技术领域
[0001] 本
发明属于光学技术领域，特别涉及一种提高单分子光学成像对比度的装置及方法。技术背景
[0002] 单分子
荧光成像已经成为物理、化学、材料科学、生命科学以及诸多交叉学科中一个重要的研究手段。基于单分子荧光成像发展起来的超分辨成像技术已经广泛应用于亚细胞
水平生命过程的直接观测。由于单分子探测消除了系综平均效应，可以反映局部组织和分子尺度动
力学变化，逐渐成为研究复杂系统不均匀性的有力工具。
[0003] 单分子荧光成像主要依赖于对单分子荧光
光子计数的手段。然而，由于单分子荧光起伏以及环境因素导致的单分子荧光中断和低
荧光量子产率，限制了单分子荧光成像
信号噪声比，导致单分子光学成像对比度低，难以满足高清晰度单分子荧光成像的要求。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服现有光子计数技术的缺点，提供一种提高单分子光学成像对比度的装置及方法，利用相对延时和
相位可控的超快激光脉冲对与单分子相互作用的量子相干效应，解决现有单分子荧光起伏以及环境因素导致的单分子荧光成像信号噪声比受限制的技术问题。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 一种提高单分子光学成像对比度的装置，其包括激光脉冲延迟和相位调制部分、信号分析和控制部分、单分子激发及荧光探测部分；
[0007] 所述激光脉冲延迟和相位调制部分包括亚皮秒脉冲
激光器、λ/2波片、50/50分束器、直
角反射镜I、直角反射镜II、电光
调制器、信号发生器、高压
放大器和λ/4波片；
[0008] 所述λ/2波片、50/50分束器、直角反射镜I依次设在亚皮秒激光器水平线偏振光输出方向，所述直角反射镜II设在50/50分束器反射光方向且直角反射镜II可沿光束传播方向移动，所述λ/4波片设在直角反射镜II和50/50分束器之间，所述电光调制器设在直角反射镜I和50/50分束器之间，所述高压放大器和信号发生器设在电光调制器一侧，高压放大器的信号输出端与电光调制器的信号输入端连接，高压放大器的信号输入端与信号发生器的输出端连接，所述信号发生器提供调制信号，用于控制高压放大器输出高压信号加载到电光调制器，所述高压放大器监控信号输出端与
数据采集卡输入端连接；
[0009] 所述单分子激发及荧光探测部分包括：二向色镜、物镜、三维纳米位移台、单分子样品、针孔、透镜I、透镜II和单光子探测器；所述二向色镜设在50/50分束器处合束后的激光传输方向上且起分光作用，物镜设在二向色镜的反射光路上，单分子样品固定在物镜上方的三维纳米位移台上；透镜I、透镜II和单光子探测器设在二向色镜的
透射光路上，针孔设在透镜I和透镜II之间，所述单光子探测器的信号输出端分别与数据采集卡和时间相关单光子计数器的信号输入端连接；
[0010] 所述信号分析和控制部分包括：数据采集卡、时间相关单光子计数器和
计算机系统；所述数据采集卡的信号输出端与三维纳米位移台的信号输入端连接，三维纳米位移台反馈信号输出端与数据采集卡的反馈信号输入端连接，数据采集卡用于控制三维纳米位移台在x-y平面扫描，同时接收三维纳米位移台的反馈信号；所述数据采集卡和时间相关单光子计数器通过通用
串行总线与计算机系统连接，所述计算机系统通过
软件实现信号分析和控制。
[0011] 利用一种提高单分子光学成像对比度的装置提高成像对比度的方法，包括以下步骤：
[0012] a、亚皮秒
脉冲激光器输出的亚皮秒脉冲由50/50分束器分为两路脉冲光，两路脉冲光各自经过时间延迟系统后合束，形成相对延时可调的脉冲对序列；调节两路脉冲序列的相对延时在零延时附近，通过电光调制器调制两束脉冲光之间的相对
相位差；
[0013] b、合束后的脉冲对序列经物镜聚焦后激发单分子，通过单光子探测器对单分子荧
光信号进行探测，单光子探测器将接收到的单光子信号转换为标准的TTL
电压脉冲，然后发送至数据采集卡和时间相关单光子计数器进行计数，并输入计算机系统进行信号分析；
[0014] c、数据采集卡
输出电压控制信号控制三维纳米位移台，逐点扫描样品经过物镜聚焦光斑，并逐点探测相应
位置的荧光获得单分子二维成像；时间相关单光子计数器逐点提取单分子荧光量子相干信号，经计算机系统傅里叶变换后得到相应调制
频率处的
频谱强度信息，获得单分子荧光量子相干频谱成像。
