利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法
阅读：178发布：2024-01-03
专利汇可以提供利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用四 角 蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，包括步骤：一、在取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA并反转录合成cDNA；二、对任一四角蛤蜊样品的DMRT基因和GAPDH基因进行扩增并绘制溶解曲线；三、检测SYBRGreen在PCR反应过程中 荧光 信号 的变化得到每个PCR反应的Ct值，以GAPDH基因为内参，采用2−△△CT法分析结果，计算出DMRT基因的相对表达量（DMRT基因的相对表达量与PBDEs浓度显著负相关）。本发明检出限更低，方法更加灵敏，更环保，检测成本更低，检测时间更短，重复性好，可信度高，且四角蛤蜊 采样 便利，实现了PBDEs污染的更早期预警。，下面是利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法专利的具体信息内容。
1.利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA；
步骤二：对于任意一个四角蛤蜊样品，对其DMRT基因和GAPDH基因进行扩增，并绘制溶解曲线，DMRT基因和GAPDH基因分别扩增时，加入等量的cDNA模板；
步骤三：通过检测SYBRGreen在PCR 反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR 反应的Ct 值，然后以GAPDH基因为内参，采用2−△△CT 法对结果进行分析，计算出DMRT 基因的相对表达量，DMRT基因的相对表达量与PBDEs的浓度呈现显著负相关，测定DMRT基因的相对表达量就可以反映海水或海洋沉积物被PBDEs污染的状况。
2.根据权利要求1所述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，按照如下反应体系进行扩增：
cDNA 1μL、实时定量PCR反应混合液 10μL、正向引物 0.4μL、反向引物0.4μL、水8.2μL；
其中，用于检测四角蛤蜊DMRT基因的引物的序列信息如下：
正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT
反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG
用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的引物的序列信息如下：
正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG
反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT。
3.根据权利要求1所述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，按照如下PCR条件进行扩增：
95℃预变性5min，1 个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40 个循环。
4.根据权利要求1所述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，PCR扩增使用的试剂盒是SYBR GreenQRT-PCR 试剂盒。
5.根据权利要求1所述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，扩增结束后，对部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、测序以验证扩增的特异性和准确性。
利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法
技术领域
背景技术
[0002] 多溴联苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是一系列含溴原子的芳香族化合物。作为全球使用最广泛的溴代阻燃剂，PBDEs在电子电器、纺织、橡胶、塑料、化工等领域得到了大量应用。PBDEs 能够通过生产、使用和产品的废弃而进入到环境中，通过大气沉降、地表径流等形式汇聚于海洋，累积于海洋沉积物和生物体中。PBDEs 污染遍布我国沿海，在渤海湾、辽东湾、莱州湾、胶州湾、厦门海域和珠江口海域，均检测到了PBDEs污染，在溴代阻燃剂生产工厂分布密集的莱州湾，4-6cm 海洋沉积物中PBDEs 浓度高达1800ng·g-1 干重，贝类PBDEs 富集量为230-720ng/g脂肪，高于日本（6.2-49ng/g脂肪）、韩国（8.5-440ng/g脂肪）和菲律宾（69-140ng/g脂肪），是目前报道的全球海域中贝类富集量的最高水平。毒理学实验表明，PBDEs对生物体具有内分泌干扰、免疫、发育、神经等多种毒性。
