技术领域
[0001] 本
发明涉及一种颗粒分析仪，更具体而言，本发明涉及分析颗粒如
生物颗粒的方法和装置。
背景技术
[0002] 生物化学和生物技术领域的多种现代技术都是以分析生物颗粒如细胞为
基础。与颗粒的类型和种类，以及颗粒的状态如活
力相关的多种参数都属于常规被研究的参数和性质。关于细胞内状态的进一步信息也经常被检测。在本领域中，冷光检测法，如荧光检测法，已经得到了广泛应用，主要归因于其固有的特异性及灵敏度。
[0003] 对材料，例如
生物材料的
光致发光分析是基于以给定
波长的光(激发光)照射样品，并在另一基本上不同的波长处收集从该样品、该样品某部分或组分发射出来的光(发射光)。激发光和发射光之间的波长差(通常称作
斯托克斯位移)是被分析样品的一种特性，更概括地说是样品中存在的光致发光分子的特性。如果斯托克位移大到足以使激发光和发射光基本上光学分离，则可以应用光致发光法对材料进行分析。
[0004] 光致发光的发射光(如
磷光或荧光)往往比激发光强度低，通常低几个数量级。发射光是在“黑暗”下检测的事实使该方法更为适用，因为许多市售检测器对“黑暗”的
反应性低而对撞击检测器的光(如
光子)的反应性相当高。尽管如此，灵敏度提升，例如表示为发射光增加，往往是一种有利的特性，因此目前在
现有技术中存在着大量实现该目的的方法。
[0005] 产生发射光的几率与和光致发光分子相互作用的光子数量成比例，因此增加激发光强度通常会使发射光的量增加。一种常用的增加激发强度的方法是使用激光，激光可以用在某些发射光的量很强大的装置中，这不仅因为发射光的量(例如表示为能流)相当大，而且因为来自激光的光易于聚焦在小范围上，从而产生高的光
密度(例如表示为单位面积的发射
能量)。
[0006] 另一种用于照射光致发光材料的方法是使用分散
光源，例如灯或发光
二极管。此类光源的优点是它们发射出分散光，可以照射相当大的面积。这些光源的一个共同的缺点往往是在获得很高程度的效率同时，该样品材料的均匀照射度相对较差，该效率由撞击该样品材料的发射光分数所限定。
[0007] 通常优选用于生物分析的设备是
显微镜，为了获得不同放大率通常配备两个或更多个物镜。此外，荧光检测需要特定波长的激发和发射滤光器。显微镜操作在一定程度上是自动化的，主要是实施
图像分析。然而，即便有了这种自动化，显微镜的操作主要还是人工作业，需充分培训操作人员。
[0008] 自动化流式细胞仪也用于分析诸如细胞等的颗粒。流式细胞仪是一大类设备的统称，它们的特征在于分析处于流动条件下的颗粒，这些条件通常可以每次分析一个单个颗粒。某些类型的流式细胞仪可对能获取的生物颗粒进行复杂的分析，但是流式细胞仪因为操作通常要求操作人员相当多的技能而难以使用。
[0009] 本发明中的装置和方法也涉及细胞活力领域。细胞活力的测定对评估如药品、环境污染物、
温度、离子极值和
辐射等对细胞和组织的影响非常重要。细胞膜完整性通常被用作细胞活力的指标。膜完整性缺失的一个特征是形成了允许低分子量分子(MW＜小于2000道尔顿)进出细胞的孔。渗透性增强是许多细胞活力分析的基础。最常用的活力测量方法51
有 Cr释放法、台盼蓝拒染法以及不同
荧光染料结合，以检测活细胞和死细胞。美国
专利No.6,403,378描述了一种基于膜完整性的方法，该方法使用两种荧光染料，一种标记细胞膜受损的所有死细胞，而另一种标记所有活细胞。为了使用两种染料法获得不同细胞群和密度的可靠结果，关键是小心控制每种染料的用量以及用于使细胞
染色的培养时间。活细胞的
细胞质以及细胞核中不存在碘化丙锭(PI)和溴化乙锭(EB)，因此它们被认为是最常用的死细胞染色荧光示踪物。相反，吖啶橙(AO)和Hoechst-33342容易被活细胞吸收，因此常被用作活细胞染色的荧光探针。
[0010] 吖啶橙(IUPAC名称：N，N，N’，N-四甲基吖啶-3，6-二胺，同义名：
碱性橙3RN、Euchrysine、Aridine Orange NO、Rhodulin Orange NO、Waxoline Orange等)是一种核酸选择性荧光阳离子染料，其通过嵌入或静电吸引与DNA和RNA相互作用。当与双链DNA和RNA结合时，吖啶橙的最大激发在502nm，最大发射在525nm。当它与单链核酸结合时，最大激发转移到460nm，最大发射转移到650nm。也已知不同形式的吖啶橙显示吸光度和荧光特性的改变。溶液中的
单体染料显示绿色荧光，而以多聚体结构存在的堆叠的吖啶橙则发射出红光(Kapuscinski et al.，1982：Luminescence of the solid complexes of acridine orange with RNA.Cytometry 2，pp.201-211)。这种变化是由于单个吖啶橙分子间共振能量转移的浓度依赖性增加，而溶液中吖啶橙浓度增加将引起绿光发射的逐渐淬灭(Millot et al.，1997：Characterization of Acidic Vesicles in Multidrug-resistant and Sensitive Cancer Cells by Acridine Orange Staining and Confocal Microspectrofluorometry.The Journal of Histochemistry & Cytochemistry45(9)：pp.1255-1264)。吖啶橙也可进入酸性腔室如溶酶体中并被质子化和被螯合。在这些低pH条件下，当用蓝光照射时，染料会发射出红光。总而言之，这显示了吖啶橙的荧光发射
光谱受到许多因素影响，包括多核苷酸的总体二级结构、pH和吖啶橙的浓度。
[0011] DAPI或4′，6-二脒基-2-苯基吲哚是另一种荧光染料，其已被描述为细胞渗透性的并且可用于活细胞的染色(如Betty I.Tarnowski；Francis G.Spinale；James H，Nicholson.1991.Biotechnic and Histochemistry，66：296-302)。然而，经我们实验室认真研究显示，DAPI渗透细胞的动力学相当慢。因此，通过控制浓度和培养时间，DAPI可以用作无活力细胞染色的探针并因此可以用于区分活细胞和死细胞。DAPI优先结合双链DNA并连接到小沟的AT簇上。当结合到双链DNA时，它的最大吸收是在358nm，并且它的最大发射是在461nm。当DAPI结合DNA时产生的荧光增强了20倍。DAPI也可结合RNA，只是结合的模式不同。DAPI/RNA复合物的发射峰红移到约500nm，且其量子产量只有DAPI/DNA复合物的20％。
[0012] 先前没有提出或证实吖啶橙与DAPI的结合可适用于细胞活力的同步或双色荧光分析。
[0013] 本发明的装置和方法还涉及
转染领域。转染，将外源核酸(DNA或RNA)引入到真核细胞中，是研究活细胞中基因和
蛋白质功能的一种常用且重要的实验方法。
细胞转染的可用方法有很多，如将核酸与DEAE右旋糖苷或
磷酸钙形成复合物，通过胞吞作用或电穿孔被细胞摄取，电穿孔是采用
电压脉冲在质膜上形成核酸可以进入的孔。然而，多数转染方法都包括形成核酸和阳离子脂质的复合物，然后与细胞融合并将DNA/RNA传递到胞质中。尽管是常规方法，转染仍需要优化分析条件用于不同的细胞类型。测定细胞种群转染效率的方法有很多。大多是监测荧光、冷光或比色报告基因的表达。报告基因可与目的基因存在于同一载体中，或者在分开的载体中。常用于测量转染效率的报告基因是自动荧光蛋白，如分离自
水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(GFP)和由海葵Discosoma striata产生的红色荧光蛋白(RFP)，二者均可用于活细胞分析且其荧光的产生不需要基质。当被蓝
光激发时，GFP发射绿光；而当被绿光激发时，RFP发射橙/红光。此外，GFP与适用的染料相结合可用于多元分析以评估例如活力、细胞毒性和细胞凋亡。
[0014] 另一种监测转染效率的方法采用荧
光标记的核酸如Cy5-标记的si-RNA作为报告子，以优化RNAi沉默实验。
[0015] 在一种分析方法中，用DACM和碘化丙锭(PI)培养GFP转染细胞。DACM与硫醇反应，以在活细胞中产生蓝色荧光产物，而其反应水平在垂死/死亡的细胞中很低。相反，PI只能渗透膜受损的细胞，因此只能标记死细胞的DNA。以DACM标记的细胞是通过UV/紫光激发并测量蓝光来检测，而用PI标记的细胞是通过绿光激发并测量发射的红光来检测。表达GFP的细胞(转染细胞)是通过蓝光激发并测量绿光来监测。从这些数据中可以提取有关转染效率以及例如活力的信息。
[0016] 在另一种分析方法中，用DACM和吖啶同源二聚体培养RFP转染细胞。吖啶同源二聚体只能渗透膜受损的细胞，因此只能标记死细胞。以DACM标记的活细胞是通过UV/紫光激发并测量蓝光来检测，而用吖啶同源二聚体标记的死细胞是通过蓝光激发并测量发射的绿光来检测。表达RFP的细胞(转染细胞)是通过绿光激发并测量红光来监测。从这些数据中可以获得有关转染效率以及例如活力的信息。
[0017] 在第三种分析方法中，用DACM和PI来培养用si-RNA转染、以绿色荧光团如FITC标记的细胞。用DACM标记的活细胞是通过UV/紫光激发并测量蓝光来检测，而用PI标记的死细胞是通过绿光激发并测量发射的红光来检测。含有si-RNA的细胞(转染细胞)是通过蓝光激发并测量绿光来监测。从这些数据中可以提出有关转染效率以及例如活力的信息。
[0018] 先前没有提出或者证实在核苷酸转染的细胞种群中，硫醇-反应
试剂与细胞不渗透性的DNA染色剂相结合可同时用于转染效率、细胞活力和细胞毒性分析。
[0019] 本发明的装置和方法还涉及细胞周期领域。细胞周期代表真核细胞中最基本且重要的过程。事件的有序集合，以细胞生长并分裂为两个子细胞为终点，细胞周期通过多种细胞周期调控因子的确定的时间和空间表达、
定位及破坏而受到严格的调控。细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是主要的细胞周期控制
开关，促使细胞从G1期到S期或从G2期到M期运转。在某一给定种群中，细胞分布在细胞周期的三个主要时期：G1/G0期(每个细胞有一套
配对的染色体)，S期(DNA合成，带有不同的DNA量)，以及G/M期(细胞分裂前，每个细胞有两套配对的染色体)。
[0020] 最常用的确定细胞周期阶段的方法是以测量细胞内的DNA含量为基础。DNA含量可用荧光、DNA选择性染色剂来测定，它们展示了与DNA
质量成比例的发射
信号。细胞内的荧光通过流式细胞仪、图像或激光扫描细胞仪测量。这种分析通常是用一种细胞不渗透性的核酸染色剂在渗透化或固定化的细胞上进行，但也可使用活细胞和细胞渗透性的核酸