[0015] 本发明利用相对延时和相位可控的超快激光脉冲对激发单分子，制备并控制分子激发态波包量子干涉从而实现单量子体系量子相干操控，通过控制激光脉冲对序列的相对相位实现单分子激发态波包干涉的操控，改变激发态布居几率，从而导致单分子荧光调制。以相对延时和相位可调的超快激光脉冲对为例，单分子被第一个超快激光脉冲激发，会同时耦合分子多个振动本征态，导致
电子激发态产生非稳态的振动波包；另一个经时间延迟后的相同超快激光脉冲和单分子作用会产生另一个振动波包，与前一个波包产生干涉，称为振动波包干涉。干涉效应取决于激光脉冲对的相对延时和相对相位；脉冲对相对延时变化，对应两个脉冲包络中心的时间延迟，可以等效为脉冲对相对相位的变化。当脉冲对相对相位为零时，两个振动波包相长干涉；脉冲对相对相位差为±π时产生相消干涉，干涉相长还是相消，导致单分子激发态布居几率变大或变小。由于荧光正比于单分子激发态布居几率，波包相干相长导致单分子荧光增强；反之，波包相干相消导致单分子荧光减弱。将脉冲对相对延时固定于零延时附近，周期性调制脉冲对相对相位，探测分子电子激发态
势能面的振动动力学导致的单分子荧光信号出现的周期性调制特性。统计分析相对相位调制的脉冲对激发得到的单分子荧光量子相干信号，可以获得相干动力学的信息。利用单分子荧光的量子相干信号的频谱信息成像，而噪声和背景荧光并不具备量子相干信息，从而获得高对比度的单
分子成像。
[0016] 本发明利用亚皮秒激光脉冲对与单分子相互作用中的量子相干效应，通过调制脉冲对相对相位，获得单分子荧光量子相干信号频谱成像，解决了传统基于单分子荧光强度成像受到荧光强度起伏、荧光中断以及强背景信号等影响造成的成像对比度低的问题。因此，与背景技术相比，本发明具有能提高单分子光学成像对比度的优点。
附图说明
[0017] 图1为本发明装置的结构示意图；
[0018] 图2为未加调制信号的单分子荧光成像图；
[0019] 图3a为通过监测高压放大器监控信号获得的两脉冲
激光束相位调制信息；b为单分子荧光量子相干调制轨迹；
[0020] 图4a为单分子荧光调制轨迹经傅里叶变换之后的频谱；b为背景荧光信号经傅里叶变换之后的频谱；
[0021] 图5a为传统的单分子荧光强度成像图；b为利用单分子量子相干效应导致的荧光特定响应频谱幅度成像图；两幅图均为相对背景归一化后的成像结果。
具体实施方式
[0022] 下面将结合附图和
实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0023] 如图1所示，一种提高单分子光学成像对比度的装置，其包括激光脉冲延迟和相位调制部分、信号分析和控制部分、单分子激发及荧光探测部分；
[0024] 所述激光脉冲延迟和相位调制部分包括亚皮秒脉冲激光器1、λ/2波片2、50/50分束器3、直角反射镜I 4、直角反射镜II 5、电光调制器6、信号发生器7、高压放大器8和λ/4波片9；所述λ/2波片2、50/50分束器3、直角反射镜I 4依次设在亚皮秒脉冲激光器1水平线偏振光输出方向，所述直角反射镜II 5设在50/50分束器3反射光方向且直角反射镜II 5可沿光束传播方向移动，用于精确控制光程差，所述λ/4波片9设在直角反射镜II 5和50/50分束器3之间，λ/4波片9可将竖直偏振光变成水平偏振光，从而使两束脉冲光相互垂直，避免其自身发生干涉；所述电光调制器6设在直角反射镜I 4和50/50分束器3之间，所述高压放大器8和信号发生器7设在电光调制器6一侧，高压放大器8的信号输出端与电光调制器6的信号输入端连接，高压放大器8的信号输入端与信号发生器7的输出端连接，所述信号发生器7提供调制信号，用于控制高压放大器8输出高压信号加载到电光调制器6，所述高压放大器8监控信号输出端与数据采集卡16输入端连接；
[0025] 所述单分子激发及荧光探测部分包括：二向色镜10、物镜11、三维纳米位移台12、单分子样品13、针孔14、透镜I 19、透镜II 20和单光子探测器15；所述二向色镜10设在50/50分束器3处合束后的激光传输方向上且起分光作用，物镜11设在二向色镜10的反射光路上，单分子样品13固定在物镜11上方的三维纳米位移台12上；透镜I 19、透镜II 20和单光子探测器15设在二向色镜10的透射光路上，针孔14设在透镜I 19和透镜II 20之间，所述单光子探测器15的信号输出端分别与数据采集卡16和时间相关单光子计数器17的信号输入端连接；
