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一种血小板跨膜电位检测方法

阅读：1002发布：2020-05-23

专利汇可以提供一种血小板跨膜电位检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种血小板跨膜电位检测方法，步骤为：取洗涤后的血小板样品用含氯化钙的Hepes‑Tyrodes buffer重新悬浮稀释，加入流式管，记为F；另取洗涤后的血小板样品用氯化钾为120‑150mmol/L，氯化钠为2‑20mmol/L的Hepes‑Tyrodes buffer重新悬浮稀释，加入流式管，记为F0；向F0流式管中加入终浓度为0.1‑5μg/L的短菌杆肽；向F和F0流式管加入终浓度为10‑200nmol/L DiBAC4(3)，染色；上机检测；根据修正后的能斯特方程计算结果。该方法血小板破坏少，灵敏度高，重复性好，充实了现有的血小板保存质量评估方法，能够预判血小板储存损伤。，下面是一种血小板跨膜电位检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)血小板原液样品离心，弃上清，洗涤；
b)取部分经步骤a)处理的血小板样品，使用含0.8-5mmol/L氯化钙且氯化钾含量为1-
6mmol/L的Hepes-Tyrodes buffer重新悬浮血小板，稀释血小板至5～10×109/L，加入流式管，记为F；另取部分经步骤a)处理的血小板样品，使用氯化钾含量为120-150mmol/L且氯化钠含量为2-20mmol/L的Hepes-Tyrodes buffer重新悬浮血小板，稀释血小板至5～10×
109/L，加入流式管，记为F0；
c)向F0流式管中加入终浓度为0.1-5μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；
d)向F和F0流式管加入终浓度为10-200nmol/L DiBAC4(3)溶液，轻轻震荡，混匀，暗室室温染色15-60min；
e)流式上机检测；
根据修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)，计算血小板跨膜电位，其中，F0代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值。
2.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤d)中DiBAC4(3)终浓度为80-100nmol/L，步骤c)中短菌杆肽终浓度为0.5-2μg/L。
3.根据权利要求2所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤d)中DiBAC4(3)终浓度为100nmol/L，步骤c)中短菌杆肽终浓度为1μg/L。
4.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤d)中染色时间为
15-22min。
5.根据权利要求4所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤d)中染色时间为
20min。
6.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为1-5mmol/L，记为F0的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为120-140mmol/L。
7.根据权利要求6所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为2.7mmol/L，记为F0的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为137mmol/L。
8.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钙含量为0.8-3mmol/L。
9.根据权利要求8所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钙含量为1.8mmol/L。
10.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，所述的氯化钾含量为1-6mmol/L的Hepes-Tyrodes buffer具体含有以下浓度的试剂：137mmol/L氯化钠、
2.7mmol/L氯化钾、12mmol/L 碳酸氢钠、1mmol/L氯化镁、0.4mmol/L磷酸二氢钠、5.5mmol/L 葡萄糖、10mmol/L Hepes，pH为7.4。

说明书全文

一种血小板跨膜电位检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及输血医学领域，具体地说，涉及一种血小板跨膜电位检测方法。

背景技术

[0002] 血小板是血液成分之一，在止血、凝血以及宿主免疫方面发挥着重要作用。血小板9
没有细胞核，直径约2～3μm。正常血液中血小板的数量大约为150～400×10/L，在体内的最长寿命约为8～10天。

[0003] 随着输血医学的发展，血小板制品输注已成为临床输血治疗的重要手段，用于预防和缓解血小板减少症或者功能障碍。但临床上常发生因非免疫因素导致的血小板输注无效，如发热、感染、药物、血小板制品的质量等均可能影响血小板输注效果。血小板的形态、活化、代谢以及凋亡与血小板输注的治疗效果存在密切的联系。血小板在采集、储存、输注的过程中受到各种因素刺激产生的储存损伤，导致血小板结构与功能的改变。血小板的储存可能导致血小板部分被活化以及代谢功能的丧失，影响血小板的聚集活性和粘附能力。血小板在体外保存期间的活化损伤即血小板储存损伤决定着血小板制品的质量。正确快速评估血小板储存损伤对于指导采供血机构和临床医疗机构规范操作，规避血小板制品储存损伤，降低血小板输注无效的发生频率，提高输血疗效，节约有限的血液资源来说是十分必要的。