[0003] 目前，PBDEs的检测需借助大型仪器，例如：气相色谱-质谱联用。为了获得较为准确的结果，还需要配备专业的操作人员、选用C同位素内标，检测步骤繁琐、成本高。在前处理过程中会使用大量有机试剂，测定过程中还要使用标准品，造成了环境的二次污染。另外，方法和仪器都具有检测限，低于检测限的浓度检测不出来。关键的是，检测出的数值不能反映PBDEs对生物体的影响。
[0004] 众所周知，污染物对生物体的影响是从分子水平开始的，然后逐步在细胞、组织、器官、个体、种群、群落等水平上显现。生物标志物是环境变化的生物学指标，可在生物体受到严重损伤之前提供早期预警，是监测环境生物效应的有效手段。尤其是分子水平的生物标志物，较细胞、组织、器官、个体和群落水平可以提供更为早期的预警，以便进行环境调控，避免大规模损失。生物标志物监测在国际上应用广泛，是发达国家海洋环境管理策略（如欧盟海洋战略框架指令）的强制性指标。我国海洋生态环境的生物监测，主要是利用海洋生物群落多样性评估生态环境质量，而群落多样性对于生态环境的响应较分子水平的生物标志物滞后。
[0005] 贝类由于具有特殊的生活习性，并且分布广泛，是海洋环境污染的良好指示生物，也是毒理学研究的有力工具。贝类监测计划在世界范围内广泛开展。《中国海洋生态环境状况公报》通过检测贝类体内污染物的富集量来反映生态环境状况。目前，暂时还没有从环境导致的生物效应角度评估环境状况。
[0006] 贝类的生物监测多集中于附着型贝类——贻贝和牡蛎。然而在缺乏附着基的滩涂区域，贻贝和牡蛎的分布量非常小，并且贻贝和牡蛎不能对海洋沉积物的污染做出有效指示。滩涂是海洋环境中受人类活动影响最为严重的区域，我国滩涂面积广阔，随着滩涂生态与环境状况恶化，开发滩涂贝类用于环境检测和毒理学研究是十分必要的。四角蛤蜊（Mactraveneriformis）是一种典型的滩涂贝类，广泛分布在我国、韩国和日本沿海，是我国主要的经济贝类之一。四角蛤蜊能够大量富集污染物，具有作为污染物指示物种的潜力，其埋栖生活的特性，对海洋沉积物和水质污染有较好的指示作用。
[0007] DMRT（double-sex and mab-3 relatated transcription factor）基因是一类转录调控因子，在性别决定、性腺分化、组织和器官的发育形成和功能维持等发面发挥重要作用。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs的方法。
[0009] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA；
步骤二：对于任意一个四角蛤蜊样品，对其DMRT基因和GAPDH基因进行扩增，并绘制溶解曲线，DMRT基因和GAPDH基因分别扩增时，加入等量的cDNA模板；
步骤三：通过检测SYBRGreen在PCR 反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR 反应的−△△CT
Ct 值，然后以GAPDH基因为内参，采用2 法对结果进行分析，计算出DMRT 基因的相对表达量，DMRT基因的相对表达量与PBDEs的浓度呈现显著负相关，测定DMRT基因的相对表达量就可以反映海水或海洋沉积物被PBDEs污染的状况。
步骤一：在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA；
步骤二：对于任意一个四角蛤蜊样品，对其DMRT基因和GAPDH基因进行扩增，并绘制溶解曲线，DMRT基因和GAPDH基因分别扩增时，加入等量的cDNA模板；
步骤三：通过检测SYBRGreen在PCR 反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR 反应的−△△CT
Ct 值，然后以GAPDH基因为内参，采用2 法对结果进行分析，计算出DMRT 基因的相对表达量，DMRT基因的相对表达量与PBDEs的浓度呈现显著负相关，测定DMRT基因的相对表达量就可以反映海水或海洋沉积物被PBDEs污染的状况。
[0010] 前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，按照如下反应体系进行扩增：cDNA 1μL、实时定量PCR反应混合液 10μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、水 8.2μL；
其中，用于检测四角蛤蜊DMRT基因的引物的序列信息如下：
正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT
反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG
用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的引物的序列信息如下：
正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG
反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT。