着色剂。
[0021] 因为
肿瘤形成中常常发生细胞周期失调，因此从中开发新抗癌剂以及改进
治疗方法成为了强烈关注的焦点。细胞周期分析已经应用到众多生命科学研究和药物开发领域，包括肿瘤生物学、细胞凋亡分析、药物筛选和测量细胞培养物的
健康状态，如
生物反应器中的培养物。
[0022] DAPI是一种出色的用于测量细胞周期阶段的染料。然而，DAPI的激发需要紫外光源，而标准的流式细胞仪通常不具有紫外光源，阻碍了DAPI的应用。
[0023] 本发明的装置和方法还涉及细胞死亡领域。细胞死亡可通过两种不同的机制发生，
坏死或凋亡。当细胞暴露在严酷的物理或化学胁迫(如低温，缺
氧)下会出现坏死，而细胞凋亡是一种受到严格控制的生化过程，通过该过程使细胞消除，且细胞积极地参与了其自身的终结过程(“细胞自杀”)。凋亡是多种主要程序化细胞死亡中的一种，发生在多细胞器官中并以一系列导致多种形态学改变的事件为特征，包括形成水泡、细胞核破裂、染色质凝聚、细胞皱缩、细胞膜失去对称性以及膜磷脂酰丝
氨酸(PS)从质膜的内叶迁移到外叶。
[0024] 凋亡是非常复杂且非常重要的过程，凋亡机制的失调可导致非常严重的
疾病。越来越多的证据显示，即便并非所有类型的肿瘤，但绝大多数肿瘤都具有抗凋亡的特性。此外，凋亡信号途径的
缺陷引起肿瘤细胞的药物抗性。另一方面，凋亡过程过度活化也可能导致疾病，如见于帕金森氏症和阿尔茨海默氏病等神经退行性疾病，其中细胞凋亡被认为是细胞死亡和神经元不断损失的主要原因。
[0025] 由于细胞凋亡在包括胚胎形成、衰老和多种疾病的众多生物过程中扮演了非常重要的
角色，这种程序性细胞死亡成为了很多研究的课题，因此期望开发容易检测和分析细胞凋亡的工具。
发明内容
[0026] 本发明的一个实施方式涉及一种检测样品的荧光的装置，所述装置包括一可使样品设在其上的样品板，一包括至少一个照射样品的光源的激发光单元以及一包括至少一个检测器的检测单元，该检测器具有至少100,000种活性检测元件以检测样品的荧
光信号。
[0027] 本发明的另一个实施方式涉及一种照射样品的装置，所述装置包括一具有照射区的样品板，样品排列于该照射区上；一具有产生激发光光源的激发光单元；一包括透镜装置的光学系统，具有微透镜阵列，其中该微透镜阵列包括以二维形式排列的多个透镜，以接收激发光和生成朝向照射区的照射光；其中，透镜单元产生均匀的照射光，以高的照射效率被投射到样品板的照射区上。
[0028] 本发明的一个实施方式中，阐述了一种用于照射样品的方法。该方法包括将样品2
排列于具有至少0.5mm 照射区的样品板上；用带光源的激发单元产生激发光；以及用透镜单元产生朝向照射区的照射光，该透镜单元包括微透镜阵列，具有以二维形式排列的多个透镜；其中，透镜单元产生均匀的照射光，以高的照射效率被投射到样品板的照射区上。
[0029] 本发明的另一个实施方式中，描述了一种用于检测来自样品的荧光的方法。所述方法包括将样品排列于样品板上，用具有至少一个光源的激发光单元，以激发光照射样品，以及用包括至少一个检测器的检测单元检测来自样品的荧光信号，该检测器至少具有100,000种活性检测元件。
附图说明
[0030] 从以下详细说明结合附图可以更好地理解本发明的实施方式及其优点，其中：
[0031] 图1显示一种照射样品的光源及现有的将照射光聚焦在样品材料上的装置系统；
[0032] 图2显示一种用微透镜阵列照射样品材料的系统；
[0033] 图3显示两种照射样品材料的方法的对比；
[0034] 图4显示本发明的一个实施方式；
[0035] 图5显示本发明的照明区的大小；
[0036] 图6显示本发明的微透镜阵列元件；
[0037] 图7显示：A)一种装置的排列，其中各单元排列在、或基本上排列在光致发光成像系统的光轴上，优选的排列方式是照射光直接朝向成像系统的检测器单元；以及B)一种排列，其中各单元基本上是偏离光致发光成像系统的光轴排列，优选的排列方式是包括一双色镜，其将照射光沿着成像系统的轴反射到样品上；
[0038] 图8显示：A)由该装置(2×放大率)生成的Jurkat、HEK293、S2和Sf9细胞培养物的图像。每板显示相同细胞的图像：左，AO；右，DAPI；以及B)由该装置(2×放大率)生成的Jurkat细胞培养物的图像。每板显示相同细胞的图像：上，AO；中，DAPI；下，上述两个图像的
叠加；
[0039] 图9显示Jurkat细胞用DAPI着色并用UV带通滤光器以40×放大率显微成像的荧光显微图。每板显示相同细胞的图像：左，
相位差；右，DAPI；
[0040] 图10显示Jurkat细胞以20×放大率显微成像的荧光显微图。A)相差，B)PI染色细胞(绿色长通
滤波器)，C)DAPI染色细胞(UV带通滤光器)；
[0041] 图11显示由该装置(2×放大率)生成的分离的原代小鼠脾细胞、小鼠骨髓细胞和人血细胞的图像。每板显示相同细胞的图像：左：AO；右：DAPI；
[0042] 图12显示：A)显示了用DACM染色的HEK293细胞。B)显示了用CMV-RFP融合蛋白转染的HEK293细胞。C)图像A和B的结合，色标：蓝色：DACM，红色：RFP；
[0043] 图13显示：A)用PI染色的MCF-7EC3细胞。B)用DACM染色的MCF-7EC3细胞。C)表达GFP的MCF-7EC3细胞。D)图A、B和C的结合(色标：红色：PI，蓝色：DACM，绿色：
GFP)；
[0044] 图14显示GFP转染的与未转染的MCF-7细胞的混合物。色标：红色：PI(绿色长通)，绿色：GFP(蓝色带通)和蓝色：DACM(UV带通)；
[0045] 图15显示用本发明的装置和FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciences)进行细胞内DNA的定量。MCF-7细胞用
乙醇固定后，用RNA酶A处理，并用碘化丙锭染色，之后用所述装置(A+B)和流式细胞仪(C)分析。A)所述装置(2×放大率)捕获的图像；B)由所述装置获得的DNA含量柱状图，其显示荧光强度为细胞数的函数；C)由FACSCalibur获得的DNA含量柱状图；
[0046] 图16显示用本发明的装置对DAPI和PI染色的细胞内DNA定量的对比。DNA含量柱状图由所述装置获得，其显示荧光强度为细胞数的函数；上板：在用所述装置分析前，用乙醇固定后，用RNA酶A处理，并用碘化丙锭染色的JM细胞。下板：在用所述装置分析前，用乙醇固定后，并用DAPI染色的JM细胞。
[0047] 图17显示用不同药物处理的JM细胞DNA柱状图。细胞内DNA含量分别用本发明TM的装置(灰色柱状图)和FACSCalibur (白色柱状图)测量；
[0048] 图18显示
酵母细胞(Schizosaccharomyces pombe)的DNA柱状图。细胞内DNATM含量分别用本发明的装置(灰色柱状图)和FACSCalibur (白色柱状图)测量。A)Eg892，在无氮条件下于36℃培养4小时。B)Eg544，在无氮条件下于30℃培养3小时。C)Eg892，在有氮条件下于36℃培养4小时。D)Eg816，在有氮条件下于36℃培养4小时(与A-C相比刻度不同)；
[0049] 图19显示：左：用AlexaFluor 488-标记的膜联蛋白V染色的凋亡细胞。右：用PI染色的无活力的细胞。图像是用本发明的装置以2×放大率捕获；
[0050] 图20显示是用喜树碱处理并用AF-488标记的膜联蛋白以及PI染色的Jurkat细胞的荧光显微图和相差。细胞是在40×放大率下显微成像；
[0051] 图21显示用不同药物处理的CHO细胞(左板)和JM细胞(右板)的DNA柱状图。CHO细胞和JM细胞分别在诺考达唑和喜树碱存在或不存在的条件下生长。细胞用DAPI染色，并且用本发明的装置对DNA含量进行定量。处于M期和S期的细胞如图所示。含有
片段化DNA(少于2C DNA含量)的细胞标记为sub-G1细胞；
[0052] 图22显示用本发明的装置，以2×数码和2×光学放大率捕获的图像。细胞用AF594-膜联蛋白V缀合物染色(凋亡细胞，红色)，以及用DACM(活细胞，蓝色)和SYTOX绿(无活力的细胞，绿色)共染色。A)未处理的Jurkat细胞；少于10％AF594-膜联蛋白V缀合物阳性细胞。B)经诺考达唑处理的Jurkat细胞；约40％AF594-膜联蛋白V缀合物阳性细胞。C)和D)结果框分别显示未处理和经诺考达唑处理的细胞的膜联蛋白V阳性细胞的百分比、无活力的细胞数以及总细胞数；
[0053] 图23显示用本发明的装置以8×放大率捕获的图像。细胞用DACM(活细胞，蓝色)、SR-VAD-FMK多聚caspase FLICA(凋亡细胞，红色)以及SYTOX绿(无活力的细胞，绿色)染色。左栏显示未经处理的CHO细胞，右栏显示经诺考达唑处理的细胞；
[0054] 图24显示用JC-1和DAPI染色的Jurkat细胞。细胞分别在不存在(左上)或者存在10μM喜树碱(CPT)(右上)的条件下于37℃生长5小时。细胞用2.5μg/ml JC-1于37℃染色10分钟，用PBS冲洗，重悬于PBS+1μg/ml DAPI中，并用本发明的装置进行分析。
在该
实施例中，未处理的Jurkat细胞中20％的去极化/凋亡，而CPT-处理的Jurkat细胞有60％的去极化/凋亡(A)。DAPI阳性细胞计数显示两种样品的细胞活力相似，接近96％(B)。(C)显示CTP-处理的样品中获得的图像；以及
[0055] 图25显示：A)来自人血的CD3阳性T细胞的反差图像，用R-藻红蛋白(PE)二级缀合物标记(红色/粉红色)。为了观察到所有活细胞，细胞样品用DACM(蓝色)共染色。B)柱状图显示PE阳性细胞的荧光强度。C)结果框中总结了所获得的信息，包括阳性细胞的百分比、总细胞数、PE平均荧光强度、标准差和总数(main number)。所有数据均是用本发明的装置及相关
软件获得。
[0056] 发明详细说明
[0057] 参考详细说明并结合所提供的附图，本发明的目的和优势对本领域技术人员本来说是显而易见的。
[0058] 根据本发明的一个实施方式，用于分析样品的装置包括其上可放置样品的样品板，；包括至少一个照射样品的光源的激发光单元；以及包括至少一个检测器的检测单元，该检测器具有至少100,000个活性检测元件以检测来自样品的荧光信号。
[0059] 被分析的样品可以是固体、或基本上是固体，或者是液体样品。样品包含颗粒，所述颗粒选自动物细胞，如
哺乳动物、昆虫和鱼细胞，选自
真菌细胞，如酵母菌细胞，以及选自细菌。
[0060] 本发明的一个实施方式中，颗粒本身、颗粒上或内部包含的材料具有光致发光活性，当样品被激发光照射时能产生荧光信号。在本发明的另一个实施方式中，颗粒用光致发光活性材料，优选荧光材料标记。