[0004] 目前评估血小板保存质量的相关检测指标有血小板计数、平均体积、形态学积分、pH、血小板聚集活性、低渗休克率、CD62p和磷酯酰丝氨酸(PS)表达等，主要检测血小板形态学及血小板功能的变化。尚未见对血小板生物电能改变的检测。在正常生理情况下细胞内环境的各种成分和理化性质只在很小的范围内发生变动，即存在一个内环境的稳态。在内、外环境因素的刺激作用下细胞内环境稳态失衡，在此基础上才出现各种病理生理变化。血小板没有细胞核，因而极其脆弱，离体条件下非常容易被破坏。血小板在体外保存过程中由于多种因素在体外容易被活化，这个过程中可能造成血小板内环境生物电能稳态的失衡，表现为血小板跨膜电位的变化。因而跨膜电位的变化是血小板活化损伤的最初、第一步的反应。第一时间观察血小板的生物电能的失衡，即血小板跨膜电位的测量，比其他方法能更及时快速地了解血小板生理变化，及早预判可能的血小板储存损伤，尽早调配血液资源，尽量减少血小板输注无效的发生，提高血小板临床输注安全。血小板膜电位变化的监控可作为目前常用的血小板形态和功能监测方法的一个补充。

[0005] 目前膜电位检测方法如下：

[0006] 1.电压钳(Vol tage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动。但该技术由于在细胞内插入两根电极，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。

[0007] 2.膜片钳技术(Patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动。

[0008] 3.电压敏感染料也称为荧光探针，按照染料对膜电位变化的反应速度可以分为慢反应电压敏感染料和快反应电压敏感染料。慢反应染料被称为Nernstian染料，对细胞膜有通透性，细胞被染色时，染料可渗入细胞膜双脂质层。当细胞膜超极化时，染料与膜成分相结合，膜表面染料浓度下降，出现消光效应，膜表面荧光减弱；反之，当细胞膜去极化时，染料又重新被释放至膜表面，膜表面染料浓度增加，膜表面荧光增强。在细胞膜两侧电位差的影响下，这些电压敏感荧光染料在胞外染色缓冲液和细胞质之间的分布服从能斯特方程，据此可计算出细胞膜两侧电位差即跨膜电位的大小。

[0009] 目前测定细胞跨膜电位较为经典的方法是微电极或者膜片钳技术，但是用膜片钳测量如此微小血小板的跨膜电位需要专业的技术设备和较高的技术要求且费时费力，成本较高，不利于对血小板跨膜电位及其变化做出快速的检测。利用电压敏感染料的跨膜电位光学标测技术与传统的微电极等方法相比，具有动态测量电传导、不受大电场干扰等独特的优势，受到了广泛关注。然而，用电压敏感染料检测膜电位时，分光光度计检测的是总的荧光强度，可能会受到细胞总数的影响，且只能相对定量，检测灵敏度不高。此外，将血小板膜电位变化的监控作为血小板形态和功能监测方法，则要求对于血小板破坏较少，具备较好的实验重复性，方能达到准确预判可能的血小板储存损伤，提高血小板临床输注安全的目的。