其中，用于检测四角蛤蜊DMRT基因的引物的序列信息如下：
正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT
反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG
用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的引物的序列信息如下：
正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG
反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT。
[0011] 前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，按照如下PCR条件进行扩增：95℃预变性5min，1 个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40 个循环。
[0012] 前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，PCR扩增使用的试剂盒是SYBR GreenQRT-PCR 试剂盒。
[0013] 前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，扩增结束后，对部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、测序以验证扩增的特异性和准确性。
[0014] 本发明的有益之处在于：（1）利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs，相比于目前的仪器化学方法，检出限更低，方法更加灵敏；
（2）采用的监测生物——四角蛤蜊在我国沿海分布广泛，采样便利；
（3）整个检测过程不使用有机试剂和污染物标准品，减少了对环境的污染，更为环保；
（4）检测成本更低，检测时间更短，重复性好，可信度高；
（5）对操作人员的专业性要求低，安全保障高；
（6）测定的数据不仅能够反映海水和海洋沉积物被PBDEs污染的状况，还能体现污染的生物学效应；
（7）利用早期的分子水平的生物标志物，能够实现海洋环境PBDEs污染的更早期预警，克服了传统的从群落水平进行海洋环境生物监测的滞后性。
附图说明
（2）采用的监测生物——四角蛤蜊在我国沿海分布广泛，采样便利；
（3）整个检测过程不使用有机试剂和污染物标准品，减少了对环境的污染，更为环保；
（4）检测成本更低，检测时间更短，重复性好，可信度高；
（5）对操作人员的专业性要求低，安全保障高；
（6）测定的数据不仅能够反映海水和海洋沉积物被PBDEs污染的状况，还能体现污染的生物学效应；
（7）利用早期的分子水平的生物标志物，能够实现海洋环境PBDEs污染的更早期预警，克服了传统的从群落水平进行海洋环境生物监测的滞后性。
附图说明
具体实施方式
[0016] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0017] 实施例11、驯养实验生物
采用二龄雄性四角蛤蜊作为实验生物，在实验室玻璃大缸驯养14d，水温16±1℃，溶解氧7.7-8.3，pH7.9-8.1，盐度33。每天换水，换水前投喂新月菱形藻。
采用二龄雄性四角蛤蜊作为实验生物，在实验室玻璃大缸驯养14d，水温16±1℃，溶解氧7.7-8.3，pH7.9-8.1，盐度33。每天换水，换水前投喂新月菱形藻。
[0018] 2、进行胁迫实验将四角蛤蜊转移到15个玻璃小缸里开始试验，每个小缸盛装50L海水，放养100只四角蛤蜊。
[0019] 共设置5个实验组：（1）无污染天然海水对照组；
（2）二甲基亚砜对照组；
（3）0.1μg/L 四溴联苯醚（BDE-47）组；
（4）1.0μg/L 四溴联苯醚（BDE-47）组；
（5）10μg/L 四溴联苯醚（BDE-47）组。
（2）二甲基亚砜对照组；
（3）0.1μg/L 四溴联苯醚（BDE-47）组；
（4）1.0μg/L 四溴联苯醚（BDE-47）组；
（5）10μg/L 四溴联苯醚（BDE-47）组。
[0020] 其中：第（1）组是空白对照组，只有无污染天然海水；
第（2）组是溶剂对照组，二甲基亚砜用无污染天然海水稀释，二甲基亚砜终浓度为50μL/L；
第（3）组、第（4）组和第（5）组是BDE-47胁迫组，先将BDE-47粉末溶于助溶剂二甲基亚砜中，然后再一起加入无污染天然海水中，最终将BDE-47配制成0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L三个浓度，二甲基亚砜的终浓度均为50μL/L。
第（2）组是溶剂对照组，二甲基亚砜用无污染天然海水稀释，二甲基亚砜终浓度为50μL/L；
第（3）组、第（4）组和第（5）组是BDE-47胁迫组，先将BDE-47粉末溶于助溶剂二甲基亚砜中，然后再一起加入无污染天然海水中，最终将BDE-47配制成0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L三个浓度，二甲基亚砜的终浓度均为50μL/L。
