技术领域
[0001] 本
发明涉及医学成像技术领域，尤其是涉及一种结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法。
背景技术
[0002] 结直肠癌是我国发病率居第三位的
恶性肿瘤，且近年来发病率上升迅速。而在结直肠癌
治疗方法中，结直肠手术
切除具有重要的地位。1982年heald等提出直肠系膜的概念，将直肠周围包裹在盆筋膜脏层之内，由疏松结缔组织构成，内含丰富脂肪、淋巴、神经及血管组织等定义为直肠系膜。并以此作为直肠癌外科手术的解剖层面，提出了全直肠系膜切除术理论；2009年Hohenberger等基于TME的解剖
基础首次提出结肠及其系膜的筋膜结构是直肠外科系膜的延续，从而引出全结肠系膜切除术(complete mesocolic excision，CME)的手术理念即在直视下连续锐性分离,将脏层筋膜层从壁层分离,获得被脏层筋膜层完全包被的整个结肠系膜，并在系膜根部结扎相应的血管，以最大程度清扫区域淋巴结，减少
腹腔肿瘤播散，从而显著改善了结肠癌患者
预后。随着外科手术的进展，尤其是
腹腔镜微创外科的飞速发展，全直肠系膜切除术和全结肠系膜切除术已经分别成为中低位直肠癌手术和结肠癌手术的标准术式。
[0003] 但是，如何去评价全直肠系膜切除术和全结肠系膜切除术的标准化及规范化已经成为许多外科医生面临的临床问题，而评价TME和CME的手术根治性程度主要是通过评价术后标本结直肠系膜的完整性。现有的评价方法是将术后标本系膜根据肉眼的评估分为完整、接近完整、不完整三个层次。这种用肉眼进行评价的方法有明显的主观性且缺乏一定的准确性。
[0004] 因此，研究开发出一种对结直肠癌术后直肠系膜标本完整性进行评价的方法，进而对结直肠癌手术进行实时、精准的评价，缓解肉眼进行评价的主观性和不准确性，有助于临床工作者了解结直肠癌手术是否做到真正的全系膜切除，变得十分必要和迫切。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0006] 本发明的第一目的在于提供一种结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法，上述方法通过多
光子成像技术结合
染色切片对结直肠癌术后直肠系膜标本进行组织评价，缓解肉眼进行评价的主观性和不准确性，有助于临床工作者了解结直肠癌手术是否做到真正的全系膜切除。
[0007] 本发明提供的一种结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法，所述方法包括以下步骤：
[0008] (a)样本准备：在腹腔镜全结/直肠切除术后的切除标本中分离直肠系膜标本，标记分清系膜正
反面后进行冷藏保存，作为待测多光子成像标本；
[0009] (b)多光子胶原成像：将步骤(a)待测多光子成像标本进行固定，对整个直肠系膜样本进行二次谐波成像，得到多光子成像图；
[0010] (c)切片制备：将直肠系膜标本中的多光子成像区域进行常规蜡
块制备，每一块系膜组织中连续切取2张
组织切片，分别进行病理学HE和Masson染色；
[0011] (d)切片扫描：通过切片
扫描仪对HE和Masson染色切片进行整体切片成像，获得HE和Masson染色图像；
[0012] (e)成像分析：将步骤(b)得到的多光子成像图和步骤(d)得到的Masson染色图像进行直观
图像分析和/或导入图像分析系统，进行胶原层面分析。
[0013] 进一步的，所述步骤(a)中冷藏保存为-86℃
冰箱保存。
[0014] 进一步的，所述步骤(b)二次谐波成像为利用单通道探测器进行成像。
[0015] 更进一步的，所述步骤(b)单通道探测器的输出功率为1.5W～1.8W。
[0016] 更进一步的，所述步骤(b)二次谐波成像的成像
波长为800～820nm，接收波长为390～410nm。
[0017] 进一步的，所述步骤(b)二次谐波成像的成像倍数为10倍，成像面积为1cm×1cm。
[0018] 进一步的，所述步骤(c)蜡块制备时将直肠系膜反面朝下进行包埋。
[0019] 进一步的，所述步骤(c)中组织切片的厚度为3～8μm。
[0020] 进一步的，所述步骤(d)中Masson染色切片的成像倍数为20倍，
分辨率为0.50μm/像。
[0021] 进一步的，所述方法具体包括以下步骤：
[0022] (a)样本准备：在腹腔镜全结/直肠切除术后的切除标本中分离直肠系膜标本，标记分清系膜正反面后放置于-86℃冰箱冷藏保存，作为待测多光子成像标本；
[0023] (b)多光子胶原成像：将步骤(a)待测多光子成像标本进行固定，对整个直肠系膜样本利用单通道探测器进行二次谐波成像，得到多光子成像图，所述二次谐波成像的输出功率为1.5W～1.8W，成像波长为800～820nm，接收波长为390～410nm，所述成像倍数为10倍，成像面积为1cm×1cm；