[0061] 用来自光源的激发光照射样品或样品的某一部分，光源通常是发射基本上很窄的波长带的光。在一个优选的实施方式中，用于照射样品的光源包括
发光二极管和/或
激光二极管。光源也可选自固态光源和热光源。固态光源的一个被高度推崇的特性是它相当高的照射效力，特别是当在一个限定的光带进行照射时。这在荧光分析中是很典型的，其中优选90％或更高的照射光在小于50nm的波长带发射，例如40nm或更小，更优选在小于20nm的波长带，例如10nm或更小，或者5nm或更小。特别地，优选的是激光和激光二极管波长带小于5nm，如波长带为2nm或更小，更优选波长带为1nm或更小。固态光源的另一个被高度推崇的特性是其运转时间长，如有效运转寿命长。例如，发光二极管和激光二极管的运转时间超过2000小时，如4000小时或更高，优选8000小时或更高。
[0062] 光源可以选自分散光源、发光二极管、激光二极管、激光、热光源以及固态光源。进一步地，在本发明的另一个实施方式中，激发光单元包括多个发射不同波长光的光源，包括如至少两个不同的光源，如四个不同的光源，如至少六个不同的光源，如至少八个不同的光源，如至少10个不同的光源。
[0063] 本发明的一个实施方式中，以一种方式照射被分析的样品或样品某一部分，使得照射强度的变化小于预定值，而同时照射效率却高于预定值，照射效率定义为来自光源的发射光照射到被分析样品或样品部分的分数。
[0064] 根据本发明的一个实施方式，用具有微透镜阵列的透镜单元照射样品，其中微透镜阵列包括以二维方式排列的多个透镜，以接收激发光并且产生朝向样品板的照射区的照射光。透镜单元产生均匀的照射光，被以高的照射效率投射到样品板的照射区。
[0065] 本发明的一个实施方式中，聚焦于微透镜阵列上的激发光的发散角为0.1mrad或更小，优选0.05mrad或更小，更优选0.02mrad或更小。微透镜阵列的多个透镜中的每个透镜产生与分析样品区尺寸相似的图像，优选地，产生的图像基本上是矩形的。微透镜阵列的多个透镜包括至少4个透镜，优选多于4个透镜，更优选多于50个透镜元件，更优选多于100个透镜。这些透镜是成排排列的半球形透镜，优选地将两个所述排设为一系列，从而形成透镜的阵列。透镜的尺寸为0.5至3mm，优选1至2mm。微透镜阵列的尺寸小于20mm，该尺寸是透镜阵列在垂直于激发样品光轴方向上的直径。
[0066] 本发明的另一个实施方式中，透镜单元包括第一微透镜阵列，相对的方向上有第二微透镜阵列。第一微透镜阵列和第二微透镜阵列的选择是基于加强照射效率和/或减小照射变化和/或将单独的光学元件的光学特征整合到透镜阵列的光学效果中。微透镜阵列封装在盒子中，该盒子包括用于排列和固定微透镜阵列的工具。该盒子通常是用铸型
聚合物制作而成。透镜的形式优选与激发光束的形状相似。
[0067] 本发明的一个实施方式中，照射区至少比光源发射面积大两倍。仅将需要检测的照射区暴露在照射光下，从而避免荧光信号的减弱。不检测的样品基本上不被暴露在照射光下，特别是当照射会引起样品的化学和/或物理性质改变时，如荧光信号的减弱。
[0068] 为了获得用于照射光致发光样品材料的高效率且变化小的照射光，光源的结构，尤其是光源的发光部分是极为重要的。因此，本发明的多种尤其优选的实施方式都使用带有均匀发射元件的“功率型LED”光源，如许多市售
半导体光源(如LedEgin的LZ1-00G105，Cree的 XLamp 7090 LEDs，Lumiled的Luxeon K2，Nichia 的NS6B083T或 者Osram 的Golden Dragon(LD w51M))。总而言之，本发明的多个优选实施方式包含选自分散光源、发2
光二极管、激光二极管和激光的光源，优选地，发射元件的尺寸较大，如大于0.5mm 或者大
2
于1.0mm。
[0069] 研究发现，当使用光发射元件具有不同结构的光源时，如灯或发光二极管(即LED)，或在聚焦时形成图像或构像的普通光源中，有可能照射相当大的样品材料，同时维持发射光的高度均匀照射以及良好效率。均匀照射是通过穿过样品材料的照射能的变化来定义。照射效率是通过照射光和发射光的比率来定义。本发明提供了光致光发(如荧光显微镜)的多种应用的实质性改进。通过产生样品材料的强的均匀照射，可以更为快捷且简便的方式进行高质量的光致发光分析，因此可使用更简单及耐用的仪器设备。
[0070] 分散光源，如LED，几乎向所有方向发射光。为了在诸如荧光显微镜的领域中使用这种光源，有必要将光聚焦到样品材料上。这种聚焦将产生光源的图像，其尺寸可能与显微镜的
视野不相上下。另一方面，发射光的强度在视野中是光源的图像，因此即使可以高效地照射样品材料，照射强度在样品材料的一个部分与另一部分之间也有很大差别。
[0071] 本发明的一种常用的优选实施方式使用多个透镜聚焦来自分散光源的光。通常优选的是，这些透镜为多个基本上相同的透镜，优选排列成透镜阵列如微透镜阵列的透镜。本发明的多个优选实施方式使用两组基本上相同的微透镜阵列，其以相对的方向成对排列，而其他同样优选的实施方式使用单一元件，包括在两个相反表面上的微透镜阵列。在使用单一元件的微透镜阵列的实施方式中，该单一元件优选是以模塑的方法，通过模塑一种基本上光学透明的材料，如玻璃或聚合物而制备。
[0072] 透过微透镜阵列的光的一个优选的性质是高度平行的光，因此本发明的多种优选实施方式包括一个或多个透镜元件，如微透镜阵列，其增强了离开光源并进入微透镜阵列的光的平行度。
[0073] 本发明使用微透镜阵列元件的多种优选实施方式中，两方的微透镜阵列元件基本上形式相同，并且优选
位置也相同，而其他同样优选的实施方式中，微透镜阵列元件的形式和/或位置基本上不同，优选地，所述差异增强照射效率和/或减小照射变化和/或将单独的光学元件(如透镜)的光学特征整合到微透镜阵列元件的光学效果中。
[0074] 本发明的多个优选实施方式中，由透镜产生的光源的图像基本上与样品材料被检测的区域相似，优选地非常接近被检测的光致发光区域或图像的高度/比率。
[0075] 当使用很多相同的透镜时，通常优选的是将这些透镜排列成单一元件，如微透镜阵列。除了使用微透镜阵列外，本发明的多个优选实施方式进一步包括一个或多个透镜，优选地，所述一个或多个透镜的目的是为了使来自光源的光变
准直和/或增加立体角度，通过该角度收集来自光源的光。在本发明的其它实施方式中，提供了用于接收激发光并生成准直的激发光的准直单元。所述准直单元包括透镜或透镜的阵列。所述准直单元使立体角度增加，通过该角度收集来自激发单元的激发光。
[0076] 使用多个相同透镜或透镜元件(如微透镜阵列)的一个通常优选的性质是可以去除光源中任何结构(如
灯泡的
灯丝)的成像。如果这类结构在样品材料上成像，则照射光的强度将根据光源的成像结构而改变。这些结构无法通过传统的成像镜片去除，因此往往需要诸如光的
散焦或漫射等的方法，而这些方法的结果一般会导致照射效率的降低。本发明的多个优选实施方式包括由单一元件组成的微透镜阵列，优选地，所述元件是通过在模具中浇铸光学透明材料，优选聚合物材料来生产。
[0077] 当通过浇铸聚合物材料来生产微透镜阵列元件时，通常优选使用相当小的厚度。这种小厚度通常是通过使用小的透镜元件来获得，如直径为3mm或更小的透镜元件，如直径为2mm或更小，甚至是1mm或更小，如0.5mm或更小。通常这种微透镜阵列元件的厚度小于10mm，如8mm或更小，如5mm或更小，甚至是3mm或更小。根据生产用于浇铸的模具的方法，通常有利的是使用某些直径的透镜，如直径0.5mm或更大的透镜，如1mm或更大，如2mm或更大，如3mm或更大。因此通常优选的是透镜的直径在0.5至3mm之间，更优选1至2mm之间。
[0078] 本发明的多个优选实施方式中，微透镜阵列的尺寸小于20mm，如15mm或更小，如10mm，在某些实施方式中甚至更小，如8mm或更小，如5mm或更小，所述尺寸是透镜阵列在垂直于照射的
主轴方向上的直径。
[0079] 本发明的多个优选实施方式使用单一的光源，如使用发光二极管、激光二极管或激光作为光源，而其他同样优选的实施方式中使用两个或更多个光源，优选地是一体式装配(single assembly)。在许多这样的实施方式中，优选的是所述两个或更多个光源就光学性质而言是相同的，而在同样优选的其他实施方式中，至少两个光源就光学性质而言是不同的。通常两个或更多个相同的光源可以产生更大的光流，而就诸如发射光的波长等的性质而言，两个或更多个光源可以增加光的灵活性。
[0080] 本发明的其他实施方式中，两个或更多个光源的排列与装置中至少一个其他单元和/或与样品板相对应。这样的排列包括将光源向至少一个其他单元和/或样品板相对移动1mm或更小。这样的排列影响照射区上的照射光的均匀性，优选地，一种理想的排列是产生最小的照射变化。
[0081] 本发明多个优选实施方式包括用于生产的方法，该方法可将光源放置在与至少一个光学组件相对应的位置上，以这种方式可以获得满意的照射效率和/或照射强度变化。
[0082] 这优选地是通过以下工具获得，该工具包括允许光源放置在与照射区平面平行的面上(光源面/光源板)，定位的精确度优于1mm，如优于0.5mm，或者优于0.2mm，如精确度的偏差为0.1mm或更小。还有多个实施方式包括用于生产的方法，该方法可以将光源与至少一个光学元件放置在彼此对应的位置，平行于照射光的主要方向。这优选地是通过以下工具获得，该工具包括将光源和/或至少一个光学元件放置在彼此对应的位置，定位的精确度优于0.1mm，如优于0.5mm，或者优于0.2mm，如精确度为0.1mm或更好。
[0083] 通常，优选的是在照射工具中包括一波长分离单元，如滤光器，优选的目的是限定照射光的波长区域或偏光性。波长分离单元是一种光谱过滤工具，选自干扰滤光器、吸收滤光器和激发滤光器。
[0084] 本发明的一个优选实施方式中，将光源放置在靠近被分析的样品材料的地方。这样可以形成小型光学系统，因为照射工具，包括光源和光学组件在沿着该系统光轴上的长度可以短于100mm，优选短于60mm，更优选短于40mm，更优选短于20mm，如短于15mm。
[0085] 本发明的多个优选实施方式在光致发光成像系统的光轴上或基本上在该光轴上排列有照射工具优选的排列方式是照射光流的大体方向是朝向成像系统的检测器系统。本发明其他同样优选的实施方式的照射工具基本上偏离成像系统的光轴排列，优选的排列方式包括用双色镜将照射光沿着成像系统轴反射到样品上。
[0086] 本发明实施方式的一个通常优选的性质是，在没有使用漫射器(光扩散器)或散焦元件/组件的情况下，可以以均匀的光高效地照射样品材料。本发明的另一个实施方式中，在没有对照射工具的各单元进行实质性散焦的条件下获得该照射效率和照射变化。