[0021] 每组设置3个平行。
[0022] 试验持续7d，每天均全部换水，并补加相应的污染物。在第1d、第3d、第5d和第7d剖取四角蛤蜊性腺。每个取样点每个实验组取3只四角蛤蜊为1个平行，共3个平行。
[0023] 3、测定DMRT基因相对表达量（1）提取各组性腺RNA
提取性腺RNA的方法具体如下：
1）剖取雄性四角蛤蜊性腺，放入液氮研磨，取研磨后的性腺40mg加入到1mL RNA提取液Trizol中；
2）加入0.2mL 氯仿，用力震荡15s，并于室温放置5min；
3）12000g、4℃离心15min，离心后，混合物从上到下依次为无色的水相、中间相和淡红色的酚仿相，RNA 就存在于水相中；
4）将水相移至离心管中，加入等体积异丙醇，-20℃放置15 min；
5）12000g、4℃离心15 min，沉淀RNA；
6）加1ml 75％的乙醇洗涤RNA 沉淀，12000g、4℃离心10 min，弃上清，重复洗涤一次；
7）RNA 沉淀干燥5-10min，加入30μL RNase-free 水，4℃放置30min，充分溶解RNA；
8）将RNA 样品稀释100 倍，在紫外分光光度计下测OD260 及OD280，RNA 的A260/A280 应介于1.8-2.2 之间。
提取性腺RNA的方法具体如下：
1）剖取雄性四角蛤蜊性腺，放入液氮研磨，取研磨后的性腺40mg加入到1mL RNA提取液Trizol中；
2）加入0.2mL 氯仿，用力震荡15s，并于室温放置5min；
3）12000g、4℃离心15min，离心后，混合物从上到下依次为无色的水相、中间相和淡红色的酚仿相，RNA 就存在于水相中；
4）将水相移至离心管中，加入等体积异丙醇，-20℃放置15 min；
5）12000g、4℃离心15 min，沉淀RNA；
6）加1ml 75％的乙醇洗涤RNA 沉淀，12000g、4℃离心10 min，弃上清，重复洗涤一次；
7）RNA 沉淀干燥5-10min，加入30μL RNase-free 水，4℃放置30min，充分溶解RNA；
8）将RNA 样品稀释100 倍，在紫外分光光度计下测OD260 及OD280，RNA 的A260/A280 应介于1.8-2.2 之间。
[0024] RNA浓度（μg/ml）=OD260×稀释倍数×40μg/ml。
[0025] 用琼脂糖电泳检查RNA 的完整性，真核细胞核糖体RNA 的28S组分与18S 组分的比率应为2:1。
[0026] （2）反转录合成cDNA1）DNA酶消化
RNA 5μL
DNA酶 1μL
RNA酶抑制剂 0.5μL
反转录缓冲液 2μL
无RNA酶水 调整总体积至11.5μL
37℃温浴20min，然后向上述体系中加入反应终止液 1.0μL，65℃灭活DNA酶10min，之后再向体系中加入反转录引物2.0μL，70℃热变性5min，迅速冰浴2min。
RNA 5μL
DNA酶 1μL
RNA酶抑制剂 0.5μL
反转录缓冲液 2μL
无RNA酶水 调整总体积至11.5μL
37℃温浴20min，然后向上述体系中加入反应终止液 1.0μL，65℃灭活DNA酶10min，之后再向体系中加入反转录引物2.0μL，70℃热变性5min，迅速冰浴2min。
[0027] 2）反转录在已完成变性反应的以上体系中加入：
反转录缓冲液 3.0μL
无RNA酶脱氧核糖核苷三磷酸 1.25μL
反转录酶 1.0μL
RNA酶抑制剂 0.5μL
无RNA酶水 调整总体积至25μL
稍离心，然后42℃反转录1h，之后95℃灭活反转录酶10min。
反转录缓冲液 3.0μL
无RNA酶脱氧核糖核苷三磷酸 1.25μL
反转录酶 1.0μL
RNA酶抑制剂 0.5μL
无RNA酶水 调整总体积至25μL
稍离心，然后42℃反转录1h，之后95℃灭活反转录酶10min。
[0028] （3）进行实时定量PCR实时定量PCR（Quantitative real time PCR，QRT-PCR）是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR 进程。
[0029] 对于任意一个样品，加入等量的cDNA模板，对其DMRT基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH，内参基因）进行分别扩增。按照如下反应体系和反应条件，采用SYBR GreenQRT-PCR 试剂盒，在ABI PRISM 7500 实时定量PCR 仪上进行扩增，并绘制溶解曲线，对部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、测序以验证扩增的特异性和准确性。
[0030] 反应体系：cDNA 1μL
实时定量PCR反应混合液 10μL
正向引物 0.4μL
反向引物 0.4μL
水 8.2μL
其中，我们设计的用于检测四角蛤蜊DMRT基因的实时定量PCR 引物的序列信息如下：
正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT
反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG
