本発明は、走査型レーザ顕微鏡の動作方法に関する。

走査型レーザ顕微鏡(LSM)では様々な出力クラスのレーザが使用される。さらに走査型レーザシステムは、検出器として用いられるかまたは照明に用いられる多数の可変のモジュールを特徴とする。

共焦点走査型顕微鏡はレーザモジュールを含んでおり、このレーザモジュールは異なる波長の照明光を生成する複数のレーザビーム源からなるのが好ましい。照明光が照明ビームとしてカップリングされるスキャン機構は、顕微鏡ユニットの顕微鏡ステージ上にある試料全域に、照明ビームをビーム偏向により案内するため、主カラースプリッタ、x−yスキャナ、およびスキャン対物レンズを備えている。これにより生成されて試料から来る測定光線は、主カラースプリッタおよび結像光学系を介し、検出チャネルの少なくとも1つの共焦点検出絞り(検出ピンホール)に向けられる。

図1では、走査型レーザ顕微鏡のこのようなビーム経路を概略的に示している。 ここで示しているモジュールは、光源、スキャンモジュール/検出ユニット、および顕微鏡である。これらのモジュールを以下でさらに詳しく説明する。加えて(特許文献1)およびツァイス(ZEISS)の走査型レーザ顕微鏡LSM 710を参照されたい。

標本中の様々な色素を特異的に励起するため、LSMでは様々な波長のレーザが用いられる。励起波長の選択は、調査すべき色素の吸収特性に基づいて決められる。励起放射線は光源モジュール内で生成される。ここでは様々なレーザ(アルゴン、アルゴン・クリプトン、TiSaレーザ)が使用される。さらに光源モジュールでは、例えば音響光学結晶(AOTF)の使用により、波長の選別および必要な励起波長の強度調整が行われる。続いてレーザ放射線は、ファイバまたは適切なミラー構成要素を介してスキャンモジュール内に達する。

光源で生成されたレーザ放射線は、スキャナ、スキャン光学系、および結像レンズを介し、対物レンズにより回折限界で標本内に合焦される。焦点は点状で、試料をx−y方向にラスタ走査する。試料全域をスキャンする際の1ピクセル滞在時間はたいてい1マイクロ秒未満〜数百マイクロ秒までの範囲内である。

蛍光の共焦点検出(デスキャン検出)の際、焦点面(Specimen)から、ならびにその上およびその下にある平面から放出される光は、スキャナを介してダイクロイック・ビームスプリッタ(MD)に達する。このビームスプリッタは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、焦点面に対する共役面内に正確に存在する絞り(共焦点の絞り/ピンホール)上に合焦される。これにより、焦点外の蛍光部分が抑制される。絞りサイズの変更により、顕微鏡の光学解像度を調整することができる。絞りの後ろにはもう1つのダイクロイック・ブロックフィルタ(EF)が存在しており、このダイクロイック・ブロックフィルタが再度、励起放射線を抑制する。ブロックフィルタの通過後、蛍光は点検出器(PMT)によって測定される。

多光子吸収を使用する場合、色素の蛍光の励起は、励起強度が特に高い小さな体積内で行われる。この領域は、共焦点構成要素を使用する場合に検出される領域よりほんの少し大きいだけである。したがって、共焦点絞りの使用をやめることができ、かつ検出を対物レンズの直後に行うことができる(非デスキャン検出)。

さらに、多光子吸収によって励起された色素の蛍光を検出するためのもう1つの構成要素では、デスキャン検出が行われ、ただし、ここでは対物レンズの瞳が検出ユニット内に結像される(非共焦点デスキャン検出)。

両方の検出構成要素により、対応する1光子吸収または多光子吸収と関連して、3次元に照らし出された画像から対物レンズの焦点面にある平面(光学的断面)だけが再現される。試料の様々な深さzのx−y平面で複数の光学的断面を撮影することにより、その後、計算機を用いて試料の3次元画像を生じさせることができる。