[0087] 本发明实施方式的一个通常优选的性质是，不进行分析的样品区域基本上不会暴露于照射中。这是一种令人满意的特性，特别是当照射的结果会改变样品材料的化学和/或物理性质时，如荧光信号的减弱。
[0088] 包括有至少第一检测器的检测单元收集来自样品的荧光信号，显示图像。第一检测器检测来自样品的信号，从而获得样品的图像。检测器是图像感应器件，如电荷
耦合器件(CDD)或
互补金属氧化物半导体(CMOS)器件。检测器的优选特征是活性区域的优选尺寸，活性检测元件的优选数目(如
像素)和优选的响应性(如对检测光的灵敏度)。该装置优选使用一个或多个透镜来生成样品的图像，这些透镜的排列决定了系统的聚焦和光学放大率。
[0089] 本发明的另一个实施方式中，检测器包括活性检测元件的阵列。这些活性检测元件优选地是以二维方式排列，从而可以同时获得被分析样品的空间信息。检测器优选包括检测元件的阵列，例如至少100,000个活性检测元件，如400,000个活性检测元件或更多，如1,000,000个活性检测元件或更多，优选2,000,000个活性元件或更多。当对样品的分析包括测定样品中生物颗粒的空间信息时，通常优选的是这样高数目的活性检测元件。当对样品的分析包括测定样品中生物颗粒的空间信息时，本发明的多种优选实施方式包括尺寸小于10μm的活性检测元件，该尺寸是检测元件的长度、宽度或高度，优选活性检测元件的尺寸为5μm或更小，优选3μm或更小。
[0090] 本发明的另一个实施方式中，所述装置包括一用于将激发光聚焦在样品上的第一聚焦单元/工具。在本发明的另一个实施方式中，该装置包括一用于将荧光信号聚焦在检测单元上的第二聚焦单元/工具。第一聚焦单元和第二聚焦单元通常是透镜或透镜的阵列。本发明的许多优选实施方式中，聚焦是通过移动第一聚焦单元和/或第二聚焦单元中的一个或多个透镜来完成。聚焦还保持了基本上固定的装置长度，也就是，从样品所处的焦平面到检测单元所处的图像平面之间的距离。优选地，聚焦是通过记录预定结构的一系列图像来完成，其中聚焦的点是由那些预定结构的一个或多个性质决定，如尺寸或强度。优选地，所述装置的特征是可以在考虑聚焦变化后再确定或估算视野的面积。在本发明的多个实施方式中，第一聚焦单元和第二聚焦单元提供固定的40×或更小的光学放大率，优选20×或更小，更优选10×或更小。
[0091] 本发明的另一个实施方式中，优选的是，即使在具有以下多种光学分析的性能如透射或散射显微镜中可变的波长、荧光显微镜中可变的激发光/发射光波长、放大率或聚焦的情况下，该装置的物理长度基本上是相同的。以这种方式构建的装置具有相当好的机械优势，例如更简单的生产以及改进的机械稳健性。这可以通过使用一种或多种优选设计方法来实现，例如光学组件的选择，如关于厚度和/或
曲率方面。当生产物理长度固定的装置时，通常优选的是可以通过沿光路方向上移动一个光学组件(如透镜)来调节聚焦。是否聚焦优选是通过测量系统中一个或多个可视物体的成像性质来确定，例如测量一个或多个物体的图像的尺寸。
[0092] 本发明优选的实施方式包括具有固定光学放大率的装置，优选低光学放大率，如小于10倍，如6倍或更小，如4倍或更小，如2倍或更小。本发明的多个优选实施方式包括这样的装置，其产生基本上没有放大的图像，换而言之是一比一的图像。当被分析的颗粒尺寸约为20μm或更小时，通常优选低光学放大率。
[0093] 其他同样优选的实施方式中，光学放大率为10倍或更高，如15倍或更高，如20倍或更高。当分析小颗粒和/或当从颗粒检测的信号很低时，例如当颗粒上可检测位点的数目相当低时，通常优选这些光学放大率。在这些分析中通常优选的光学放大率介于10和40倍之间，如15和30倍之间。
[0094] 本发明的另一个实施方式中，装置的光学放大率通过检测器上目标的尺寸和目标的图像来限定，是一个预定的量级。放大率可通过改变装置中一个或多个单元的位置而改变。优选地，通过移动一个或多个透镜来改变放大率。优选地，改变放大率而基本上不改变装置的长度，也就是，样品所处的焦平面到检测单元所处的图像平面之间的距离。装置通常提供40×或更小的放大率，优选20×或更小，更优选10×或更小。
[0095] 本发明的另一个实施方式中，将激发光滤光器插到从至少一个光源发出的激发光路中，使激发光在照射到样品之前被分成多个激发波长带。激发光路是激发光束的中心到样品板的路径。
[0096] 相似地，在本发明的另一个实施方式中，将发射光滤光器插到指向至少一个检测器的发射光路中，使对检测单元荧光信号进行检测之前，将荧光信号分离成多个发射波长带。发射光路是指样品板到检测单元的路径。
[0097] 用于分离激发光和荧光信号的激发光滤光器和发射光滤光器选自干扰滤光器、吸收滤光器、低通滤光器、高通滤光器和带通滤光器。在多个优选实施方式中，滤光器可以是高通滤光器，即，基本上传输大波长的光而拦截小波长的光的滤波器，通常优选作为荧光显微镜的发射滤光器；低通滤光器，即，基本上传输小波长的光而拦截大波长的光的滤波器，通常优选作为荧光显微镜的激发滤光器。几个优选实施方式包括带通滤光器，如基本上传输一个波长带的光，而更高或更低的波长都被拦截，当被检测的系统包含多重激发和/或发射可能性时，通常荧光显微镜中优选此类滤光器。
[0098] 本系统的多个高度优选的实施方式中，波长分离工具有助于分析颗粒的两个或更多个性质，如
鉴别颗粒或分离两组或更多组颗粒。优选地，根据波长性质进行的此类鉴别或分离，是通过记录相同样品的两个或更多个图像来完成，而样品和样品的颗粒在所述两个或更多个图像中基本上是相同的几何结构，其中所述两个或更多个图像反映不同或基本上不同的波长性质。
[0099] 本发明的另一个实施方式中，波长分离工具，如滤波器，有助于分析颗粒的两个或更多个性质，如鉴别颗粒或分离两组或更多组颗粒。优选地，根据波长性质进行的此类鉴别或分离，是通过记录相同样品的两个或更多个图像来完成，而样品和样品的颗粒在所述两个或更多个图像中基本上是相同的几何结构，其中所述两个或更多个图像反映不同或基本上不同的波长性质。
[0100] 样品是通过选择发射光滤光器和激发光滤光器，用两种或更多种激发和发射波带的组合进行分析。这些组合允许至少一个激发或发射光滤光器分别在两种或更多种组合中使用。
[0101] 本发明的一个优选实施方式中，优选地，当记录荧光信息时，发射光滤光器是设在被分析样品与激发光源相对的那面。
[0102] 本发明的多个实施方式包括用于荧光分析的光学系统，其中激发单元和检测单元分别放置在样品板两侧，如传输荧光；相反的排列方式是将激发光装置和检测装置位于样品板同侧，并通过镜子和/或透镜将激发光和发射光传输到样品上，如落射荧光显微镜系统。多个实施方式中优选这种传输荧光系统，其通常提供更简单的机械和/或光学设置。虽然通常优选的是将激发源和检测器直接对齐排列，也可以实施其他实施方式，包括基本上对齐排列，例如与平行排列的线相比发散大致小于10度。
[0103] 本发明的另一个实施方式中，通过记录两个或更多个图像来分析产生多种空间信息的样品，如多种波长的荧光的发射，其中每个记录的图像基本上包含了所有考虑之中的波长，但优选以不同的强度。获得上述效果的一个优选方式是在光路上采用空间调节工具，优选采用干涉仪，如Michelson干涉仪。
[0104] 本发明的多个优选实施方式中包括将光分离成两个或更多个波长组分的工具，所述工具包括调节光的工具，如Michelson和/或Fabry-Perrot干涉仪。多个优选实施方式还包括调节工具，如干涉仪，所述调节通过改变光程差产生。优选所述光程差很小，如小于800μm，如400μm或更小，优选200μm或更小，更优选100μm或更小。
[0105] 本发明的其它实施方式中，基于有限的波长
分辨率，调节工具的光程差小于100μm，如80μm或更小，优选40μm或更小。本发明的其它实施方式中，基于适度的波长分辨率，光程差为20μm至200μm，优选40μm至100μm。在多个优选实施方式中，用调节工具可获得的波长分辨率不大于10nm，如20nm或更小，如40nm，或小到80nm；分辨率被定义为能被充分分离的最小波长差。
[0106] 优选的分离光的调节工具可以在几乎任何光程差下获得调节光的图像，当表示调节工具的光程差时，优选地，定位的准确度和分辨率优于1μm，如0.5μm或更好，优选0.1μm或更好，更优选0.02μm或更好。在任意给定的光程差下，调节工具可以基本上将光程差维持相当长时间，优选维持的时间与检测器的暴露时间差不多，如基本上将光程差维持在1ms或更大，如10ms或更大，优选50ms或更大，更优选100ms或更大。
[0107] 在被检测光的强度很低的实施方式中，优选调节工具可基本上将光程差维持在200ms或更大，如400ms或更大，优选600ms或更大，更优选800ms或更大。当调节工具中包括用于移动一个或多个光学组件的工具时，如镜子或分束器，优选用一个或多个
压电致动器来实现所述移动。
[0108] 当用调节工具测定光的波长性质时，在不同调节下记录的图像数量与感兴趣的不同波长带数量相当，优选图像数量大于不同波长带的数量，如是波长带数的2倍，优选为波长带数的3或4倍。本发明的其它实施方式中，不同调节下记录的图像数量是感兴趣的波长带数的4倍以上，如8倍或更大，优选10倍或更大。
[0109] 本发明另一个实施方式中，使用致动器来移动样品板和/或至少一个单元以调节样品发射的光。
[0110] 本发明另一个实施方式中，记录了相同样品的两个或更多个图像，显示了不同的光谱性质，如荧光的发射，其中被记录的图像中物体所处位置在所述至少两个图像中大致是相同的。当在不同光谱波长下记录图像时，如当记录荧光强度时，通过结合两个或更多个代表了不同或基本上不同光谱波长的图像信息，可以使不同的光谱信息与特定物体或颗粒联系起来。使用滤波器分离光谱波长时，难以获得这种特征，除非在滤波器的定位和准直上下大功夫，因为折射率不同通常导致偏差，本发明优选实施方式采用滤波器选择工具，其操作准确度高，优选地是通过采用小公差的机械工具获得。一种优选的抵消光谱偏差的方法是以一种预定方式改变一个或多个光学组件(如透镜或检测器)或样品的位置，从而在记录代表两个或更多个光谱性质的图像时，减少或抵消位置的改变。
[0111] 本发明的另一个实施方式中，使用图像准直单元。图像准直单元将显示不同光谱信息的多个图像生成一准直的图像，这些图像得自于不同或基本上不同的发射条件下获得的样品的多个荧光信号。在另一个实施方式中，该装置进一步包括至少两种不同的发射滤光器，可以过滤颗粒向检测器发射的信号。在本发明的多个实施方式中，该装置包括至少4个不同发射滤光器，如至少6个不同发射滤光器，如至少10个不同发射滤光器，如至少15个不同发射滤光器，如至少20个不同发射滤光器。