我们设计的用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的实时定量PCR引物的序列信息如下：
正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG
反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT
PCR 条件：95℃预变性5min，1 个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40 个循环。
实时定量PCR反应混合液 10μL
正向引物 0.4μL
反向引物 0.4μL
水 8.2μL
其中，我们设计的用于检测四角蛤蜊DMRT基因的实时定量PCR 引物的序列信息如下：
正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT
反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG
我们设计的用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的实时定量PCR引物的序列信息如下：
正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG
反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT
PCR 条件：95℃预变性5min，1 个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40 个循环。
[0031] （4）计算DMRT 基因的相对表达量通过检测SYBRGreen在PCR 反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR 反应的Ct 值，然后以GAPDH基因为内参，采用2−△△CT 法对结果进行分析，即可计算出DMRT 基因的相对表达量。用单因素方差分析同一取样点不同浓度组之间的差异。
[0032] 在本实施例中，四角蛤蜊DMRT基因的相对表达量的计算结果见图1。
[0033] 由图1可知：BDE-47能够降低雄性四角蛤蜊性腺DMRT基因表达量，在胁迫的第1d，与对照组（包括空白对照组和溶剂对照组）相比，各胁迫组DMRT基因表达量均显著下降，随着BDE-47浓度的增加，DMRT基因表达量下降幅度增大，呈现剂量效应；随着BDE-47胁迫时间延长，DMRT基因表达量逐渐减小，呈现时间效应。
[0034] 这说明：四角蛤蜊DMRT基因表达量可用于监控、检测海水PBDEs污染程度。
[0035] 实施例21、驯养实验生物
以二龄雄性四角蛤蜊作为实验生物，采用与实施例1完全相同的方法驯养二龄雄性四角蛤蜊。
以二龄雄性四角蛤蜊作为实验生物，采用与实施例1完全相同的方法驯养二龄雄性四角蛤蜊。
[0036] 2、制备海洋沉积物在烟台潮间带采集洁净的没有PBDEs污染的表层50mm沉积物，采集后30min内转移至实验室。搅拌沉积物，过0.5mm尼龙筛，收集粒径小于0.5mm的沉积物，然后再搅拌均匀实现均一化。
[0037] 3、沉积物加标PBDEs用二甲基亚砜配制BDE-47母液（100mg/0.1mL），加标沉积物，设置5个实验组：
（1）空白对照（只有无污染的天然海水）；
（2）溶剂对照组（二甲基亚砜和沉积物按照体积重量比1:10000混合）；
（3）1mg/Kg干重四溴联苯醚（BDE-47）组；
（4）10mg/Kg干重四溴联苯醚（BDE-47）组；
（5）100mg/Kg干重四溴联苯醚（BDE-47）组。
（1）空白对照（只有无污染的天然海水）；
（2）溶剂对照组（二甲基亚砜和沉积物按照体积重量比1:10000混合）；
（3）1mg/Kg干重四溴联苯醚（BDE-47）组；
（4）10mg/Kg干重四溴联苯醚（BDE-47）组；
（5）100mg/Kg干重四溴联苯醚（BDE-47）组。
[0038] 根据加标量计算每个处理组需要的BDE-47母液量。按照BDE-47溶液和沉积物体积重量比1:1进行混合，放置在玻璃缸内，在每个处理组需要的BDE-47母液体积的基础上补加无污染天然海水到所需BDE-47溶液体积。第（2）组至第（5）组，二甲基亚砜和沉积物体积重量比为1:10000。搅拌2h以达到均一，在16℃下储存30d，每隔3d搅拌1次，使BDE-47在沉积物中分布均匀。
[0039] 4、用沉积物胁迫四角蛤蜊收集处理好的加标沉积物，分别加到测试玻璃缸（4L）内。按照上覆水与沉积物体积重量比1:4的比例，加入干净的海水至满。每个组设置3个重复，静置24h。将10只四角蛤蜊放入
1个测试玻璃缸，上覆水以10mL/min的速率连续更新，每天投喂1次新月菱形藻，胁迫7d。在第1d、第3d、第5d、第7d取雄性四角蛤蜊性腺。
1个测试玻璃缸，上覆水以10mL/min的速率连续更新，每天投喂1次新月菱形藻，胁迫7d。在第1d、第3d、第5d、第7d取雄性四角蛤蜊性腺。
[0040] 5、测定DMRT基因的相对表达量采用与实施例1相同的方法测定DMRT基因的相对表达量。
[0041] 在本实施例中，四角蛤蜊DMRT基因的相对表达量的计算结果见图2。