[0026] 所述信号分析和控制部分包括：数据采集卡16、时间相关单光子计数器17和计算机系统18；所述数据采集卡16的信号输出端与三维纳米位移台12的信号输入端连接，三维纳米位移台12反馈信号输出端与数据采集卡16的反馈信号输入端连接，数据采集卡16用于控制三维纳米位移台12在x-y平面扫描，同时接收三维纳米位移台12的反馈信号；所述数据采集卡16和时间相关单光子计数器17通过
通用串行总线与计算机系统18连接，所述计算机系统18通过软件实现信号分析和控制。
[0027] 利用上述提高单分子光学成像对比度的装置提高成像对比度的方法，包括以下步骤：
[0028] a、亚皮秒脉冲激光器1输出水平偏振光，经过λ/2波片2变成竖直偏振光，竖直偏振光经过50/50分束器3分成两路，其中一路脉冲光经过电光调制器6到达直角反射镜I 4，通过直角反射镜I 4反射后再次经过电光调制器6返回50/50分束器3，另一路脉冲光经过λ/4波片9后到达直角反射镜II 5，经直角反射镜II 5反射后再次经过λ/4波片9进入50/50分束器3，最后两路脉冲光在50/50分束器3处合束，形成相对延时可调的脉冲对序列；调节两路脉冲序列的相对延时在零延时附近，通过信号发生器7和高压放大器8对电光调制器6进行控制，从而改变两路脉冲光之间的相对相位差；
[0029] b、50/50分束器3处合束的脉冲光被二向色镜10反射后被物镜11聚焦到单分子样品13表面；单分子样品13上单分子受到激
光激发后，发出的单分子荧光被物镜11收集，经过二向色镜10滤除残余的激光，被透镜I 19聚焦到针孔14上进行空间滤波，进一步消除物镜11聚焦范围之外的残余荧光；经过针孔14之后的单分子荧光被透镜II 20聚焦到单光子探测器15上；单光子探测器15接收到单光子信号后转换为标准的TTL电压脉冲，分成两路分别进入数据采集卡16和时间相关单光子计数器17进行计数，并输入计算机系统18进行信号分析；
[0030] c、数据采集卡16输出电压控制信号控制三维纳米位移台12，扫描样品逐点经过物镜11聚焦光斑，并逐点探测相应位置的荧光获得单分子二维成像；时间相关单光子计数器17逐点提取单分子荧光量子相干信号，经计算机系统18傅里叶变换后得到相应调制频率处的频谱强度信息，获得单分子荧光量子相干频谱成像。
[0031] 上述实施例中所述的单分子样品的制备方法为：
[0032] 将染料分子溶解到超纯水溶液中，制得浓度为10-9～10-8mol/L的染料分子溶液，对该溶液进行超声震荡使染料分子在溶液中均匀分散，利用
旋涂仪将染料分子溶液旋转涂覆到预先清洗干净的玻片上，然后在其表面上旋涂
质量分数为0.5％的聚甲基
丙烯酸甲酯的氯仿溶液，制得厚度为100nm的聚甲基丙烯酸甲酯
薄膜，将旋涂有
聚合物的样品玻片放入
真空烘干箱中升温至聚甲基丙烯酸甲酯聚合物
玻璃化温度以上进行淬火处理，3小时之后关闭真空烘干箱电源让其冷却至室温即可。
[0033] 图2为将两路激光脉冲固定延时1ps，相对相位固定，电光调制器6未加调制信号时，扫描得到的单分子荧光成像图，成像区域为10μm×10μm；从图中可知，传统的基于单分子荧光光子统计的成像受到背景荧光的制约，单分子荧光信号容易淹没在背景荧光信号中，无法获得高对比度成像。
[0034] 图3a为通过监测高压放大器监控信号获得的两脉冲激光束相位调制信息，从图中可知，高压放大器加载到电光调制器的电压线性变化，对应两脉冲激光束相对相位从-π到+π调制；图3b为单分子荧光量子相干轨迹，从图中可知，单分子荧光强度出现明显的调制信息。
[0035] 图4a为单分子荧光调制轨迹经傅里叶变换之后的频谱；b为背景荧光信号经傅里叶变换之后的频谱；图中，调制频率为1kHz时，对比两个频谱信息发现，单分子荧光调制频谱在相应调制频率位置出现明显的响应信号，而背景荧光信号经傅里叶变换后在相应相位调制频率位置未出现响应，这种差异主要是由单分子的动力学变化引起的。
[0036] 图5a为传统的单分子荧光强度成像图；b为利用单分子量子相干效应导致的荧光特定响应频谱幅度成像图，两幅图均为相对背景归一化后的成像结果。从图中可知，传统单分子荧光强度成像归一化后的信号背景比约为0.07，而利用单分子量子相干效应导致的荧光特定响应频谱成像归一化后信号背景比可达18，信号背景比提高了257倍，这主要因为量子相干效应只能在超快激光脉冲对和单分子相互作用体系被观测到，而背景没有产生量子相干效应。
