技术领域
[0001] 本
发明涉及显微光学技术领域，特别是一种用于人体皮肤上微观位置的重复显微镜成像系统。
背景技术
[0002] 与传统的激光扫描共聚焦显微镜类似，皮肤共聚焦显微镜是以共聚焦成像原理为
基础，融合机械、
电子学及计算机科学为一体的高
精度光学成像系统。它不但可以在像面上获得高
分辨率、高
对比度的图像，同时可以实现细微结构的三维成像功能，是目前研究皮肤及皮肤
疾病的最有效工具，受到了国内外基础医学和临床医学专家的广泛关注。目前皮肤共聚焦显微镜检测领域所用扫描头，在使用过程中将扫描头及显微镜物镜与人体皮肤贴合以后，人体皮肤与扫描头之间的相对位置无法固定，两者之间容易产生相对移动，成像过程中不仅不能保证显微镜准确对准病变部位，而且也不能保证物镜始终贴合人体皮肤。
[0003] 目前，美国Lucid公司推出了皮肤CT的系列产品，目前我国的皮肤CT市场几乎都被其垄断。其产品主要由皮肤镜与显微成像扫描头两部分构成，皮肤镜用于对患者的皮肤进行大范围可见光成像，然后使用显微成像扫描头对患者皮肤进行显微局部成像。此外皮肤显微镜可以用于观测不同的
生物响应和生物及生理过程，然而现今没有有效的办法实现对皮肤的同一位置
跟踪成像，因为以目前的技术很难实现精确
定位的功能。
发明内容
[0004] 本发明的目的是要解决
现有技术中存在的不足，提供一种用于人体皮肤上微观位置的重复显微镜成像系统。
[0005] 为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
[0006] 一种用于人体皮肤上微观位置的重复显微镜成像系统，包括计算机、控制
电路、飞秒激光、共振+振镜扫描镜、共聚焦
雪崩光电
二极管APD、双
光子荧光光电倍增管TPF PMT、二次谐波光电倍增管SHG PMT、
图像采集电路、物镜和金属临时皮肤贴膜，所述金属临时皮肤贴膜的中心设有用于露出皮肤的开放空间，开放空间的边缘设计成锯齿状；所述计算机通过控制电路调控共振+振镜扫描镜来协调飞秒
激光束在皮肤上的扫描，飞秒激光的输出光通过共振+振镜扫描镜后穿过物镜照射到位于金属临时皮肤贴膜的中心的开放空间内的皮肤上，物镜固定在成像
支架下端，成像支架安装在3轴移动平台上，共振+振镜扫描镜与物镜的后孔径之间设有多光子分色镜，照射到皮肤上的飞秒激光被皮肤吸收后产生TPF或者与皮肤作用产生SHG，TPF和SHG
信号光再次透过物镜被多光子分色镜反射后通过发射
滤波器再透过SHG/TPF分色镜被双光子荧光光电倍增管TPF PMT和二次谐波光电倍增管SHG PMT接收并通过图像采集电路产生TPF图像和SHG图像，SHG/TPF分色镜与双光子荧光光电倍增管TPF PMT和二次谐波光电倍增管SHG PMT之间均设有滤波器，飞秒激光与共振+振镜扫描镜之间设有50/50分束器，照射到皮肤的反射光经过多光子分色镜和共振+振镜扫描镜后被50/50分束器反射后被共聚焦雪崩
光电二极管APD接收并通过图像采集电路产生反射共聚焦显微RCM图像，图像采集电路获取的TPF图像、SHG图像、和共聚焦显微RCM图像被输送至计算机的显示器上实时显示，打开LED白光照明并将SHG/TPF分色镜旋转90度后就可用白光成像相机来获取皮肤表面大视场图像，该图像也被输送至计算机的显示器上实时显示。
[0007] 进一步，所述金属临时皮肤贴膜为金色或黑色。
[0008] 与现有技术相比，本发明首先用金属临时皮肤贴膜作界标以实现皮肤上相同微观位置的重定位，利用该系统的自动重定位的预测
算法进行精确重定位，可以在数天到数周的时间内对人体皮肤内同一区域细胞或微观结构反复跟踪成像；同样，本发明也适合于动物皮肤成像的应用。
附图说明
[0009] 图1为本发明的系统结构示意图。
[0010] 图2a为金属临时皮肤贴膜的结构示意图；2b为金属临时皮肤贴膜在白光成像下的图像；2c为施用于皮肤上后的金属临时皮肤贴膜的图像；2d为金属临时皮肤贴膜参考点1和2的RCM图像。
[0011] 图3为基准成像和跟踪成像的坐标转换图。