[0010] 综上所述，亟需一种检测灵敏度高、对血小板破坏少且实验重复性好的血小板跨膜电位检测方法。但是目前关于这类方法还未见报道。

发明内容

[0011] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种血小板跨膜电位检测方法。

[0012] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

[0013] 一种血小板跨膜电位检测方法，所述的方法包括以下步骤：

[0014] a)血小板原液样品离心，弃上清，洗涤；

[0015] b)取部分经步骤a)处理的血小板样品，使用含0.8-5mmol/L氯化钙且氯化钾含量9
为1-6mmol/L的Hepes-Tyrodes buffer重新悬浮血小板，稀释血小板至5～10×10/L，加入流式管，记为F；另取部分经步骤a)处理的血小板样品，使用氯化钾含量为120-150mmol/L的Hepes-Tyrodes buffer重新悬浮血小板，稀释血小板至5～10×109/L，加入流式管，记为F0；

[0016] c)向F0流式管中加入终浓度为0.1-5μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；

[0017] d)向F和F0流式管加入终浓度为10-200nmol/L DiBAC4(3)溶液，轻轻震荡，混匀，暗室室温染色15-60min；

[0018] e)流式上机检测；

[0019] 根据修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)，计算血小板跨膜电位，其中，F0代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值。

[0020] 优选地，步骤d)中DiBAC4(3)终浓度为80-100nmol/L，步骤c)中短菌杆肽终浓度为0.5-2μg/L。

[0021] 更优选地，步骤d)中DiBAC4(3)终浓度为100nmol/L，步骤c)中短菌杆肽终浓度为1μg/L。

[0022] 优选地，步骤d)中染色时间为15-22min。

[0023] 更优选地，步骤d)中染色时间为20min。

[0024] 优选地，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为1-5mmol/L，记为F0的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为120-140mmol/L。

[0025] 更优选地，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为2.7mmol/L，记为F0的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为137mmol/L。

[0026] 优选地，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钙含量为0.8-3mmol/L。

[0027] 更优选地，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钙含量为1.8mmol/L。

[0028] 作为本发明的一种具体实施方式，所述的氯化钾含量为1-6mmol/L的Hepes-Tyrodes buffer具体含有以下浓度的试剂：137mmol/L 氯化钠、2.7mmol/L氯化钾、12mmol/L 碳酸氢钠、1mmol/L氯化镁、0.4mmol/L磷酸二氢钠、5.5mmol/L 葡萄糖、10mmol/L Hepes，pH为7.4。

[0029] 需要说明的是，Hepes-Tyrodes buffer为本领域技术人员所熟知的缓冲液，本领域技术人员应知晓，其各成分的浓度可以有细微的变化。

[0030] 流式细胞仪的使用对于本领域技术人员来说是熟知的，作为本发明的一种具体实施方式，流式细胞仪检测参数为：电压设置：FSC：E-1；SSC：313；FL1：555；FL2：150；FL3：150。但不仅限于此，本领域技术人员可根据实际情况进行合理的调整。

[0031] 修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)中，R代表通用气体常数，T代表绝对温度，Z代表染料所带的电荷。

[0032] 如本文所用，“室温”是指本领域熟知的温度范围，较佳地是20-30℃。

[0033] 本发明优点在于：

[0034] 1、本发明对保存期间血小板跨膜电位的变化进行了观察，为血小板质量监控提供一个不同的角度和思路，作为方法学的补充，充实了目前常用的形态学和功能学方法来评估血小板体外保存质量，能通过第一时间观察血小板的生物电能的失衡，更及时快速地了解血小板生理变化，及早预判可能的血小板储存损伤，尽早调配血液资源，尽量减少血小板输注无效的发生，提高血小板临床输注安全。

[0035] 2、本发明结合了流式细胞仪技术，能够获得一定数量细胞的平均荧光强度，且为绝对荧光强度的值，通过计算可以直接获得跨膜电位mV数值，而且还能得到细胞中不同状态细胞的跨膜电位信息，检测灵敏度高。