[0024] (c)切片制备：将直肠系膜标本中的多光子成像区域的直肠系膜反面朝下进行包埋制备蜡块，每一块系膜组织中连续切取2张厚度为3～8μm组织切片，分别进行病理学HE和Masson染色；
[0025] (d)切片扫描：通过切片扫描仪对HE和Masson染色切片进行整体切片成像，获得HE和Masson染色图像，切片的成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像；
[0026] (e)成像分析：将步骤(b)得到的多光子成像图和步骤(d)得到的Masson染色图像进行直观图像分析和/或导入图像分析系统，进行胶原层面分析。
[0027] 与
现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0028] 本发明提供的结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法，上述方法通过多光子成像技术结合染色切片对结直肠癌术后直肠系膜标本进行组织评价，其中，染色切片可对直肠系膜胶原的大体结构和总体占比进行宏观分析；多光子成像可以对直肠系膜胶原进行显微成像并对胶原精细结构进行分析，本发明将两种胶原分析方式结合在一起，可以从宏观及微观两个层面区分结直肠系膜的完整性，进而有效缓解了现有的肉眼评价标准具有明显的主观性且缺乏一定的准确性的问题，有助于临床工作者了解结直肠癌手术是否做到真正的全系膜切除，从而更加规范结直肠癌根治性手术的治疗。
附图说明
[0029] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030] 图1为本发明
实施例1提供的结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法
流程图；
[0031] 图2为本发明效果例1提供的经肉眼评价得到的完整直肠系膜标本图(A为手术后标本图、B为多光子胶原成像图、C为HE染色图、D为Masson染色图)；
[0032] 图3为本发明效果例1提供的经肉眼评价得到的不完整直肠系膜标本图(A为手术后标本图、B为多光子胶原成像图、C为HE染色图、D为Masson染色图)。
具体实施方式
[0033] 下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034] 根据本发明的一个方面，一种结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法，所述方法包括以下步骤：
[0035] (a)样本准备：在腹腔镜全结/直肠切除术后的切除标本中分离直肠系膜标本，标记分清系膜正反面后进行冷藏保存，作为待测多光子成像标本；
[0036] (b)多光子胶原成像：将步骤(a)待测多光子成像标本进行固定，对整个直肠系膜样本进行二次谐波成像，得到多光子成像图；
[0037] (c)切片制备：将直肠系膜标本中的多光子成像区域进行常规蜡块制备，每一块系膜组织中连续切取2张组织切片，分别进行病理学HE和Masson染色；
[0038] (d)切片扫描：通过切片扫描仪对HE和Masson染色切片进行整体切片成像，获得HE和Masson染色图像；
[0039] (e)成像分析：将步骤(b)得到的多光子成像图和步骤(d)得到的Masson染色图像进行直观图像分析和/或导入图像分析系统，进行胶原层面分析。
[0040] 本发明中，结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法，通过切片染色结合多光子成像分析对结直肠癌术后直肠系膜标本进行组织评价，其中，染色切片可对直肠系膜胶原的大体结构和总体占比进行宏观分析；多光子成像可以对直肠系膜胶原进行显微成像并对胶原精细结构进行分析，本发明将两种胶原分析方式结合在一起，可以从宏观及微观两个层面区分结直肠系膜的完整性。上述多光子成像是一种基于非线性光学和飞秒激光镭射之上的多光子显微成像技术，通过利用活体组织中细胞自身产生的自体
荧光及非中心对称组织(如胶原)产生的二次谐波进行成像，该方法无需传统病理活检的组织切取、固定、包埋、切片、染色等步骤，便可实时快速地观察到标本的组织结构和细胞形态的目的，其具有穿透
力强、光损伤小、分辨率高等优点能对
石蜡切片、新鲜离体组织以及活体组织都可以清晰成像。因此，本发明将多光子成像技术应用于结直肠癌术后直肠系膜标本完整性评价具有广阔的应用前景和科研推广价值。