したがって、LSMは厚い標本の調査に適している。励起波長は、特異的な吸収特性を有する使用される色素によって決定される。色素の放出特性に合わせたダイクロイック・フィルタが、その時々の色素から発せられる蛍光だけが点検出器によって測定されることを保証する。

中心的な制御ユニットAは、信号線を介して非常に重要な顕微鏡コンポーネントと接続されている。例えば、レーザ源の後ろに配置された音響光学フィルタ(AOTF)を介し、使用されるレーザおよびその強度の制御を行い、かつ接続されたPMTを介し、試料画像を生成するために検出用部分ビーム経路内で検出光の捕捉および加工を、捕捉されたスキャナ位置およびそれと結びつけられた試料上での照明光の位置に応じて行う。

生物医学的応用においては、複数の様々な細胞領域を様々な色素で同時に標識することもある(マルチ蛍光)。個々の色素は、現況技術により様々な吸収特性または放出特性(スペクトル)に基づいて別々に検出することができる。このために、副ビームスプリッタ(DBS)により追加的に複数の色素の蛍光の分割が行われ、かつ別々の点検出器(PMTx)において個々の色素放出の別々の検出が行われる。

その際、PMTには広い範囲での高い感度が必要である。 これに関し、たいていの方法におけるダイナミックレンジは検出器の適合性の範囲をはるかに超えている。このようなケースは、例えばFRAP実験で起こる(例えば非特許文献1を参照)。ここでは、試料が蛍光において、つまり非常に少ない光が、検出器上で観察され、したがって、加工可能な信号を得るために大きな高電圧による高い増幅が必要になる。これとは対照的に非常に多くの光により、試料に作用する退色工程が短い間隔で隣接する。その後、すぐに再び蛍光モードにおいて測定される。退色工程に対し、検出器を非常に多くの光から保護しなければならない。そうしなければ、破損(曇り)または次の測定のための検出器のための長い回復時間という結果になるからである。この過程は非常に頻繁に繰り返される。検出器を保護するには、退色工程の前にその都度、検出器の前で機械的なシャッタを用いることができ、または高電圧を制御電圧により低い値に降下させる。これらのやり方で検出器の保護は確実にされるが、切替え工程の間の待機時間が約0.5秒〜1秒と長すぎる。機械的なシャッタは追加的な設置空間を必要とし、かつ追加的な費用を発生させる。この転換はしばしば数千回行われ、したがって機器の生産性要素になる。大規模な実験を短い時間で終えられるよう、測定工程と退色工程の間の待機時間は減らされるのが望ましい。

これまでは制御可能な高電圧発生器が使用されており、高電圧発生器は、このような実験のためにまずは降下させなければならない。これは事情によっては数百ミリ秒かかる。高電圧発生器を改めて上昇させるのにも半秒以上かかる。図2では、このような高電圧発生器のスイッチオン時の起動曲線(U(t))の例を示している。同様にPMTを保護するために、PMTの個々のダイノードの転極、短絡、および遮断(特許文献2、特許文献3、特許文献4、特許文献5、特許文献6)または陽極信号に応じた高電圧の的確な調節(特許文献7、特許文献8、特許文献9)がしばしば利用される。これは確かに陽極の迅速な保護を保証するが、この時点では依然としてダイノードまたは陰極に高電圧が印加しているので、その際、陰極は常に十分には保護されない。PMT内の真空は理想的な真空ではないので、ダイノード/陰極に引き続き当たる光により残留ガスがイオン化される可能性があり、これにより、陰極が老朽化する可能性があり、専門家の間ではイオンフィードバックと呼ばれている。

独国特許出願公開第19702753号明細書

米国特許第3821546号明細書

米国特許第4367404号明細書

独国特許第4105376号明細書

独国特許出願公開第102007004598号明細書

独国特許出願公開第102009060309号明細書

米国特許第3694659号明細書

独国特許第3278295号明細書

独国特許第4417529号明細書

特表2014−522995号明細書

ツァイス(ZEISS)社 LSM 710NLO、LSM 780NLOのパンフレット、2010年3月

本発明によって解決すべき問題は、できるだけ短い実験時間の場合に、例えばFRAP実験の際に、非常に短い時間での高い反復率を達成するため、少ない手間でPMTの最大限の保護を保証することにある。