[0036] 3、本发明采用了合适的染料及血小板去极化试剂，检测过程中细胞毒性小，血小板破坏少，检测灵敏度高，结果重复性好。

具体实施方式

[0037] 下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0038] 本发明使用电压敏感染料DiBAC4(3)来检测血小板跨膜电位。DiBAC4(3)为一价负离子慢反应染料，本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光。测量时细胞浸在荧光染料中。当细胞内荧光强度增加即跨膜电位增加表示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即跨膜电位降低表示细胞超极化。DiBAC4(3)在质膜两侧的分布服从能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)ln(Ci/Ce)，其中R代表通用气体常数，T代表绝对温度，Z代表染料所带的电荷，Ci、Ce分别代表胞內、胞外游离染料的浓度。使用流式细胞仪检测出来的F代表全细胞或者细胞器被DiBAC4(3)染色所发出荧光。细胞完全去极化时胞内胞外荧光染料浓度相同，即Ci＝Ce，Ci/Ce胞内胞外游离染料的浓度可使用血小板完全去极化时DiBAC4(3)荧光强度F0和静息状态下荧光强度取代F，此时的能斯特方程可以修正为：V＝Edye＝-(RT/ZF)ln(F/F0)。

[0039] 实施例1 本发明的血小板跨膜电位检测方法(一)

[0040] 1实验材料与仪器

[0041] 采集当天新鲜的血小板，放入血小板保存袋中，22℃震荡保存。

[0042] Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethineoxonol，DiBAC4(3)(购自Sigma)溶于二甲基亚砜配置成10μmol/L的工作液，-20℃保存。

[0043] 短菌杆肽(Gramicidin，购自Sigma，货号50845)使用二甲基亚砜配置成2mg/mL的工作液，-20℃保存。

[0044] Hepes-Tyrodes buffer(无钙)：137mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0045] Hepes-Tyrodes buffer(高钾)：2.7mmol/L氯化钠，137mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0046] 流式细胞仪(BD，FACSCalibur)；离心机(Eppendorf，5154D)。

[0047] 2实验步骤

[0048] 1)取1000μL机采血小板原液，分成2份；

[0049] 2)800g，5min离心，弃上清，PBS洗涤三次；

[0050] 3)分别使用500μL Hepes-Tyrodes buffer(1.8mmol/L氯化钙)和Hepes-Tyrodes buffer(高钾)重新悬浮血小板，稀释血小板至约5～10×109/L，分别标记F和F0；

[0051] 4)向F0流式管中加入终浓度为1μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；5)向F和F0流式管加入终浓度为100nmol/L DiBAC4(3)溶液(DMSO浓度不超过0.1％)，轻轻震荡，混匀；暗室室温染色20min；

[0052] 6)流式上机检测。电压设置：FSC：E-1；SSC：313；FL1：555；FL2：150；FL3：150。

[0053] 根据修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)，F0代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值，计算血小板跨膜电位。

[0054] 3实验结果

[0055] 检测得到15人份血小板膜电位平均值为-56±6mV，与Lawrence T.等膜片钳法所得的结果(-52±8mV)和Maclntyre所得的结果(-60mV)相似，说明本发明的方法测定血小板膜电位的准确性很高。

[0056] 实施例2 本发明的血小板跨膜电位检测方法(二)

[0057] 1实验材料与仪器

[0058] 采集当天新鲜的血小板，放入血小板保存袋中，22℃震荡保存。

[0059] Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethineoxonol，DiBAC4(3)(购自Sigma)溶于二甲基亚砜配置成10μmol/L的工作液，-20℃保存。

[0060] 短菌杆肽(Gramicidin，购自Sigma，货号50845)使用二甲基亚砜配置成2mg/mL的工作液，-20℃保存。

[0061] Hepes-Tyrodes buffer(无钙)：137mmol/L氯化钠，1mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0062] Hepes-Tyrodes buffer(高钾)：2mmol/L氯化钠，137mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0063] 流式细胞仪(BD，FACSCalibur)；离心机(Eppendorf，5154D)。