[0041] 本发明结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法有效缓解了现有的肉眼评价标准具有明显的主观性且缺乏一定的准确性的问题，有助于临床工作者了解结直肠癌手术是否做到真正的全系膜切除，从而更加规范结直肠癌根治性手术的治疗。本发明设计合理，技术成熟，简便易行，具有广阔的临床应用前景和良好的科研推广价值。
[0042] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(a)中冷藏保存为-86℃冰箱保存。
[0043] 作为一种优选的实施方式，上述步骤(a)中冷藏保存为在-86℃冰箱中保存，可以使组织切片保持更好的安全性、均匀性和
稳定性，进而使多光子成像达到更好的技术效果。
[0044] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(b)二次谐波成像为利用单通道探测器进行成像。
[0045] 在上述优选实施方式中，所述步骤(b)单通道探测器的输出功率为1.5W～1.8W。
[0046] 在上述优选实施方式中，所述步骤(b)二次谐波成像的成像波长为800～820nm，接收波长为390～410nm。
[0047] 作为一种优选的实施方式，本发明根据结直肠癌术后直肠系膜标本制得的待测切片的特点，采用特定激发波长和接受波长对多光子成像切片进行成像，可以得到更为清晰准确的二次谐波图像。
[0048] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(b)二次谐波成像的成像倍数为10倍，成像面积为1cm×1cm。
[0049] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(c)蜡块制备时将直肠系膜反面朝下进行包埋。
[0050] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(c)中组织切片的厚度为3～8μm。
[0051] 作为一种优选的实施方式，上述步骤(a)中组织切片的厚度为3～8μm更利于光学电镜以及多光子成像的观察。
[0052] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(d)中Masson染色切片的成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像。
[0053] 作为一种优选的实施方式，上述步骤(b)中Masson染色切片的扫描成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像可以使获得的Masson染色切片扫描图更加清晰。
[0054] 在本发明的一种优选实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
[0055] (a)样本准备：在腹腔镜全结/直肠切除术后的切除标本中分离直肠系膜标本，标记分清系膜正反面后放置于-86℃冰箱冷藏保存，作为待测多光子成像标本；
[0056] (b)多光子胶原成像：将步骤(a)待测多光子成像标本进行固定，对整个直肠系膜样本利用单通道探测器进行二次谐波成像，得到多光子成像图，所述二次谐波成像的输出功率为1.5W～1.8W，成像波长为800～820nm，接收波长为390～410nm，所述成像倍数为10倍，成像面积为1cm×1cm；
[0057] (c)切片制备：将直肠系膜标本中的多光子成像区域的直肠系膜反面朝下进行包埋制备蜡块，每一块系膜组织中连续切取2张厚度为3～8μm组织切片，分别进行病理学HE和Masson染色；
[0058] (d)切片扫描：通过切片扫描仪对HE和Masson染色切片进行整体切片成像，获得HE和Masson染色图像，切片的成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像；
[0059] (e)成像分析：将步骤(b)得到的多光子成像图和步骤(d)得到的Masson染色图像进行直观图像分析和/或导入图像分析系统，进行胶原层面分析。
[0060] 实施例1
[0061] 如图1所示，一种结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法，所述方法具体包括以下步骤：
[0062] (a)样本准备：在腹腔镜全结/直肠切除术后的切除标本中分离直肠系膜标本，标记分清系膜正反面后放置于-86℃冰箱冷藏保存，作为待测多光子成像标本；
[0063] (b)多光子胶原成像：将步骤(a)待测多光子成像标本进行固定，对整个直肠系膜样本利用单通道探测器进行二次谐波成像，得到多光子成像图，所述二次谐波成像的输出功率为1.5W，成像波长为800nm，接收波长为390nm，所述成像倍数为10倍，成像面积为1cm×1cm；
