荡完成后静置3h，然后过滤，分别得到滤液和滤渣；向得到的滤渣中加入正己烷，于恒温冷冻摇床中浸提40min，浸提完成后再对提取物进行过滤，得到二次滤液；将得到的滤液和得到的二次滤液合并后置于旋转蒸发仪上以40℃条件减压蒸馏回收正己烷，得到灰兜巴挥发性成分。
[0034] 实施例3
[0035] 一种灰兜巴挥发性成分的提取方法，具体按照以下步骤实施：将灰兜巴剪碎后置于研钵中，加入液氮并对灰兜巴进行研磨，得到灰兜巴粉末；向得到的灰兜巴粉末中加入正己烷，放入恒温冷冻摇床中进行提取，在32℃条件下振荡时间为35min，振荡完成后静置2.5h，然后过滤，分别得到滤液和滤渣；向得到的滤渣中加入正己烷，于恒温冷冻摇床中浸提35min，浸提完成后再对提取物进行过滤，得到二次滤液；将得到的滤液和得到的二次滤液合并后置于旋转蒸发仪上以38℃条件减压蒸馏回收正己烷，得到灰兜巴挥发性成分。
[0036] 下面结合具体的实验过程来说明本发明的技术效果：
[0037] 1实验材料与方法
[0038] 1.1实验材料
[0039] 1.1.1实验药材
[0040] 购买自四川峨眉山市的灰兜巴，根据灰兜巴生长的海拔高度不同，将其分为高海拔样品(海拔2500m以上)和低海拔样品(海拔1000-2500m)。
[0041] 1.1.2主要实验试剂
[0042] 正己烷(分析纯)、液氮、蒸馏水等。
[0043] 1.1.3实验仪器
[0044] 6890/5973型GC-MS联用仪(Agilent)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、MaxQ 481HP落地式恒温冷冻摇床(Thermo Scientific)、电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)、冰箱(北京海售电器)等。
[0045] 1.2实验内容
[0046] 1.2.1灰兜巴挥发性成分的提取
[0047] 参照实施例1，对高海拔样品(海拔2500m以上)和低海拔样品(海拔1000-2500m)进行提取。
[0048] 1.2.2不同灰兜巴样品挥发性成分的GC-MS分析
[0049] 1.2.2.1气相色谱研究
[0050] 色谱柱：HP-5MS弹性石英毛细管(30m×0.32mm,0.25μm)；进样口温度：70℃，程序升温：温度梯度10℃/min，从70℃升温至300℃，保持2min；气化室温度：250℃；载气为高纯氦气(99.999％)；载气流量：1.0mL/min；无分流进样，进样量：1μL。
[0051] 1.2.2.2质谱分析
[0053] 1.2.3数据分析
[0054] 通过GC-MS联用仪对灰兜巴的两种样品挥发性成分进行分析，得到总离子流色谱图，用计算机检索并与标准数据库进行对照解析，确定灰兜巴挥发油的化学成分。采用峰面积归一化法分别对两种挥发油样品的化学成分进行相对百分含量测定，确定样品中每种化学成分的相对百分含量。再分别对挥发油样品的化学成分按烃类、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、含氮化合物等进行分类，并统计各类化合物的种类数及其所占挥发油总量的百分含量。对比分析两种样品所含化学成分的种类差异以及各类化学成分的相对百分含量差异。最后整理总结数据得出实验结果。
[0055] 2结果与分析
[0056] 2.1挥发油提取结果
[0057] 通过正己烷萃取，浓缩，得到两种灰兜巴样品的挥发油。其中低海拔挥发油为绿色，高海拔灰兜巴挥发油为黄棕色。
[0058] 2.2灰兜巴挥发油的GC-MS结果与分析
[0059] 2.2.1两种灰兜巴样品的总离子流色谱图
[0060] 通过GC-MS对两种灰兜巴样品的挥发油进行分析，得到两个样品的总离子流色谱图，见图1、图2。
[0061] 2.2.2两种灰兜巴样品挥发性成分及百分含量
[0062] 通过GC-MS对两种灰兜巴样品的挥发油进行分析，并与标准数据库对照解析，确定出了灰兜巴挥发油中所含有的化学成分。发现两种灰兜巴样品挥发性成分的种类及含量都有很大的差异。对其化学成分的种类和百分含量进行对比，分析两种样品挥发油化学成分的构成差异，结果见表1至表6。
[0063] 表1两种灰兜巴样品的挥发性成分(1-33号)
[0064]
[0065]
[0066] 表2两种灰兜巴样品的挥发性成分(34-70号)
[0067]
[0068]
[0069]
[0070] 表3两种灰兜巴样品的挥发性成分(71-108)
[0071]
[0072]
[0073] 表4两种灰兜巴样品的挥发性成分(109-146)
[0074]
[0075]
[0076] 表5两种灰兜巴样品的挥发性成分(147-182)
[0077]
[0078]
[0079]
[0080] 表6两种灰兜巴样品的挥发性成分(183-196)
[0081]
[0082] 注：tR(min)：保留时间；“—”表示不含此种化学物质。
[0083] 2.2.3两种灰兜巴样品挥发性成分的分类统计