[0064] 2实验步骤

[0065] 1)取1000μL机采血小板原液，分成2份；

[0066] 2)800g，5min离心，弃上清，PBS洗涤三次；

[0067] 3)分别使用500μL Hepes-Tyrodes buffer(0.8mmol/L氯化钙)和Hepes-Tyrodes buffer(高钾)重新悬浮血小板，稀释血小板至约5～10×109/L，分别标记F和F0；

[0068] 4)向F0流式管中加入终浓度为2μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；5)向F和F0流式管加入终浓度为80nmol/L DiBAC4(3)溶液(DMSO浓度不超过0.1％)，轻轻震荡，混匀；暗室室温染色15min；

[0069] 6)流式上机检测。电压设置：FSC：E-1；SSC：313；FL1：555；FL2：150；FL3：150。

[0070] 根据修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)，F0代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值，计算血小板跨膜电位。

[0071] 3实验结果

[0072] 检测得到15人份血小板膜电位平均值为-57.2±6mV，与Lawrence T.等膜片钳法所做的结果(-52±8mV)和Maclntyre所做的结果(-60mV)相似，说明本发明的方法测定血小板膜电位的准确性很高。

[0073] 实施例3 本发明的血小板跨膜电位检测方法(三)

[0074] 1实验材料与仪器

[0075] 采集当天新鲜的血小板，放入血小板保存袋中，22℃震荡保存。

[0076] Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethineoxonol，DiBAC4(3)(购自Sigma)溶于二甲基亚砜配置成10μmol/L的工作液，-20℃保存。

[0077] 短菌杆肽(Gramicidin，购自Sigma，货号50845)使用二甲基亚砜配置成2mg/mL的工作液，-20℃保存。

[0078] Hepes-Tyrodes buffer(无钙)：134mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0079] Hepes-Tyrodes buffer(高钾)：17mmol/L氯化钠，120mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0080] 流式细胞仪(BD，FACSCalibur)；离心机(Eppendorf，5154D)。

[0081] 2实验步骤

[0082] 1)取1000μL机采血小板原液，分成2份；

[0083] 2)800g，5min离心，弃上清，PBS洗涤三次；

[0084] 3)分别使用500μL Hepes-Tyrodes buffer(3mmol/L氯化钙)和Hepes-Tyrodes buffer(高钾)重新悬浮血小板，稀释血小板至约5～10×109/L，分别标记F和F0；

[0085] 4)向F0流式管中加入终浓度为0.5μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；

[0086] 5)向F和F0流式管加入终浓度为100nmol/L DiBAC4(3)溶液(DMSO浓度不超过0.1％)，轻轻震荡，混匀；暗室室温染色22min；

[0087] 6)流式上机检测。电压设置：FSC：E-1；SSC：313；FL1：555；FL2：150；FL3：150。

[0088] 根据修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)，F0代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值，计算血小板跨膜电位。

[0089] 3实验结果

[0090] 检测得到15人份血小板膜电位平均值为-55.8±7mV，与Lawrence T.等膜片钳法所做的结果(-52±8mV)和Maclntyre所做的结果(-60mV)相似，说明本发明的方法测定血小板膜电位的准确性很高。

[0091] 实施例4 本发明的血小板跨膜电位检测方法(四)

[0092] 1实验材料与仪器

[0093] 采集当天新鲜的血小板，放入血小板保存袋中，22℃震荡保存。

[0094] Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethineoxonol，DiBAC4(3)(购自Sigma)溶于二甲基亚砜配置成10μmol/L的工作液，-20℃保存。

[0095] 短菌杆肽(Gramicidin，购自Sigma，货号50845)使用二甲基亚砜配置成2mg/mL的工作液，-20℃保存。

[0096] Hepes-Tyrodes buffer(无钙)：133mmol/L氯化钠，6mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0097] Hepes-Tyrodes buffer(高钾)：5mmol/L氯化钠，120mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0098] 流式细胞仪(BD，FACSCalibur)；离心机(Eppendorf，5154D)。