[0012] 图4a为应用实例的基准成像的SHG图像(上图)，跟踪成像微调之前(中间图像)，微调之后(下图)；4b为应用实例的人皮肤活体内三个不同深度的真皮SHG图像。
具体实施方式
[0013] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合
实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
[0014] 如图1、图2所示，本实施例的一种用于人体皮肤上微观位置的重复显微镜成像系统，包括计算机1、控制电路2、飞秒激光3、共振+振镜扫描镜4、共聚焦
雪崩光电二极管APD19、双光子荧光光电倍增管TPF PMT17、二次谐波光电倍增管SHG PMT15、图像采集电路18、白光成像相机12、物镜7和金属临时皮肤贴膜10，所述金属临时皮肤贴膜10的中心设有用于露出皮肤的开放空间101，开放空间101的边缘设计成锯齿状102；所述计算机1通过控制电路2调控共振+振镜扫描镜4来协调飞秒激光束在皮肤上的扫描，飞秒激光3的输出光通过共振+振镜扫描镜4后穿过物镜7照射到位于金属临时皮肤贴膜10的中心的开放空间101内的皮肤上，物镜7固定在成像支架6下端，成像支架6安装在3轴移动平台11上，共振+振镜扫描镜4与物镜7的后孔径之间设有多光子分色镜5，照射到皮肤上的飞秒激光被皮肤吸收后产生TPF或者与皮肤作用产生SHG，TPF和SHG信号光再次透过物镜7被多光子分色镜5反射后通过发射滤波器13再透过SHG/TPF分色镜14被双光子荧光光电倍增管TPF PMT17和二次谐波光电倍增管SHG PMT15接收并通过图像采集电路18产生TPF图像和SHG图像，SHG/TPF分色镜14与双光子荧光光电倍增管TPF PMT17之间设有第一滤波器16，SHG/TPF分色镜14与二次谐波光电倍增管SHG PMT15之间设有第二滤波器26，飞秒激光3与共振+振镜扫描镜4之间设有50/50分束器20，照射到皮肤的反射光经过多光子分色镜5和共振+振镜扫描镜4后被
50/50分束器20反射后被共聚焦雪崩光电二极管APD19接收并通过图像采集电路18产生反射共聚焦显微RCM图像，图像采集电路获取的TPF图像、SHG图像、和共聚焦显微RCM图像被输送至计算机1的显示器上实时显示，打开LED白光照明并将SHG/TPF分色镜旋转90度后就可用白光成像相机12来获取皮肤表面大视场图像，该图像也被输送至计算机1的显示器上实时显示。
[0015] 使用时，如图2a所示，金属临时皮肤贴膜10的中心设计成开放空间101，露出皮肤。用于成像的感兴趣区域(ROI)可在该开放空间内的任意位置。
[0016] 金属临时皮肤贴膜10的内边缘设计成锯齿状102，选择两个尖端(中心尖端)作为参考点分别记为参考点1和参考点2。
[0017] 金属临时皮肤贴膜10
颜色设计为两种
色调(最好是金色和黑色)。金色部分具有不同的RCM信号，可以很容易与皮肤RCM信号区分开。在白光成像下，金色和黑色部分都很容易观察到。图2a为金属临时皮肤贴膜的示意图，2b为金属临时皮肤贴膜在白光成像下的图像，2c为施用于皮肤上后的金属临时皮肤贴膜的图像，2d为金属临时皮肤贴膜10的参考点1和参考点2的RCM图像。
[0018] 金属临时皮肤贴膜10的使用：确保皮肤清洁，干燥，无油污，否则金属临时皮肤贴膜不会粘附。如果受试者的皮肤上有护肤乳液或任何护肤产品，请使用少许肥皂和
水或擦拭酒精垫清洁该区域。在贴金属临时皮肤贴膜之前，确保皮肤不会扭曲或拉伸。贴在皮肤上后用湿布压紧约30秒。
[0019] 基准成像
[0020] 步骤1：将一滴水滴在成像的皮肤上，等待约1分钟，直到皮肤湿润。用餐巾纸轻拭吸收多余的水。准备固定皮肤与物镜7的金属环8。在金属环8背面贴上环形双面胶膜，再贴上圆形盖玻片9。之后再贴上第二个环形双面胶膜。将金属环对准受试者金属临时皮肤贴膜10的中心贴上，轻轻按压皮肤约5秒钟。金属环8具有
磁性，与成像支架6相吸，通过电动驱动的千分尺驱动的3轴移动平台11控制成像位置和焦平面深度。
[0021] 步骤2：打开