[0112] 当用两种或更多种发射或传输波带分析同一样品或样品材料时，优选包括图像准直方法。图像准直在两种不同或基本上不同的发射条件下生成样品或样品材料的准直图像，其中所述准直图像中物体位置的差异小于10像素，如8像素或更小，如4像素或更小，优选甚至是2像素或更小，以物体位置的平均差异来测定。图像准直可以通过对收集的图像进行预定转换，将收集到的图像转换为准直图像来实现。优选地，所述预定转换是通过测量包含物体的图像从而使收集的图像中产生可鉴别的结构来导出，，其中所述物体在所述不同发射条件下收集的图像中是可见的，并且在获得代表所述不同发射条件的两个或更多个图像期间，会维持它们的位置或相对位置。不准直相对简单一点，如主要是位置移动，优选使用与图像的两个坐标中的每一个相关的变量，如移动变量。然而，如果不准直包括放大率的变化，通常优选使用与两个坐标中的每一个相关的单独的变量，如一个方向上是一放大率因子，另一个方向上是另一放大率因子。其它同样优选的实施例进一步包括与两个方向都相关的变量，如根据图像中的位置而确定的反映移动和/或放大率的变量。通常，转换基本上是指移动转换，优选地所述转换可以表示为图像水平和/或垂直方向上确定数量的像素的移动。移动转换中移动的程度基本上取决于其在图像中的位置，优选地其中水平和/或垂直移动定义为恒定的移动，而变化的移动被确定为图像像素指数的一部分。将水平和/或垂直方向上的移动程度表示为图像像素指数的多项式函数。
[0113] 本发明另一个实施方式中，使用控制单元将样品板/样品
支架移动到与检测视野相对应的预定位置上。
[0114] 本发明的一个实施方式中，激发光单元和检测单元放置在样品板的两侧。然而，在本发明的另一个实施方式中，激发光单元和检测单元放置在样品板的同一侧。
[0115] 本发明的另一个实施方式中，检测单元连接了一个处理器，以接收来自检测单元的荧光信号的信号数据，处理该信号数据，将该信号数据与要评估的参数相关联，并对参数进行评估。该装置进一步包括一种工具，用于控制获得相同体积的样品至少两个图像，其中所述两个图像的信息代表不同的光谱波长。
[0116] 在本发明的另一个实施方式中，提供对含有液体样品的样品支架的可变厚度的补偿，优选当样品的厚度对所进行的分析的结果产生影响时，如测定单位样品体积的颗粒数量。这可以这样完成：对样品支架、或与样品支架相连接的部分进行标识，或者以任何形式将与样品支架的物理尺寸相关的信息与样品支架中样品的每次测量相关联。尤其是，对样品支架中两个或更多个分离的或部分分离的位置进行检测时，优选地，可能要考虑分离位置的厚度差异。
[0117] 测定每单位体积样品的颗粒数量时，需要确定被分析样品的体积。因此，本发明多个实施方式包括一工具，用于记录信息和/或测定与样品支架的至少一个尺寸相关的特性，特别是样品支架中面向检测器方向上的样品厚度。厚度相关的信息的记录优选地包括读取反映尺寸特性(如厚度)预定值的标识。优选地，可以通过装置中一个或多个感应器读取所述标识，通常所述标识是一种信息表示模式，如二进制码或条型码信息。本发明的多个实施方式可以对样品支架的两个或更多个部分进行分析，优选地是为了增加分析的总量和/或获得被分析的样品的更好表征，再优选地，该标识能反映样品支架两个或更多个部分的物理尺寸。本发明另外的实施方式包括用于测定样品支架的物理尺寸的工具，优选地可以在样品支架的一个或多个预定位置进行所述测定。本发明的多个优选实施方式使用一第一标识检测器读取标识和/或测定物理尺寸，所述第一标识检测器优选与用于检测样品图像以分析颗粒的检测器相同。优选至少一个记录的或测定的参数具有最小刻度，并且，当表示为所述参数典型值的分数时，刻度的等级为10％或更小，优选8％或更小，更优选6％或更小，更优选4％或更小，更优选2％或更小。在多个优选实施方式中，所述刻度是等分等级，在其它同样优选的实施方式中，所述刻度实质上是非等分的，如等级大小基本上与所述参数相关的相对尺寸相同。
[0118] 本发明的另一个实施方式中，提供能够测定含有被分析样品的样品支架的类型的工具。优选所述测定是通过读取识别所述样品支架类型的标识和/或检测所述样品支架的形状、大小或其它物理特性来完成。所述检测优选用一第二标识检测器完成，优选所述第二标识检测器与用于检测样品图像以分析颗粒的检测器相同。
[0119] 本发明的另一个实施方式中，提供一种样品支架，其适用于
支撑两种或更多种不同类型的样品器具，而很少调整或者不用调整。所述样品器具之一是传统的显微镜
载玻片、或血球计数室，如Büchner计数室。优选地，将不同样品器具放置在同一样品器具支架上或内，优选的样品器具支架是可移动的，且所述样品器具支架的移动是由控制工具控制，控制工具能够根据使用的样品器具的类型引导该样品器具支架。
[0120] 本发明另一实施方式中，样品支架由控制单元控制，使用检测单元来监测或感应与被分析样品和/或使用的样品器具相关的一个或多个信息。优选地，感应的信息是识别样品中的颗粒或样品中颗粒的特性和/或样品支架或样品支架的特性的信息。优选地，控制单元将样品支架移动到与检测单元视野相关的一个或多个预定位置，从而可以感应一个或多个信息。本发明的优选实施例中，被感应的信息是静态信息，也就是说在整个分析过程中该信息不会发生改变，例如标志的读数，其表示样品支架的预定尺寸特性。然而，在其它实施方式中，被感应的信息是动态信息，例如样品的运动或样品支架某部分的运动，或对样品的某一化学和/或物理性质的指示。
[0121] 本发明的另一实施方式中，加强了通过检测单元检测到的荧光信号的分辨率，其中被测荧光信号的分辨率是用来代表被测信号强度的显著不同的间隔数。通过对样品中实质上只是两个或更多个图像所代表的差异有信号敏感性的这两个或更多个图像进行记录，本发明可以检测分辨率比检测单元(包括电检测工具)的标称分辨率更高的信号，优选地通过改变暴露时间和/或收集的信号的电性放大，然后将这两个或更多个图像以一种方式合并成一个或多个图像来获得，其代表着样品的图像具有的分辨率比两个或更多个收集的图像中的每一个都要高。因此，通过在至少两个图像中提供不同信号灵敏度来加强被测信号的分辨率。
[0122] 本发明的一个方面涉及一种评估颗粒的系统，所述评估包括两个或更多个单独的任务，其中所述任务以预设方式执行，并且该预定方式包括多个指令。优选地所述指令可以以灵活的方式结合，使该系统适于执行两种或更多种类型的颗粒评估，其中类型的不同优选地反映性质的不同，如时间、激发或发射波长的选择。
[0123] 本发明的一个方面涉及一种装置，包括鉴别被分析样品并存储所收集的图像的方法，以及操作图像记录系统的方法。存储的图像可排列在
数据库里，可以进行数据检索以便生成报告和/或基于一种或多种性质来选择一个或多个收集的图像。
[0124] 本发明的另一个实施方式中，所述装置的样品器具可以是一种瓶状容器，有助于通过测定单位体积的细胞数(总数和无活力的细胞数)从大量培养的细胞和原代细胞中测定细胞悬浮液的活力。
[0125] 通过按压
活塞将细胞悬浮液的样品引入样品器具中，以便测定细胞活力。样品器具的内部用荧光染料吖啶橙和4′，6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)/DAPI的取代变体包被，AO和DAPI/DAPI的取代变体二者的终浓度为2.5μg/ml。AO对所有的细胞群染色，而DAPI/DAPI的取代变体染色无活力的细胞。将样品器具放置在该装置上，测定细胞数和活力。
[0126] 吖啶橙和DAPI的组合适用于测定细胞和组织的活力，因为这两种DNA染料在任何情况下都不会显示重叠的光谱。在一种分析方法中，用这两种荧光染料培养悬浮液中的细胞。吖啶橙渗透群落中的所有细胞而DAPI只渗透膜损伤的细胞。用DAPI标记的细胞通过UV激发并测量蓝光来检测，而吖啶橙标记的细胞则通过蓝光激发并测量发射的绿光来检测。以这种方式，可以从数据中获得绝对细胞数和活力百分比。另外，检测吖啶橙发射的红光可进一步获得关于细胞状态、活力和完整性的信息。
[0127] 本发明的其它实施方式中，也可使用其他吖啶染色剂，如3，6-二氨基吖啶
盐酸盐、6，9-二氨基-2-乙氧基-吖啶乳酸盐、喹吖因二盐酸盐、双-N-甲基吖啶-
硝酸盐、10-十二烷基-吖啶橙溴、氮芥喹丫因、盐酸氮蒽黄和9-异硫氰酸-10-甲基吖啶酯三氟甲磺酸盐(9-isothiocyanato-10-methyl acridinium triflate)、以及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)/DAPI的取代变体，组合浓度为2.5μg/ml。
[0128] 本发明的另一方面，提供一种用上述装置检测受试细胞的活力的方法。所述方法包括将受试细胞与4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料/或DAPI的取代变体混合；使细胞染色一段时间，最多为60分钟，如30分钟、如20分钟，如最多10分钟；获得染色的细胞样品，其中只有无活力的细胞被染色；将被染色的受试细胞暴露于激发光；检测来自被染色的受试细胞的荧光信号；以及处理荧光信号以鉴别该受试细胞是否无活力。
[0129] 本发明的另一实施方式中，受试细胞也包括多种细胞。通过使用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料/或DAPI的取代变体，鉴别多种细胞的细胞数和无活力性。受试细胞选自培养的细胞和原代细胞。受试细胞选自哺乳动物细胞系、哺乳动物细胞系悬浮液、昆虫细胞系，如Drosophila melanogaster Schneider-2、人胚胎细胞系、原代细胞和人血细胞。在可控的环境下制备受试细胞，如实施例中材料和方法部分所示。
[0130] 本发明的另一个实施方式中，将吖啶橙染料与4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料/DAPI的取代变体混合，组合浓度为2.5μg/ml。用AO染料与DAPI染料/DAPI的取代变体的组合对样品器具进行包被，试验样品注入/装入样品器具中。可存活的受试细胞和无活力的受试细胞均用吖啶橙染料染色。
[0131] 本发明的另一个实施方式中，用活塞将受试细胞注入/装入样品器具中。
[0132] 激发光来自光源，光源选自热光源，如
卤素灯、或气体灯，如氙气灯、发光二极管、激光或激光二极管或如上文装置部分所述的任何其它光源。
[0133] 荧光信号是通过分析细胞中无活力的细胞数的荧光信号来处理。