[0099] 2实验步骤

[0100] 1)取1000μL机采血小板原液，分成2份；

[0101] 2)800g，5min离心，弃上清，PBS洗涤三次；

[0102] 3)分别使用500μL Hepes-Tyrodes buffer(5mmol/L氯化钙)和Hepes-Tyrodes buffer(高钾)重新悬浮血小板，稀释血小板至约5～10×109/L，分别标记F和F0；

[0103] 4)向F0流式管中加入终浓度为0.1μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；5)向F和F0流式管加入终浓度为200nmol/L DiBAC4(3)溶液(DMSO浓度不超过0.1％)，轻轻震荡，混匀；暗室室温染色15min；

[0104] 6)流式上机检测。电压设置：FSC：E-1；SSC：313；FL1：555；FL2：150；FL3：150。

[0105] 根据修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)，F0代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值，计算血小板跨膜电位。

[0106] 3实验结果

[0107] 检测得到15人份血小板膜电位平均值为-56.9±6mV，与Lawrence T.等膜片钳法所做的结果(-52±8mV)和Maclntyre所做的结果(-60mV)相似，说明本发明的方法测定血小板膜电位的准确性很高。

[0108] 实施例5 本发明的血小板跨膜电位检测方法(五)

[0109] 1实验材料与仪器

[0110] 采集当天新鲜的血小板，放入血小板保存袋中，22℃震荡保存。

[0111] Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethineoxonol，DiBAC4(3)(购自Sigma)溶于二甲基亚砜配置成10μmol/L的工作液，-20℃保存。

[0112] 短菌杆肽(Gramicidin，购自Sigma，货号50845)使用二甲基亚砜配置成2mg/mL的工作液，-20℃保存。

[0113] Hepes-Tyrodes buffer(无钙)：137mmol/L氯化钠，1mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0114] Hepes-Tyrodes buffer(高钾)：8mmol/L氯化钠，130mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0115] 流式细胞仪(BD，FACSCalibur)；离心机(Eppendorf，5154D)。

[0116] 2实验步骤

[0117] 1)取1000μL机采血小板原液，分成2份；

[0118] 2)800g，5min离心，弃上清，PBS洗涤三次；

[0119] 3)分别使用500μL Hepes-Tyrodes buffer(0.8mmol/L氯化钙)和Hepes-Tyrodes 9
buffer(高钾)重新悬浮血小板，稀释血小板至约5～10×10/L，分别标记F和F0；

[0120] 4)向F0流式管中加入终浓度为5μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；5)向F和F0流式管加入终浓度为10nmol/L DiBAC4(3)溶液(DMSO浓度不超过0.1％)，轻轻震荡，混匀；暗室室温染色60min；

[0121] 6)流式上机检测。电压设置：FSC：E-1；SSC：313；FL1：555；FL2：150；FL3：150。

[0122] 根据修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)，F0代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值，计算血小板跨膜电位。

[0123] 3实验结果

[0124] 检测得到15人份血小板膜电位平均值为-55.9±7mV，与Lawrence T.等膜片钳法所做的结果(-52±8mV)和Maclntyre所做的结果(-60mV)相似，说明本发明的方法测定血小板膜电位的准确性很高。

[0125] 实施例6 本发明的血小板跨膜电位检测方法的方法学考察

[0126] 检验实施例1-5的血小板跨膜电位检测方法的重复性。具体方法是：按照实施例1-5任一方法检测3个不同人的血小板跨膜电位，每个检测5次，计算血小板跨膜电位的平均值及方差。实施例1的重复性检验结果见表1，实施例2-5的重复性检验结果见表2。结果表明本发明的血小板跨膜电位检测方法重复性很好。

[0127] 表1 实施例1的重复性检验结果

[0128]不同人份 1(mV) 2(mV) 3(mV)
1 -59.7 -59.3 -57.9
2 -57.6 -55.0 -63.7
3 -53.6 -57.1 -58.1
4 -62.3 -53.7 -55.8
5 -60.1 -53.9 -57.9
平均值 -58.66 -55.8 -58.68
方差 3.28 2.37 2.96