[0042] 由图2可知：用被BDE-47污染的沉积物胁迫四角蛤蜊时，BDE-47能够抑制DMRT基因表达，DMRT基因表达量对BDE-47响应敏感，在胁迫第1d，胁迫组DMRT基因表达量相比对照组即显著下降，随胁迫浓度的增加，DMRT基因表达量逐渐下降，DMRT基因表达量对BDE-47表现出剂量效应；随胁迫时间的延长，DMRT基因表达量逐渐减小，DMRT基因表达量对BDE-47表现出时间效应。
[0043] 这说明：四角蛤蜊的DMRT基因表达量可用于海洋沉积物PBDEs污染的检测。
[0044] 通过上面的两个研究我们发现，四角蛤蜊DMRT基因对PBDEs响应敏感，DMRT基因的表达量与PBDEs的浓度呈现显著负相关，所以测定DMRT基因的表达量可以反映海水和海洋沉积物被PBDEs污染的状况。
[0045] 基于此，我们发明了一种利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs的方法，该方法具体包括以下步骤：一、获取四角蛤蜊的cDNA
在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA。
在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA。
[0046] 1、提取性腺RNA提取性腺RNA的方法具体如下：
1）剖取雄性四角蛤蜊性腺，放入液氮研磨，取研磨后的性腺40mg加入到1mL Trizol中；
2）加入0.2mL 氯仿，用力震荡15s，并于室温放置5min；
3）12000g、4℃离心15min，离心后，混合物从上到下依次为无色的水相、中间相和淡红色的酚仿相，RNA 就存在于水相中；
4）将水相移至Eppendorf 管中，加入等体积异丙醇，-20℃放置15 min；
5）12000g、4℃离心15 min，沉淀RNA；
6）加1ml 75％的乙醇洗涤RNA 沉淀，12000g、4℃离心10 min，弃上清，重复洗涤一次；
7）RNA 沉淀干燥5-10min，加入30μL RNase-free 水，4℃放置30min，充分溶解RNA；
8）将RNA 样品稀释100 倍，在紫外分光光度计下测OD260 及OD280，RNA 的A260/A280 应介于1.8-2.2 之间。
1）剖取雄性四角蛤蜊性腺，放入液氮研磨，取研磨后的性腺40mg加入到1mL Trizol中；
2）加入0.2mL 氯仿，用力震荡15s，并于室温放置5min；
3）12000g、4℃离心15min，离心后，混合物从上到下依次为无色的水相、中间相和淡红色的酚仿相，RNA 就存在于水相中；
4）将水相移至Eppendorf 管中，加入等体积异丙醇，-20℃放置15 min；
5）12000g、4℃离心15 min，沉淀RNA；
6）加1ml 75％的乙醇洗涤RNA 沉淀，12000g、4℃离心10 min，弃上清，重复洗涤一次；
7）RNA 沉淀干燥5-10min，加入30μL RNase-free 水，4℃放置30min，充分溶解RNA；
8）将RNA 样品稀释100 倍，在紫外分光光度计下测OD260 及OD280，RNA 的A260/A280 应介于1.8-2.2 之间。
[0047] RNA浓度（μg/ml）=OD260×稀释倍数×40μg/ml。
[0048] 用琼脂糖电泳检查RNA 的完整性，真核细胞核糖体RNA 的28S组分与18S 组分的比率应为2:1。
[0049] 2、反转录合成cDNA1）DNA酶消化
RNA 5μL
DNA酶 1μL
RNA酶抑制剂 0.5μL
反转录缓冲液 2μL
无RNA酶水 调整总体积至11.5μL
37℃温浴20min，然后向上述体系中加入反应终止液 1.0μL，65℃灭活DNA酶10min，之后再向体系中加入反转录引物2.0μL，70℃热变性5min，迅速冰浴2min。
RNA 5μL
DNA酶 1μL
RNA酶抑制剂 0.5μL
反转录缓冲液 2μL
无RNA酶水 调整总体积至11.5μL
37℃温浴20min，然后向上述体系中加入反应终止液 1.0μL，65℃灭活DNA酶10min，之后再向体系中加入反转录引物2.0μL，70℃热变性5min，迅速冰浴2min。
[0050] 2）反转录在已完成变性反应的以上体系中加入：
反转录缓冲液 3.0μL
无RNA酶脱氧核糖核苷三磷酸 1.25μL
反转录酶 1.0μL
RNA酶抑制剂 0.5μL
无RNA酶水 调整总体积至25μL
稍离心，然后42℃反转录1h，之后95℃灭活反转录酶10min。
反转录缓冲液 3.0μL
无RNA酶脱氧核糖核苷三磷酸 1.25μL
反转录酶 1.0μL
RNA酶抑制剂 0.5μL
无RNA酶水 调整总体积至25μL
稍离心，然后42℃反转录1h，之后95℃灭活反转录酶10min。
[0051] 二、对四角蛤蜊的DMRT基因和GAPDH基因进行扩增对于任意一个四角蛤蜊样品，对其DMRT基因和GAPDH基因（内参基因）进行扩增，DMRT基因和GAPDH基因分别扩增时，加入等量的cDNA模板。按照如下反应体系和反应条件，采用SYBR GreenQRT-PCR 试剂盒，在ABI PRISM 7500 实时定量PCR 仪上进行扩增，并绘制溶解曲线，对部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、测序以验证扩增的特异性和准确性。