[0134] 此方法是用一种标记受试细胞的装置来进行。所述装置包括一样品器具，且至少部分样品器具用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料/DAPI的取代变体包被，其中DAPI/DAPI的取代变体只能染色无活力的细胞；一受试细胞注入单元，用于将受试细胞装入样品器具；一激发单元，用于将注入的受试细胞暴露在激发光下；一检测单元，用于将检测装入的受试细胞所发射的荧光信号；以及一处理器，用于处理荧光信号以评估该试验物是否无活力。
[0135] 本发明的另一个实施方式中，提供了一种利用上述照射装置和检测装置提供有关细胞信息的方法。所述方法包括：用荧光蛋白或荧光标记的核酸转染该细胞；向转染细胞加入巯基反应分子以获得细胞溶液；将细胞溶液暴露在激发光下；检测来自细胞溶液的发射光；以及处理发射光以获得有关细胞的信息。
[0136] 此方法使用荧光蛋白或荧光标记的核酸，结合巯基反应分子，如
马来酰亚胺(如，DACM)和细胞不渗透性DNA染色剂(如，碘化丙啶)，以监测转染效率，并且同时提供有关细胞群的活力和细胞毒性水平的信息。
[0137] 信息通常包括转染效率、细胞活力和毒性水平，即检测无活力的细胞。
[0138] 细胞选自培养的细胞或原代细胞。细胞选自哺乳动物细胞系、哺乳动物细胞系悬浮液、昆虫细胞系，如Drosophila melanogaster Schneider-2、人胚胎细胞系、原代细胞和人血细胞。
[0139] 此方法进一步包括混合细胞不渗透性DNA染色剂。细胞不渗透性DNA染色剂可以是碘化丙啶和吖啶同源二聚体。核酸选自荧光蛋白和小干扰RNA。巯基反应分子是马来酰亚胺，如DACM。
[0140] 本发明的另一个实施方式中，细胞包括多种细胞。另外，用荧光蛋白或荧光标记的核酸以及巯基反应分子相结合来鉴别有关多种细胞的信息。
[0141] 激发光来自光源，光源选自热光源，如卤素灯、或气体灯，如氙气灯、发光二极管、激光或激光二极管或如上文装置部分所述的任何其它光源。
[0142] 本发明多个实施方式中，当以碘化丙啶作为细胞不渗透性DNA染色剂时，检测无活力细胞的激发光是绿光而发射光是红光。而当以吖啶同源二聚体作为细胞不渗透性DNA染色剂时，检测无活力细胞的激发光是蓝光而发射光是绿光。
[0143] 本发明的多个实施方式中，当用UV或紫光激发时表达BFP的细胞发出蓝光；当用紫光或蓝光激发时表达CFP的细胞发出青光；当用蓝光激发时表达GFP的细胞发出绿光；当用蓝光或绿光激发时表达YFP的细胞发出黄光；当用绿光激发时表达dsRed或其变体的细胞发出红光；当用UV或紫光激发时含有siRNA的细胞发出蓝光；当用紫光或蓝光激发时含有siRNA的细胞发出青光；当用蓝光激发时含有siRNA的细胞发出绿光；当用蓝光或绿光激发时含有siRNA的细胞发出黄光；而当用绿光激发时含有siRNA的细胞发出红光。
[0144] 检测包括在至少一个检测器上接收发射光，而处理包括分析发射光以测定转染效率、细胞活力和细胞毒性水平。
[0145] 用一种装置实施上述方法，该装置用于测定有关细胞的信息。所述装置包括一转染单元，用于以荧光蛋白或荧光标记的核酸转染细胞；一混合单元，用于将巯基反应分子加入到转染细胞中以获得细胞溶液；一激发单元，用于将细胞溶液暴露在激发光下；一检测单元，用于检测来自细胞溶液的发射光电；以及一处理器，用于处理发射光以获得有关细胞的信息。
[0146] 本发明的装置和方法是用于分析样品中的颗粒。本发明提供了一种简单、快捷且灵活的装置用于在低放大率下分析细胞，据此表征细胞、检测细胞、计数细胞以及测定细胞活力、能动性、代谢活性、代谢量、细胞分裂、增殖、健康、压力水平、凋亡、坏死、细胞的其它情况或形态。此类分析的多种实施例如下文所示，以更好地了解本发明的内容。
[0147] 实施例1、使用传统装置聚焦照射光(参考图1)
[0148] 图1A是一种虚拟光源，显示了光发射元件(101)的主要结构，包括4个方形的均匀发光区域，被无源元件(102)分隔并包围，无源元件发出的光不可检测。光源大小1×1mm，其发射光角度为+40至-40度(deg)。
[0149] 图1B显示了一种模仿使用光源(103，与101相同)照射样品材料的排列方式。图中显示双凸非球面透镜(104)，其焦距为f＝8.5mm和直径D＝12mm(可以购自Melles Griot LAG000)。该系统进一步包括滤光器元件(105)，通常用于荧光分析，以便去除预期的发射光波长之处的光。最后该系统包括平凸透镜(106)，其焦距为f＝12mm和直径D＝
12mm(可以购自Edmund Optice part no 45084)，最后是被照射的样品材料(107)。
[0150] 图1B显示随机选择的数种射线并显示这些射线通过该系统的路径。
[0151] 图1C显示会出现在样品材料上的光源的模拟图像。图1C显示的光源与图1A高度相似，其发射结构易于鉴定。如果要抑制或消除所述结构，必须使用扩散工具，例如使用漫射器。这会影响图像的大小并产生“模糊”，导致照射范围扩大从而损失有效光和/或降低照射光的均匀性。
[0152] 实施例2、用微透镜阵列聚焦照射光(参考图2)
[0153] 图2A显示与实施例1的系统相似的一种模拟照射样品材料的排列方式，其中增加了微透镜阵列(206)。该系统包括与图1A相同的光源(201)，双凸非球面透镜(202)，滤波器元件(203)，平凸透镜(204)，最后是被照射的样品材料(205)。
[0154] 微透镜阵列(206)的直径为12mm，并且外接方形(12×12mm)被划分成60×44的矩形相邻的对称的双凸透镜元件，透镜厚度为1.191mm，透镜半径分别为0.4mm和-0.4mm，每个单个透镜元件产生一个光源的小图像，并且当所有单个的小图像叠加到样品上时，则呈现一个均匀照射的矩形形状。
[0155] 用该系统进行与实施例1相同的模拟，结果如图2B所示，其中显示了样品材料的照射。图2B中光源结构基本上被去除，基本上没有因扩大照射而引起照射效率的损失。
[0156] 当进行光致发光分析，如荧光分析时，高度优选这些特性。
[0157] 实施例3、照射的比较(参考图3)
[0158] 图3显示当使用具有复杂照射结构的光源时，简单照射和本发明照射之间的区别。比较是基于上述实施例1和2的结果。
[0159] 图3显示如实施例1和实施例2所发现且如图1C和图2B所示，沿着图中箭头表示的横线的照射强度。
[0160] 实施例1的照射用线条301表示，实施例2的照射用线条302表示。线条303表示由光系统的放大率限定的照射范围。
[0161] 图中显示，线条302超越范围303的程度小于线条301，它将产生更高的照射效率。此外，从光源发射结构考虑，线条302在范围303内的变化显著小于线条301的变化，变化表现为中心照射明显下降且朝向范围边界的强度也显著下降。
[0162] 实施例4、本发明的实施方式(参考图4)
[0163] 图4显示了根据本发明的一种实施方式。它显示了光学系统，包括光源(401)，如ML101J17-01(Mitsubishi，日本)，LZ1-00××005或LZ1-00××03(LedEngin，USA)，具体地，光源的选择取决于所期望的波长区域和强度。此外，它包括
准直透镜(402)，如LAG000(Melles Griot，USA)；微透镜的阵列(403)，如双面透镜阵列元件；光谱滤波器工具(404)，通常是干扰和/或吸收滤光器，在荧光分析中将该滤光器称为激发滤光器；最后还包括聚焦组件(405)，如有效焦距在2和20mm之间的PCX×og DC×透镜，其中改变焦距会影响光源的照射区域。最后还显示了照射板(406)，优选以相对高的照射效率将来自光源的相对均匀的光投射到照射板上，如照射区上。
[0164] 图4B是本发明的一种实施方式，其中画出模拟光线，表明该系统的光学操作。
[0165] 实施例5、照射区的改变(参考图5)
[0166] 图5显示了本发明照射工具的照射。图5A和图5B的区别显示了减小聚焦元件(图4中的405)的焦距从而影响照射区的有效尺寸的作用。
[0167] 实施例6、微透镜元件(参考图6)
[0168] 图6显示了本发明的微透镜阵列元件。图6A显示的元件是一种热塑型的，包括用于排列和固定元件的工具(601)，此处是环状边缘的形式，以及两个微透镜阵列(602)，其中未显示底部的那个阵列。
[0169] 每个微透镜阵列由多个半径为1.7mm的1.2×0.9mm的透镜组成，间隔约5mm，这也是微透镜元件的厚度。微透镜的模式是13×9网格，如图6B所示，大体上呈圆形形状，优选类似光束的形状，通过从每个角落去除5个透镜，减小物理尺寸。
[0170] 实施例7、光学模
块的排列(参考图7)
[0171] 本发明的一个典型实施方式包括两个或更多个光学模块，图7显示了这些模块的排列。该模块是照射模块(701)，样品或样品室(702)，检测模块(703)和光镜(704)。
[0172] 图7A显示一种优选的实施方式，包括照射、样品和检测模块，其中所有模块以相互之间轴平行的方式排列。照射模块，通常包括光源、聚焦光学器件和波长分离工具(这些物件均未在图中显示)，使光照射于样品室上，其中样品通常排列在垂直于调节模块的发射光的主光轴方向上。通常样品室以全方位发射信号，但其中的部分信号会被检测模块收集，检测模块位于或基本上位于与照射模块和样品室相同的轴上。
[0173] 图7B显示本发明另一种同样优选的实施方式，通过光镜将来自样品室的信号导向检测模块。本实施方式使检测模块位于在照射和样品室模块之间形成的光轴之外，如图7B所示，检测模块是以垂直方式排列。
[0174] 由于图7只是显示了不同模块的大体定位，而不是不同元件的位置，显然对本领域技术人员来说，当用光镜引导光偏离光轴时，通常有利的是在检测模块中包括一光学组件，如在样品室和光镜之间的一个或多个透镜。通常此类排列的作用是确保从样品室发射的、在检测模块中检测的光更为平行，使更为均匀的光反应呈现波长依赖特征，如过滤，和/或通过在靠近图像处放置一个收集光学器件，增加检测模块的有效
光圈。
[0175] 本发明的实施方式包括两个或更多个检测模块，例如通过将图7A和B中所示的排列相结合。这通常是通过包括一个带有波长依赖性反射特性的光镜来完成，使得波长不同，反射/透射特性显著不同。此类实施方式可同时检测样品室模块中的样品的两种或更多种光学特性。
[0176] 实施例8、悬浮液中细胞的细胞计数及活性；Jurkat(JM)细胞(一种T淋巴细胞系)(参考图8、9和10)
[0177] 材料与方法、将Jurkat(JM)细胞用RPMI(Invitogen，#61870)补以10％热-失活的胎
牛血清(Invitogen，#10108-165)，于37℃、含5％CO2的湿润空气条件下培养。6