[0129] 表2 实施例2-5的重复性检验结果

[0130]

[0131] 对比例1

[0132] 1实验材料与仪器

[0133] 采集当天新鲜的血小板，放入血小板保存袋中，22℃震荡保存。

[0134] Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethineoxonol，DiBAC4(3)(购自Sigma)溶于二甲基亚砜配置成10μmol/L的工作液，-20℃保存。

[0135] Hepes-Tyrodes buffer(无钙)：137mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0136] 血小板固定液：使用PBS配制4％多聚甲醛和2％戊二醛。

[0137] 流式细胞仪(BD，FACSCalibur)；离心机(Eppendorf，5154D)。

[0138] 2实验步骤

[0139] 1)取500μL机采血小板原液，800g，5min离心；弃上清，PBS洗涤三次。0.01％戊二醛+2％多聚甲醛在4℃条件下固定2小时，800g，5min离心，Hepes-Tyrodes buffer(无钙)冲洗三遍。Hepes-Tyrodes buffer(加入终浓度为1.8mmol/L氯化钙)稀释血小板至约5～10×109/L，标记为F0；

[0140] 2)取500μL机采血小板原液，800g，5min离心；弃上清，PBS洗涤三次。Hepes-Tyrodes buffer(无钙)冲洗三遍。Hepes-Tyrodes buffer(加入终浓度为1.8mmol/L氯化钙)重新悬浮血小板；稀释血小板至约5～10×109/L，标记为F；

[0141] 3)向F和F0流式管加入终浓度为100nmol/L DiBAC4(3)溶液(DMSO浓度不超过0.1％)，轻轻震荡，混匀。暗室室温染色20min；流式上机检测，电压设置：FSC：E-1；SSC：313；
FL1：555；FL2：150；FL3：150。

[0142] 按照上述方法检测3个不同人的血小板跨膜电位，每个检测5次，计算血小板跨膜电位的平均值及方差，检验该方法的重复性。

[0143] 3实验结果

[0144] 戊二醛与多聚甲醛固定法的重复性检验结果见表3。结果表明该方法的重复性显著差于本发明的方法。

[0145] 表3 戊二醛与多聚甲醛固定法的重复性检验结果

[0146]不同人份 1(mV) 2(mV) 3(mV)
1 -45.4 -38.2 -52.1
2 -42.6 -61.1 -58.0
3 -64,5 -48.1 -27.6
4 -35.5 -29.7 -38.7
5 -58.0 -55.6 -44.3
平均值 -49.2 -46.6 -44.1
方差 10.5 12.7 11.8

[0147] 对比例2

[0148] 1实验材料与仪器

[0149] 采集当天新鲜的血小板，放入血小板保存袋中，22℃震荡保存。

[0150] Bis-oxonol(购自Sigma)溶于二甲基亚砜配置成10μmol/L的工作液，-20℃保存。

[0151] 短菌杆肽(Gramicidin，购自Sigma，货号50845)使用二甲基亚砜配置成2mg/mL的工作液，-20℃保存。

[0152] Hepes-Tyrodes buffer(无钙)：137mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0153] Hepes-Tyrodes buffer(高钾)：2.7mmol/L氯化钠，137mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0154] 流式细胞仪(BD，FACSCalibur)；离心机(Eppendorf，5154D)。

[0155] 2实验步骤

[0156] 1)取1000μL机采血小板原液，分成2份；

[0157] 2)800g，5min离心，弃上清，PBS洗涤三次；

[0158] 3)分别使用500μL Hepes-Tyrodes buffer(1.8mmol/L氯化钙)和Hepes-Tyrodes buffer(高钾)重新悬浮血小板，稀释血小板至约5～10×109/L，分别标记F和F0；