[0052] 反应体系：cDNA 1μL
实时定量PCR反应混合液 10μL
正向引物 0.4μL
反向引物 0.4μL
水 8.2μL
其中，用于检测四角蛤蜊DMRT基因的实时定量PCR 引物的序列信息如下：
正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT
反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG
用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的实时定量PCR引物的序列信息如下：
正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG
反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT
PCR 条件：95℃预变性5min，1 个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40 个循环。
实时定量PCR反应混合液 10μL
正向引物 0.4μL
反向引物 0.4μL
水 8.2μL
其中，用于检测四角蛤蜊DMRT基因的实时定量PCR 引物的序列信息如下：
正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT
反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG
用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的实时定量PCR引物的序列信息如下：
正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG
反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT
PCR 条件：95℃预变性5min，1 个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40 个循环。
[0053] 三、计算四角蛤蜊DMRT 基因的相对表达量通过检测SYBRGreen在PCR 反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR 反应的Ct 值，然后以GAPDH基因为内参，采用2−△△CT 法对结果进行分析，即可计算出DMRT 基因的相对表达量。用单因素方差分析同一取样点不同浓度组之间的差异。
[0054] 实施例3为了验证本发明提供的检测海洋中的PBDEs的方法的可行性和准确性，我们从莱州湾西部滩涂采集了四角蛤蜊、海水和海洋沉积物，用本发明提供的方法检测了海水和海洋沉积物中的PBDEs，并与气相色谱-质谱联用测得的结果进行了比对。
[0055] 2018年5月，我们在莱州湾西岸滩涂设置了8个调查站位，这8个调查站位的经纬度见表1。
[0056] 表1莱州湾西岸调查站位经纬度站位编号 经度 纬度
1 119°17′6″ 37°40′
2 119°10′ 37°39′
3 119°0′ 37°38′
4 118°57′ 37°32′
5 118°58′ 37°22′
6 119°59′ 37°16′
7 119°4′ 37°15′
8 119°11′ 37°8′
我们从这8个调查站位采集了雄性四角蛤蜊、海水和海洋沉积物，带回实验室，分析了雄性四角蛤蜊DMRT基因相对表达量，同时采用气相色谱-质谱联用测定了海水和海洋沉积物中PBDEs的含量。其中，海水中PBDEs的含量采用气相色谱-质谱联用测定的结果见表2，海洋沉积物中PBDEs的含量采用气相色谱-质谱联用测定的结果见表3，雄性四角蛤蜊DMRT基因相对表达量的测定结果见图3。
1 119°17′6″ 37°40′
2 119°10′ 37°39′
3 119°0′ 37°38′
4 118°57′ 37°32′
5 118°58′ 37°22′
6 119°59′ 37°16′
7 119°4′ 37°15′
8 119°11′ 37°8′
我们从这8个调查站位采集了雄性四角蛤蜊、海水和海洋沉积物，带回实验室，分析了雄性四角蛤蜊DMRT基因相对表达量，同时采用气相色谱-质谱联用测定了海水和海洋沉积物中PBDEs的含量。其中，海水中PBDEs的含量采用气相色谱-质谱联用测定的结果见表2，海洋沉积物中PBDEs的含量采用气相色谱-质谱联用测定的结果见表3，雄性四角蛤蜊DMRT基因相对表达量的测定结果见图3。
[0057] 表2 莱州湾西岸调查站位海水中PBDEs的含量（pg/L）站位 1 2 3 4 5 6 7 8
BDE-28 38.5 30.3 53.2 32.5 34.1 73.4 93 70.1
BDE-47 34.2 44.2 63.1 35.4 53.9 40 78.1 41.2
BDE-71 27.9 24.8 35.8 31.1 45.7 31.2 44.5 28