Jurkat(JM)细胞(细胞密度为1.4×10，用所述装置测得活力为98％)上样到含有荧光染料吖啶橙(AO)和4′，6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的样品器具中。样品器具置于该装置中，并用该装置进行细胞计数和研究。为了展示DAPI具有染色死细胞且只能染色死细胞的功能，将细胞的碘化丙啶(PI)染色与DAPI一起使用。PI是膜不渗透性的因此被排除于活细胞之外。用Olympus IX50荧光显微镜分析染色的细胞。用Lumenera CCD照像机及其内部开发的软件捕获图像。用U-MNUA2(UV带通，330-385nm)滤光块(Olympus)检测DAPI荧光，并用U-MWG2(绿色长通)滤光块(Olympus)检测PI荧光。
[0178] 结果、AO和DAPI都可快速使Jurkat细胞染色，分别染色所有细胞和无活力的细胞，从而可以测定细胞群的活力。用DAPI和PI双重染色显示它们可以对相同的细胞染色，从而确定DAPI可以用作无活力细胞的染色剂。然而，研究发现，在培养期间(15分钟以上)DAPI也可以使部分PI阴性种群染色。另外，在荧光显微镜中在相差和UV滤波器下观察细胞，检测DAPI染色的细胞，清楚显示了相差下看似死亡的细胞也是呈DAPI阳性的，因此为死细胞。
[0179] 实施例9、粘附细胞的细胞计数及活力；HEK293细胞(一种人胚胎肾细胞系)(参考图8A)
[0180] 材料与方法、HEK293细胞用DMEM(Invitogen，#31966)补以10％热-失活的胎牛血清(Invitogen，#10108-165)，于37℃、含5％CO2的湿润空气条件下生长。当克隆率为50％时用0.5ml胰蛋白酶(Invitogen，#25300)
收获并用5ml培养基(DMEM+10％FCS)中和。细胞上样到含有荧光染色剂吖啶橙(AO)和4′，6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的样品器具，并且将盒子置于装置中。用该装置及其内部开发的软件进行细胞计数和研究。
[0181] 结果、相对于Jurkat细胞，HEK293细胞立即被AO和DAPI染色，它们分别使所有细胞群和无活力细胞染色，从而测定细胞群的活力。
[0182] 实施例10、昆虫细胞的细胞计数及活力；S2和Sf9细胞系(参考图8A)[0183] Drosophila melanogaster Schneider-2(S2)细胞系最初来自Drosophila胚胎晚期，Sf9细胞系最初来自Fall armyworm Spodoptera frugiperdar的蛹卵巢组织。
[0184] 材料与方法、S2和Sf9细胞分别在Schneider的Drosophila培养基(Invitogen，#21720)和Grace的昆虫培养基(Invitogen，#11605)中，补以10％热-失活的胎牛血清(Invitogen，#10108-165)，于28℃下不振荡生长。细胞上样到位于装置中的样品器具上。用该装置进行细胞计数和研究。
[0185] 结果、相对于悬浮和粘附细胞系，在Via1-Cassette中昆虫细胞系同样立刻被AO和DAPI染色，说明Via1-Cassette同样可用于测定昆虫细胞的活力。
[0186] 实施例11、原代细胞的细胞计数及活力；鼠脾细胞、鼠骨髓细胞和人血细胞(参考图11)
[0187] 材料与方法、将来自C57BL/6小鼠的脾脏放在
冰冷的PBS里，并用无菌
注射器的末端温和
研磨。悬浮液在300g下离心10分钟；将颗粒重悬于1ml 0.83％NH4C1中以裂解红细胞并在冰上孵育3分钟。将细胞加入14ml PBS并在300g下离心10分钟。脾细胞重悬于RPMI(Invitogen，#61870)中，补以10％热-失活的胎牛血清(Invitogen，#10108-165)、100U/ml青霉素和100μg/ml
链霉素(Invitogen，#15140-122)。细胞团被沉淀并用移液管移走，剩下的单一细胞悬浮液用于分析。
[0188] 骨髓细胞在
层流净化罩中进行无菌收获。将双边径骨和股骨无菌去除，取下周围的软组织并放于含有10ml 70％乙醇的皮氏培养皿中。两分钟后转移到冰冷的PBS中。然后，用连接有27号针头的5ml注射器吸取5ml冷PBS冲洗牛骨髓腔，收集各骨头的细胞。细胞在300g下离心10分钟，丢弃上清液，并冲洗细胞两次。第二次冲洗之后将细胞颗粒重悬于RPMI 1640(Invitogen，#61870)中，补以10％热-失活的胎牛血清(Invitogen，#10108-165)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitogen，#15140-122)。
[0189] 用针从指尖处取少量人静脉血作为样品。用PBS将血样稀释5倍后用于分析。
[0190] 将各种原代细胞样品(鼠脾细胞、鼠骨髓细胞和人血细胞)上样到样品器具中并用装置进行分析。
[0191] 结果、与悬浮、粘附和昆虫细胞系相比，在Via1-Cassette中原代细胞(鼠脾细胞、鼠骨髓细胞和人血细胞)同样立刻被AO和DAPI染色，它们分别使所有细胞群和死细胞群染色。这说明Via1-Cassette同样可用于测定原代细胞的活力。
[0192] 实施例12、使用DACM测定表达RFP细胞的转染效率和细胞计数(参考图12)[0193] HEK293是一种人胚胎肾细胞系，在本实施例中用融合了CMV启动子的RFP(源于dsRed的mRFP1)转染(EC41)。用DACM使所有活细胞染色并用RFP检测转染细胞，转染的活细胞占总细胞数的比率(转染效率)很容易测定。
[0194] 材料与方法、HEK293细胞用RPMI(Invitogen，#61870)补以10％热-失活的胎牛血清(Invitogen，#10108-165)，于37℃、含5％CO2的湿润空气条件下培养。分别向190μl转染和未转染的HEK293细胞的混合物中加入10μl溶解于DMSO的DACM(N-(7-二甲氨基-4-甲基-3-豆香素)-马来酰亚胺，WAKO Pure Chemical Industries，CAS no.55145-14-7)(200μg DACM/ml DMSO)并用移液管混合。细胞上样到NucleoCassette中(不包含碘化丙啶或其它染色剂)。NucleoCassette放置在装置中并用该装置进行细胞计数和研究。
[0195] 结果、测得所有活细胞(基于以DACM染色的细胞，图5)的浓度为2.4×106个细6
胞/ml。测得表达RFP的细胞浓度为1.7×10 个细胞/ml，则转染效率为71.5％。
[0196] 结论、当转染涉及荧光蛋白时，巯基反应探针如DACM可以用于分析中来测定转染效率。
[0197] 实施例13、使用DACM和PI的表达GFP细胞的活力、细胞计数和转染效率(参考图13和图14)
[0198] MCF-7是一种
乳腺癌癌细胞系，在本实施例中用融合了CMV启动子的GFP转染。用碘化丙啶(PI)染色无活力细胞，DACM染色所有活细胞并用GFP检测转染细胞，转染效率、细胞活力和细胞计数很容易被测定。
[0199] 材料与方法、稳定表达GFP的MCF-7细胞(MCF-7EC3)用RPMI(Invitogen，#61870)补以10％热-失活的胎牛血清(Invitogen，#10108-165)，于37℃、含5％CO2的湿润空气条件下培养。向190μl MCF-7EC3细胞中加入10μl溶解于DMSO的DACM(N-(7-二甲氨基-4-甲基-3-豆香素)-马来酰亚胺，WAKO Pure Chemical Industries，CAS no.55145-14-7)(200μg DACM/ml DMSO)并用移液管混合。细胞上样到含有DNA染色剂碘化丙啶(PI)的NucleoCassette中。PI是膜不渗透性的因此被排除在活细胞外。NucleoCassette放置在装置中并用该装置进行细胞计数和研究。还使用了Olympus IX50荧光显微镜对细胞进行研究，用Lumenera CCD照像机及其内部开发的软件捕获图像。分别用U-MNUA2(绿色长通，510-550nm)、U-MNUA2(UV带通，330-385nm)和(蓝色长通)滤光块(Olympus)检测PI、DACM和GFP荧光。
[0200] 结果、小部分细胞被PI染色(图6A)且装置测定出无活力细胞的浓度为1.2×1056
个细胞/ml。测得活细胞(DACM染色的细胞，图6B)浓度为2.7×10 个细胞/ml。在此基
6
础上，样品中细胞的活力为95.6％。测得表达GFP的细胞浓度为2.6×10 个/ml，则转染效率为96％。
[0201] 用荧光显微镜研究转染的和未转染的MCF-7细胞的混合物(图7)。该图是由使用不同滤光块检测DACM(UV带通)、GFP(蓝带通)和PI(绿长通)捕获的相同细胞的图像重叠而成。从图中可看出，DACM染色表达GFP的活细胞，而死细胞只被PI染色。
[0202] 结论、巯基反应探针如DACM可以用于分析测定转染效率，且结合不渗透性染色剂如PI，还可获得有关细胞活力的信息。
[0203] 实施例14、用DAPI或碘化丙锭(PI)量化哺乳动物细胞中的DNA含量(参考图15和图16)
[0204] DAPI染色细胞的整体荧光强度与DNA的含量有化学计量关系。DAPI优先结合双链DNA，而DAPI/RNA复合物的总量只有DAPI/DNA复合物的20％。因此，使用DAPI，在进行DNA含量测定之前不需要用RNA酶处理以去除RNA。这是使用其它常用染料如PI进行细胞内DNA含量测定的前提条件。DAPI通过连接到DNA小沟的AT簇上而与双链DNA相互作用。当与双链DNA结合时，它的最大吸收是在358nm，最大发射是在461nm。DAPI与DNA结合产生的荧光强度增加了20倍。
[0205] 在本实施例中，使用DAPI或碘化丙啶(PI)作为DNA染色剂以测量粘附细胞系、MCF-7、悬浮细胞系，JM(源自Jurkat的细胞系)中的DNA含量。
[0206] 材料与方法、MCF-7细胞生长于RPMI+10％FCS到克隆率为80-90％，用PBS冲洗细胞一次，使胰蛋白酶化并离心收集，之后用乙醇固定。JM细胞生长于RPMI+10％FCS到密5
度为5.0×10 个细胞/ml。离心收集细胞并用PBS冲洗一次后用乙醇固定。MCF-7和JM细胞充分重悬在0.5ml BPS中，并且向各细胞悬液中加入4.5ml冰冻的70％乙醇
固定剂。用DAPI或PI染色之前细胞于固定剂中至少保持两小时。
[0207] PI染色、以200×g离心所收集的细胞5分钟并用PBS冲洗一次。再一次离心后将细胞重悬于PI染色溶液(100ml含0.1％(V/V)Triton X-100的PBS中加入20mg无DNA酶的RNA酶A和2mg碘化丙锭)并于37℃下孵育30分钟，然后用流式细胞仪以及本发明的装置进行分析。