[0159] 4)向F0流式管中加入终浓度为1μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；

[0160] 5)向F和F0流式管加入终浓度为100nmol/L Bis-oxonol溶液(DMSO浓度不超过0.1％)，轻轻震荡，混匀；暗室室温染色20min；

[0161] 6)流式上机检测。电压设置：FSC：E-1；SSC：313；FL1：555；FL2：150；FL3：150。

[0162] 根据修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)，F0代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值，计算血小板跨膜电位。

[0163] 按照上述方法检测3个不同人的血小板跨膜电位，每个检测5次，计算血小板跨膜电位的平均值及方差，检验该方法的重复性。

[0164] 3实验结果

[0165] 检测得到15人份血小板膜电位平均值为-45.8±10mV，与Lawrence T.等膜片钳法所做的结果(-52±8mV)和Maclntyre所做的结果(-60mV)相差较大，说明该方法测定血小板膜电位的准确性一般。

[0166] 该方法的重复性检验结果见表4。结果表明该方法的重复性显著差于本发明的方法。

[0167] 表4 本实施例方法的重复性检验结果

[0168]不同人份 1(mV) 2(mV) 3(mV)
平均值 -43.8 -41.7 -49.2
方差 9.8 10.7 10.4

[0169] 对比例3

[0170] 1实验材料与仪器

[0171] 采集当天新鲜的血小板，放入血小板保存袋中，22℃震荡保存。

[0172] Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethineoxonol，DiBAC4(3)(购自Sigma)溶于二甲基亚砜配置成10μmol/L的工作液，-20℃保存。

[0173] 短菌杆肽(Gramicidin，购自Sigma，货号50845)使用二甲基亚砜配置成2mg/mL的工作液，-20℃保存。

[0174] Hepes-Tyrodes buffer(无钙)：133mmol/L氯化钠，6mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0175] Hepes-Tyrodes buffer(高钾)：5mmol/L氯化钠，120mmol/L氯化钾，12mmol/L碳酸氢钠，1mmol/L氯化镁，0.4mmol/L磷酸二氢钠，5.5mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mol/L氢氧化钠调整pH为7.4。

[0176] 流式细胞仪(BD，FACSCalibur)；离心机(Eppendorf，5154D)。

[0177] 2实验步骤

[0178] 7)取1000μL机采血小板原液，分成2份；

[0179] 8)800g，5min离心，弃上清，PBS洗涤三次；

[0180] 9)分别使用500μL Hepes-Tyrodes buffer(5mmol/L氯化钙)和Hepes-Tyrodes buffer(高钾)重新悬浮血小板，稀释血小板至约5～10×109/L，分别标记F和F0；

[0181] 10)向F0流式管中加入终浓度为0.1μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；

[0182] 11)向F和F0流式管加入终浓度为220nmol/L DiBAC4(3)溶液(DMSO浓度不超过0.1％)，轻轻震荡，混匀；暗室室温染色15min；

[0183] 12)流式上机检测。电压设置：FSC：E-1；SSC：313；FL1：555；FL2：150；FL3：150。

[0184] 根据修正后的能斯特方程：V＝Edye＝-(RT/ZF)*ln(F/F0)，F0代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值，计算血小板跨膜电位。

[0185] 按照上述方法检测3个不同人的血小板跨膜电位，每个检测5次，计算血小板跨膜电位的平均值及方差，检验该方法的重复性。

[0186] 3实验结果

[0187] 检测得到15人份血小板膜电位平均值为-53.6±8mV，与Lawrence T.等膜片钳法所得的结果(-52±8mV)和Maclntyre所得的结果(-60mV)相似，说明该方法测定血小板膜电位的准确性较高。

[0188] 该方法的重复性检验结果见表5。结果表明该方法的重复性显著差于本发明的方法。

[0189] 表5 本实施例方法的重复性检验结果

[0190]不同人份 1(mV) 2(mV) 3(mV)
平均值 -49.0 -53.4 -52.9
方差 7.9 8.3 8.0

[0191] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

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