本発明は独立請求項の特徴によって特徴づけられる。 好ましい変形形態は従属請求項の対象である。 高電圧線に直接的にスイッチを取り付けることにより、高電圧源を一定に保つことができ、変化させることがないので、高電圧源を直接的に変調するよりかなり速いスイッチオンおよびオフ時間が実現可能である。これに加え、高電圧線内の高電圧スイッチにより、高電圧が即座に遮断されるのでPMTの光電陰極を包括的に保護することができる。これによりイオンフィードバック効果が最小限に減らされる。したがって、例えば機械的なシャッタのような面倒で遅い解決策をやめることができる。その上、本発明は製造費用を低下させ、かつLSM内の機械的なシャッタの廃止により所要スペースを減少させ、かつ例えばFRAP実験のような、顧客のためのより高速で確実な実験を可能にする。ダイノード接点がスイッチングのために導出されている改変されたPMTフレームも必要ない。したがって、これまでのすべてのPMTを使用することができ、追加的な手間は必要ない。

特に有利な1つの実施形態では、高電圧線内のスイッチの作動が、走査型レーザ顕微鏡の制御ユニットにより直接的に、時間的に制御され、制御ユニットは上で詳述したように、照明要素および検出要素のようなすべての制御可能な顕微鏡コンポーネントとも接続されている。この時間的な制御は、高いレーザ強度での退色工程のために高電圧をスイッチオフし、それから退色工程の終了時またはその少し後に高電圧を再びスイッチオンし、したがって、用いられているPMTにより、検出光の強度の低い上述の蛍光モードに高電圧が対応するように行われる。

つまり、PMTを上で言及した欠点に対して完全に保護することができ、それにもかかわらず、例えば複数のFRAP測定の一連を高速に次々と行えることが有利である。 このために、用いられるレーザ波長およびその強度を制御する顕微鏡の制御ユニットと高電圧スイッチを接続する信号線が設けられている。

走査型レーザ顕微鏡のビーム経路の概略図。

高電圧発生器のスイッチオン時の起動曲線(U(t))の例を示す図。

一般的に使用されているPMTを示す図。

印加高電圧を生成する高電圧モジュールHXを示す図。

印加高電圧を生成する高電圧モジュールHXを示す図。

以下に、図3および図4に基づいて本発明をさらに説明する。 図3には、一般的に使用されているPMTを示している。光子pが陰極層Kに達し、この陰極層上で生成された光電子が、抵抗カスケードRと接続している複数のダイノードDによって増幅されてPMTの測定出力部MAに達する。

たいていの市販のPMTはそのハウジングGの外では、ハウジングGの内部に配置されたダイノードチェーンによる増幅のために印加される高電圧のためのプラス端子およびマイナス端子だけを備えており、ダイノードチェーンにはたいてい外からはアクセスできない。

本発明により、いまや高電圧線内で、ここでは陰極に至るライン内で、有利なオンおよびオフスイッチSCHが配置されており、高電圧線は信号線Sを介し、使用される顕微鏡の図1に示した制御ユニットと接続されており、これにより制御ユニットは、高強度のレーザ光による試料への作用に依存する顕微鏡の測定工程の時間的な状況に対応して、高電圧をスイッチオンおよびオフすることができる。

さらに図4aおよび図4bでは、印加高電圧を生成する高電圧モジュールHXを示している。 図4aでは、高電圧スイッチ、例えばリード・リレー(RR)が、HVの出力部で、PMT(図3を参照)の方向への高電圧リレー(例えばGigavac社のGR2DNA)として設けられている。

図4bではスイッチ機能が、高電圧に適した半導体スイッチHLSによって実現されている(例えばVoltage Multipliers社のOC025)。 本発明は、PMT検出器を使用するすべての顕微鏡システムにおいて効力を生じ得ることが有利である。

A…制御ユニット、SCH…スイッチ、S…信号線。