LED灯和白光成像相机12。调整3轴移动平台11之z方向位置，直到整个金属临时贴膜10位于白光成像
视野(FOV)内。轻轻旋转金属环8，直到金属临时贴膜10参考点1和参考点2在视野中看起来垂直(粗调)。在白光成像操作界面中，绘制一条垂直辅助线。精调金属环
角度，直到两参考点间连线与辅助线重合，保存图像至计算机1。用螺丝固定成像金属环8和成像支架6。用滴管将水滴在物镜7和金属环8之间。移动3轴移动平台11之xy方向位置直到参考点1出现在FOV中心，关闭白色LED灯；
[0022] 步骤3：在打开RCM模式之前，检查入射激光功率是否小于10mW。调整3轴移动平台11之z方向位置找到标记上表面。如果在此期间参考点1偏离中心，请调整3轴移动平台11之xy方向位置直到它回到中心。记录参考点1坐标(x1，y1)。移动y方向位置直到参考点2出现在视野中心。记录参考点2坐标(x2，y2)。极少情况下，如果难以找到参考点2，则切换回白光模式，将参考点2置于白光成像下。切换回RCM模式，微调xy方向并记录坐标值；基准成像的坐标转换如图3所示；
[0023] 步骤4：用公式 计算中心点(Centxt0,Centyt0)。移动位移平台到中心点处。浏览中心点周围图像，然后选择ROI。记录坐标(x3,y3)。
[0024] 跟踪成像
[0025] 基准成像结束后，皮肤离开物镜7，等跟踪成像时皮肤返回到物镜7下时，标记相对于物镜7有旋转和平移，
[0026] 步骤1：参考基准成像中步骤3，找到参考点1和参考点2的位置坐标(x'1,y'1)，(x'2,y'2)，记录坐标值。
[0027] 步骤2：寻找图像ROI位置被分解成以下5个子步骤：步骤A和B是自动重定位，步骤C和D是手动微调重定位；
[0028] A、根据坐标变换自动预测算法计算预测坐标(x3t1,y3t1)，如图3所示，坐标转换的具步骤如下：
[0029] A1、寻找中心点
[0030] 基准成像中心点(Centxt0，Centyt0)和跟踪成像中心点(Centxt1，Centyt1)可以由表1计算得出。
[0031] 表1
[0032]
[0033]
[0034] A2、平移
[0035] 将中心点平移到移动平台原点。求解平移矩阵Tt0和Tt1。
[0036] A3、旋转
[0037] 在步骤A2中，用求解的平移矩阵计算参考点1，找到新坐标(x1n，y1n)(x'1n，y'1n)。求解角度θ和φ。求解旋转矩阵Rt0和Rt1。
[0038] A4、比例调整
[0039] 因为成像之前，皮肤需要贴上金属环才能与镜头固定，此时皮肤可能会有微小的拉伸/压缩。求解参考点之间的距离(Lt0，Lt1)。求解比例矩阵St1。
[0040] A5、转换
[0041] 求解转换矩阵(x3t1，y3t1)作为预测ROI坐标值。
[0042] B、移动位移平台到预测坐标位置。
[0043] C、调整3轴移动平台11之z方向位置移平台，在RCM成像模式下观测生物结构(比如血管特征，表皮真皮交界处)，并且与基准成像的结构对比。
[0044] D、如果类似，精细调整3轴移动平台11之xy方向位置直到FOV与基准图像一致。记录实验图像坐标位置。
[0045] 如果步骤D失败，将入射激光功率提高到40mW并切换到SHG模式。重复步骤C和D，直到找到相同的FOV。
[0046] 为了进一步验证本发明的精确的微观定位的准确性，采用上述系统以及用上述系统对皮肤进行基准成像和跟踪成像(基准成像一天之后的成像)，在图4a中，两次成像(基准成像和一天之后的跟踪成像)中看到了相同的结构。顶部图像(SHG)显示基准皮肤真皮中的胶原结构。在跟踪成像中，3轴移动平台11移动到预测坐标值。可以看到相同的结构。通过与基准图像比较，微调3轴移动平台11之xy位置到相同的FOV。图4b显示重定位到相同ROI的一个示例。说明本发明可以对人体内同一区域细胞或微观结构反复成像。
[0047] 本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术
变形，均落入本发明的保护范围之内。