[0064] (c)切片制备：将直肠系膜标本中的多光子成像区域的直肠系膜反面朝下进行包埋制备蜡块，每一块系膜组织中连续切取2张厚度为3μm组织切片，分别进行病理学HE和Masson染色；
[0065] (d)切片扫描：通过切片扫描仪对HE和Masson染色切片进行整体切片成像，获得HE和Masson染色图像，切片的成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像；
[0066] (e)成像分析：将步骤(b)得到的多光子成像图和步骤(d)得到的Masson染色图像进行直观图像分析和/或导入图像分析系统，进行胶原层面分析。
[0067] 实施例2
[0068] 一种结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法，所述方法具体包括以下步骤：
[0069] (a)样本准备：在腹腔镜全结/直肠切除术后的切除标本中分离直肠系膜标本，标记分清系膜正反面后放置于-86℃冰箱冷藏保存，作为待测多光子成像标本；
[0070] (b)多光子胶原成像：将步骤(a)待测多光子成像标本进行固定，对整个直肠系膜样本利用单通道探测器进行二次谐波成像，得到多光子成像图，所述二次谐波成像的输出功率为1.8W，成像波长为820nm，接收波长为410nm，所述成像倍数为10倍，成像面积为1cm×1cm；
[0071] (c)切片制备：将直肠系膜标本中的多光子成像区域的直肠系膜反面朝下进行包埋制备蜡块，每一块系膜组织中连续切取2张厚度为3～8μm组织切片，分别进行病理学HE和Masson染色；
[0072] (d)切片扫描：通过切片扫描仪对HE和Masson染色切片进行整体切片成像，获得HE和Masson染色图像，切片的成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像；
[0073] (e)成像分析：将步骤(b)得到的多光子成像图和步骤(d)得到的Masson染色图像进行直观图像分析和/或导入图像分析系统，进行胶原层面分析。
[0074] 实施例3
[0075] 一种结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法，所述方法具体包括以下步骤：
[0076] (a)样本准备：在腹腔镜全结/直肠切除术后的切除标本中分离直肠系膜标本，标记分清系膜正反面后放置于-86℃冰箱冷藏保存，作为待测多光子成像标本；
[0077] (b)多光子胶原成像：将步骤(a)待测多光子成像标本进行固定，对整个直肠系膜样本利用单通道探测器进行二次谐波成像，得到多光子成像图，所述二次谐波成像的输出功率为1.6W，成像波长为810nm，接收波长为400nm，所述成像倍数为10倍，成像面积为1cm×1cm；
[0078] (c)切片制备：将直肠系膜标本中的多光子成像区域的直肠系膜反面朝下进行包埋制备蜡块，每一块系膜组织中连续切取2张厚度为6μm组织切片，分别进行病理学HE和Masson染色；
[0079] (d)切片扫描：通过切片扫描仪对HE和Masson染色切片进行整体切片成像，获得HE和Masson染色图像，切片的成像倍数为20倍，分辨率为0.50μm/像；
[0080] (e)成像分析：将步骤(b)得到的多光子成像图和步骤(d)得到的Masson染色图像进行直观图像分析和/或导入图像分析系统，进行胶原层面分析。
[0081] 效果例1
[0082] 为表明本发明结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法，可以直观准确的对直肠系膜标本的胶原组织进行评价，同时具有简便易行的特点。现特别使用现有的肉眼进行评估的两个直肠系膜标本进行完整性测定，其中：标本1为肉眼评价得到的完整直肠系膜标本，标本2为肉眼评价得到的不完整直肠系膜标本。
[0083] 将上述标本1和标本2分别使用本发明实施例3提供的结直肠癌术后直肠系膜标本完整性的评价方法进行评价，其中：
[0084] 如图2所示，标本1的多光子胶原成像图可见直肠系膜的胶原含量多、胶原排列呈条索状，排列整齐且完整，未见明显缺损；从上述的结果中我们可以评估出实施的直肠癌根治术效果较好，达到了根治性的直肠癌手术。
[0085] 如图3所示，标本2的多光子胶原成像图可见直肠系膜的胶原含量较少、胶原排列呈单线状，排列不整齐且不完整，可见明显的缺损；从上述的结果中我们可以评估出实施的直肠癌根治术效果较差，未达到了根治性的直肠癌手术，应规范手术治疗方法。
[0086] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