[0084] 将两种灰兜巴样品的挥发性成分按照烃类，醇类，酯类，酸类，酮类，醛类，含氮化合物进行分类，统计其种类数及百分含量并对两种样品进行对比，分类统计情况和对比结果见表7。
[0085] 表7两种灰兜巴样品挥发性成分分类统计结果
[0086]
[0087]
[0088] 2.2.4两种灰兜巴样品中相同的挥发性成分
[0089] 分析结果表明，两种灰兜巴样品的挥发性成分共含有40种相同的化学物质，其名称、相对分子质量、分子式、百分含量见表8和表9。
[0090] 表8两种灰兜巴样品挥发油中相同的化学成分
[0091]
[0092]
[0093] 表9两种灰兜巴样品挥发油中相同的化学成分
[0094]
[0095] 4讨论
[0096] 4.1运用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对灰兜巴挥发性成分进行分析，研究结果表明灰兜巴挥发性成分的种类众多，高海拔灰兜巴样品共分离出了156个色谱峰，鉴定出了133种化学物质，占总挥发油含量的88.597％，低海拔样品共分离出了130个色谱峰，鉴定出
103种化学物质，占总挥发油的87.296％。高海拔样品鉴定出的物质种类较低海拔样品多。
高海拔灰兜巴样品中挥发油含量最高的化学成分是苯并环丁烯酮(6.711％)，其次是E-15-十七碳烯醛(4.484％)、1-十六烯(3.745％)等；低海拔样品中含量最高的化学成分是十四烷(3.964％)，其次是E-15-十七碳烯醛(3.961％)、2,4-二叔丁基苯酚(3.851％)等。
103种化学物质，占总挥发油的87.296％。高海拔样品鉴定出的物质种类较低海拔样品多。
高海拔灰兜巴样品中挥发油含量最高的化学成分是苯并环丁烯酮(6.711％)，其次是E-15-十七碳烯醛(4.484％)、1-十六烯(3.745％)等；低海拔样品中含量最高的化学成分是十四烷(3.964％)，其次是E-15-十七碳烯醛(3.961％)、2,4-二叔丁基苯酚(3.851％)等。
[0097] 4.2对两种灰兜巴样品的挥发性成分进行对比，发现两种灰兜巴样品所含的挥发性成分种类以及含量都有很大差异，含量最高的都是烃类化合物，烃类化合物中脂肪烃含量都高于芳香烃含量。高低海拔两个样品脂肪烃含量分别为48.881％和45.394％；芳香烃含量分别为7.173％和7.553％。其次醇类化合物的含量较其他物质高。两种灰兜巴样品共含有40种相同的挥发性成分，例如：十二烷、十八烷、1-十九碳烯、邻苯二甲酸二异丁酯等物质。
[0098] 4.3灰兜巴对糖尿病长期的临床疗效证明了灰兜巴具有降糖作用，但是灰兜巴降糖作用的活性成分研究尚不深入，目前未见关于灰兜巴挥发性成分的报道。根据本次对灰兜巴挥发性成分的研究，发现有成分可与人胰岛素有关的蛋白质对接，具体活性如下：
[0099] 其中，Ferruginol具有抗菌、抗氧化、杀线虫、抗溃疡。抗前列腺癌、抗炎、抗疟活性等作用。如图3所示，与Ferruginol对接的蛋白质(PDB ID:1S8C)是血红素加氧酶，它具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、信号传导和免疫调节以及抑制黏附分子表达活性等作用。α-patchoulene具有显著的体外和体内抗肿瘤活性。与α-patchoulene对接的蛋白质(PDB ID:1PL7)是人山梨醇脱氢酶(APO)，山梨醇脱氢酶(HSDH)和醛糖还原酶形成多元醇通路转换成葡萄糖和果糖。通过SDH的辅酶NADH氧化还原变化的生产过剩可能在糖尿病引起的敏感的组织功能发挥作用，使SDH的糖尿病并发症达到治疗的目标。因此，我们猜测α-patchoulene对降低血糖有一定的影响。Vitamin A aldehyde能抵抗肌肤衰老，它能在肌肤需要时，通过生理作用转化为活性维生素A，具有双重抗衰老作用。此外，Vitamin A aldehyde是传统的β-胡萝卜素制备工艺的重要中间体。与Vitamin A aldehyde对接的蛋白质(PDB ID:1EXX)为人类视黄醛受体，其在治疗多种疾病中有广泛活性，包括乳腺癌和皮肤病。phytol及其衍生物已经明显有抗菌性，细胞毒性，抗肿瘤，治疗糖尿病，降血脂，抗痉挛，抗氧化，抗炎，等作用。常用于治疗Ⅱ型糖尿病，它也抑制了雌激素在人类卵巢颗粒细胞芳香化酶的生物合成。phytol也保护动物抵抗毛果芸香碱导致的癫痫状态,并降低死亡率。与phytol对接的蛋白(PDB ID:1LQV)是一种天然的抗凝剂,它可以抗氧化，加剧促凝剂凝血和炎症反应。α-copaene存在于药用植物和芳香植物中，具有抗氧化性和抗遗传毒性。α-copaene也是一种很有开发潜力的抗癌剂。与α-copaene对接的蛋白(PDB ID:1TYL)是一种六聚体胰岛素和
4’-羟基乙酰的复合体结构。它能降低血糖浓度，增加细胞对单糖、氨基酸和脂肪酸的通透性。还能加速肝脏中的糖酵解，戊糖磷酸循环和糖原合成。
4’-羟基乙酰的复合体结构。它能降低血糖浓度，增加细胞对单糖、氨基酸和脂肪酸的通透性。还能加速肝脏中的糖酵解，戊糖磷酸循环和糖原合成。
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