BDE-100 26.6 0 0 33.6 35.3 36.4 32.3 30.4
BDE-138 21.4 21.5 28.5 19.7 34.5 20.7 20.4 29.3
BDE-206 60.2 48.7 53.9 37.3 64.3 45.8 58.9 48.8
BDE-207 43.5 32.8 25.7 22.8 29.5 39.6 20.8 27.1
BDE-208 28.4 26 32.8 27.1 40.7 94.6 53.8 33.3
总计 132.1 113.2 121.6 130.2 159 190.7 134.4 127.2
表3 莱州湾西岸调查站位海洋沉积物中PBDEs的含量（ng/g dw）
站位 1 2 3 4 5 6 7 8
BDE-28 2.3 4.1 10.7 5.3 9.5 4.9 2.1 19.8
BDE-47 106.2 98.9 152.8 89.4 200.3 264.1 198.9 186.3
BDE-71 10.9 12.7 3.6 7.2 34.1 27.4 31.8 4.6
BDE-100 22.4 13.4 11.2 10.8 7.7 14.2 21.2 32.5
BDE-138 17.5 21.9 45.1 23.5 12.6 10.7 6.4 13.2
BDE-206 12.8 13.1 4.8 11.9 21.1 22.5 17.8 9.1
BDE-207 5.9 4.2 1.3 5.7 5.3 8.6 12.6 1.7
BDE-208 24.6 18.6 9.5 16.3 18.5 25.9 13.1 18.4
总计 963.7 730.5 801.4 566.1 967.2 1050.5 1011.4 931.4
随后，我们根据测定的雄性四角蛤蜊DMRT基因相对表达量以及海水和海洋沉积物中PBDEs的含量，采用皮尔森相关性分析结果表明海水PBDEs含量、海洋沉积物PBDEs含量均与DMRT基因表达量呈现显著负相关，相关性系数分别为-0.946、-0.836。
BDE-28 38.5 30.3 53.2 32.5 34.1 73.4 93 70.1
BDE-47 34.2 44.2 63.1 35.4 53.9 40 78.1 41.2
BDE-71 27.9 24.8 35.8 31.1 45.7 31.2 44.5 28
BDE-100 26.6 0 0 33.6 35.3 36.4 32.3 30.4
BDE-138 21.4 21.5 28.5 19.7 34.5 20.7 20.4 29.3
BDE-206 60.2 48.7 53.9 37.3 64.3 45.8 58.9 48.8
BDE-207 43.5 32.8 25.7 22.8 29.5 39.6 20.8 27.1
BDE-208 28.4 26 32.8 27.1 40.7 94.6 53.8 33.3
总计 132.1 113.2 121.6 130.2 159 190.7 134.4 127.2
表3 莱州湾西岸调查站位海洋沉积物中PBDEs的含量（ng/g dw）
站位 1 2 3 4 5 6 7 8
BDE-28 2.3 4.1 10.7 5.3 9.5 4.9 2.1 19.8
BDE-47 106.2 98.9 152.8 89.4 200.3 264.1 198.9 186.3
BDE-71 10.9 12.7 3.6 7.2 34.1 27.4 31.8 4.6
BDE-100 22.4 13.4 11.2 10.8 7.7 14.2 21.2 32.5
BDE-138 17.5 21.9 45.1 23.5 12.6 10.7 6.4 13.2
BDE-206 12.8 13.1 4.8 11.9 21.1 22.5 17.8 9.1
BDE-207 5.9 4.2 1.3 5.7 5.3 8.6 12.6 1.7
BDE-208 24.6 18.6 9.5 16.3 18.5 25.9 13.1 18.4
总计 963.7 730.5 801.4 566.1 967.2 1050.5 1011.4 931.4
随后，我们根据测定的雄性四角蛤蜊DMRT基因相对表达量以及海水和海洋沉积物中PBDEs的含量，采用皮尔森相关性分析结果表明海水PBDEs含量、海洋沉积物PBDEs含量均与DMRT基因表达量呈现显著负相关，相关性系数分别为-0.946、-0.836。
[0058] 所以，测定DMRT基因的表达量可以反映海水和海洋沉积物被PBDEs污染的状况，本发明提供的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs的方法确实可行且有效。
[0059] 另外，本发明提供的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs的方法，对于判断PBDEs对生物体的毒性、构建我国基于生物标物的海洋环境评价体系具有重要意义，能够助力我国实现标准化的生物监测，有良好的推广应用前景。
[0060] 需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
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