[0208] DAPI染色、以200×g离心所收集的细胞5分钟并用PBS冲洗一次。再一次离心后将细胞重悬于DAPI染色溶液(100ml含0.1％(V/V)Triton X-100的PBS中加入0.1mg4′，6二脒基-2-苯基吲哚；DAPI)并用本发明的装置直接进行分析。
[0209] 结果、用本发明的装置和标准流式细胞仪分析RNA酶A处理的和PI染色的MCF-7细胞。如图15所示，本发明的装置提供了准确且精准的细胞内DNA含量数据，其与流式细胞仪，这种最常用于DNA定量的方法所获得的数据相当。下一步，来源于同一培养物的MCF-7细胞直接用DAPI染色(无需RNA酶处理)并用本发明的装置进行分析。如图16所示，分别用PI和DAPI染色的细胞内DNA含量柱状图几乎相同。因此，使用本发明的装置进行细胞内DNA定量时，PI和DAPI两种染色剂均可使用。
[0210] 实施例15、药物对哺乳动物细胞中DNA含量的影响(参考图17)
[0211] 用碘化丙啶作为DNA染色剂测定以不同药物处理的JM细胞的DNA含量。
[0212] 材料与方法、JM细胞生长于RPMI+10％FCS中到密度为4.7×105个细胞/ml，然后用血清饥饿或用以下药物处理20小时：
[0213]
[0214] 离心收集细胞并用PBS冲洗一次后用乙醇固定。细胞充分重悬于0.5ml PBS中并向各细胞悬浮液加入4.5ml冰冻的乙醇固定剂。用PI染色前细胞至少在固定剂中保持两个小时。
[0215] PI染色、以200×g离心所收集的细胞5分钟并用PBS冲洗一次。再一次离心后将细胞重悬于PI染色溶液(100ml含0.1％(V/V)Triton X-100的PBS中加入20mg无DNA酶的RNA酶A和2mg碘化丙锭)并于37℃下孵育30分钟，然后用流式细胞仪以及本发明的装置进行分析。
[0216] 结果、用本发明的装置和标准流式细胞仪分析用影响细胞周期的不同时期的药物处理的JM细胞。如图17所示，本发明的装置提供了准确且精准的细胞内DNA含量数据，其与流式细胞仪获得的数据相当。因此本发明的装置能用于细胞内DNA的定量并可用于评估不同药物对细胞周期的影响。
[0217] 实施例16、用碘化丙锭进行酵母细胞中DNA的定量(参考图18)
[0218] 用碘化丙锭作为DNA染色剂测量酵母细胞(Schizosaccharomyces pombe)的DNA含量。使用以下两种菌株：
[0219] 1.Eg544(CM-SP4)，h- Δmat2，3
[0220] 2.Eg816(CM-SP7)，h- cdc25-22 leu 1-32
[0221] 3.Eg892(CM-SP72)，h+ cdc10-V50 ura4-D18
[0222] Cdc细胞(Eg816和Eg892)在25℃下于EMM培养基中生长到密度为5×106个细胞/ml，然后于36℃(cdc突变体的限制性温度)下孵育4小时后进行收集并用70％乙醇固定。在有氮和无氮(EMM-N)条件下于限制性温度培养Cdc10细胞。
[0223] 野生型细胞(Eg544)在30℃下于EMM培养基中生长到密度为5×106个/ml，然后转移至EMM和EMM-N(缺氮)中并于30℃下孵育3小时后收集并用70％乙醇固定。
[0224] 限制性温度条件下的不同cdc突变体以及缺氮下的细胞的预期中止点：
[0225] 1.Cdc10-V50＝G1中止：生长于限制性温度下的cdc10-V50细胞将在中止于G1，含一套(1C)DNA含量。cdc10-V50等位基因渗漏且该种群中小量细胞仍然会分裂。要获得完全G1中止，必须使cdc10-V50细胞氮饥饿。
[0226] 2.Cdc25-22＝G2中止＝生长于限制性温度下的Cdc25-22细胞将中止于G2期，含两套DNA含量。
[0227] 3.氮饥饿细胞＝G1中止。
[0228] 4.营养生长的野生型细胞(Eg544)大部分时间处于细胞周期的G2期，因此该种群中大部分细胞具有2套DNA含量。当氮饥饿时，野生型细胞将中止于G1期且含一套DNA含量。完全处于G1期需氮饥饿很多小时。本实验中细胞只饥饿3小时因此只有少量细胞中止于G1期且含一套DNA含量。
[0229] DNA含量分析、约3×106乙醇固定的细胞经RNA酶处理(50mM
柠檬酸钠中加入0.1mg/ml RNA酶A，pH 7.0，37℃过夜)，碘化丙锭染色(50mM柠檬酸钠中加入4μg/ml的PI，pH 7.0)，超声降解10秒钟并用流式细胞仪(用Bection-Dickinson FACSCalibur计数
10000个细胞)和本发明的装置分析。
[0230] 结果、用本发明的装置和标准流式细胞仪分析处于细胞周期的不同时期的酵母细胞。如图18所示，所述装置提供了准确且精准的细胞内DNA含量数据，其与流式细胞仪获得的数据相当。因此所述装置可用于酵母细胞的DNA含量的定量且可用于研究如细胞周期的调节。
[0231] 实施例17、Annexin V的细胞凋亡分析(参考图19和图20)
[0232] 早期凋亡的检测是基于一个事实，即健康的、未凋亡细胞中磷脂酰丝氨酸(PS)主要位于面向细胞质的细胞质膜的内叶。细胞膜在凋亡过程的早期还是完整的，但PS迁移到膜的外层。Annexins是以钙依赖性方式结合磷脂的细胞内一组蛋白，以及该组中的一个成员，Annexin V已被证实是检测凋亡细胞的有用工具，因为它优先结合带负电荷的磷酸脂如PS，但显示极少与卵磷脂和神经鞘髓磷脂结合。
[0233] 通过将荧光标记与Annexin V偶联，可以鉴定以及定量凋亡细胞。Annexin V也可结合凋亡晚期和坏死细胞的PS，但由于此类细胞的细胞膜已失去完整性，可以使用不渗透性染料如PI或DAPI使之与凋亡早期的细胞相区分。
[0234] 在此，用本发明的装置分析荧光标记的Annexin V，以染色凋亡和坏死的细胞，并且用PI区分早期和晚期凋亡/坏死细胞。
[0235] 材料与方法、Jurkat(JM)细胞用RPMI(Invitogen，Cat.No.61870)补以10％热-失活的胎牛血清(Invitogen，Cat.No.10108-165)，于37℃、含5％CO2的湿润空气条件下培养。向细胞中加入3μM喜树碱(Sigma，Cat.No.C-9911)以诱引凋亡。培养3小时后(37℃，5％CO2)用冷
磷酸盐缓冲液(PBS)收集细胞并根据Vybrant Apoptosis Assay
试剂盒#2的生产商操作说明用AlexaFluor 488-标记的Annexin V(分子探针，V13241)染色。将染色细胞上样到含有PI的盒子里。该盒子置于本发明的装置中并用所述装置及内部开发的软件进行细胞计数和研究。还用Olympus IX50荧光显微镜研究染色细胞。用Lumenera CCD照像机及内部开发的软件捕获图像。用U-MWIBA3(蓝色带通)滤光块(Olympus)检测AF488荧光，用U-MWG2(绿色长通)滤光块(Olympus)检测PI荧光。
[0236] 结果、用与本发明的装置相关的软件，测得凋亡细胞(AnnexinV偶联结合细胞)的5 4
浓度为2.6×10，而无活力细胞的浓度为4.5×10(如图19所示)。用荧光显微镜研究发现了以下三种细胞：只出现在相差中的细胞(活细胞)；对PI和荧光标记的Annexin V均显阳性的细胞(晚期凋亡或坏死细胞)；最后还有不包括PI但对荧光标记的Annexin V显阳性的细胞(早期凋亡细胞)(如图20所示)。
[0237] 替代方法、一种测定凋亡细胞占总细胞数比率的替代方法是将上述实施例17中的方法结合一种针对所有细胞的染色剂，如吖啶橙(AO)或一种只染色活细胞的染色剂，如DACM。比如，将所有细胞用AO或另一种能使所有细胞染色的化合物染色，结合荧光标记的Annexin V以染色凋亡细胞，以及结合不渗透性染色剂，染色无活力的细胞，或者将所有活细胞用DACM或另一种巯基反应探针染色，结合荧光标记的Annexin V以染色凋亡细胞，以及结合不渗透性染色剂，染色无活力的细胞。
[0238] 实施例18、通过监测线粒体膜电位的变化检测早期凋亡
[0239] 凋亡中非常早期的一个事件是线粒体膜电化学梯度崩解，随后是呼吸链解偶联。为了区分健康和凋亡细胞，基于这个现象的一种简单分析是，用阳离子染料如5，5′，6，
6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(JC-1)或四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐或其它在两种种群中显示不同荧光的化合物来染色细胞。其中一个例子是发现JC-1在健康的、未凋亡细胞的线粒体基质中形成红色荧光聚合体。然而线粒体膜电位下降时(例如与凋亡有关)，该染料则恢复成单体形式，与之相关的是大部分发射转为绿色。
[0240] 为了分析线粒体膜电位变化和由此产生的凋亡，用
选定的阳离子染料(如JC-1)培养细胞并用本发明的装置在相关的波长下进行分析。例如，如果使用JC-1，则要对红色到绿色的转变进行定量以测定凋亡细胞群。可包含细胞不渗透性DNA染料(如DAPI)以染色坏死细胞。
[0241] 实施例19、基于半胱天冬酶(Caspase)的分析(参考图23)
[0242] 凋亡的另一个早期标志是半胱天冬酶的活性。半胱天冬酶是半胱天冬氨酸特异性蛋白酶家族。半胱天冬酶介导细胞死亡并在细胞凋亡、坏死和
炎症中扮演重要角色。半胱天冬酶的调节发生在翻译后水平，因此可以被迅速激活。半胱天冬酶的识别位点是三个或四个氨基酸后接着一个天冬氨酸残基，断裂出现在天冬氨酸盐后。通过前体的蛋白酶
水解来活化半胱天冬酶，由于前体的断裂位点与半胱天冬酶的特异性相匹配，因此可以通过活化的半胱天冬酶来使前体相继激活。
[0243] 一种测量不同种类半胱天冬酶活性的方法是使用一种包含目的半胱天冬酶的识别位点的多肽基质与探针相连接，当天冬氨酸残基断裂后，使荧光特性发生改变。
[0244] 一个重要的细胞凋亡调节子是半胱天冬酶-3(CPP32，apopain，YAMA)，可放大启动半胱天冬酶如半胱天冬酶-8的信号。半胱天冬酶-3的荧光基质的实例是乙酰Asp-Glu-Val-Asp(乙酰-DEDV)7-氨基-4-甲基香豆素，其断裂生成荧光7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)部分。因此半胱天冬酶的活性可通过测量荧光来定量。同理也可测定其它半胱天冬酶的活性。
[0245] 以此方法用本发明的装置对半胱天冬酶的活性进行定量，细胞被渗透化/裂解并用与目的半胱天冬酶相对应的荧光基质孵育。孵育之后，用所述装置测定细胞荧光，并用于衡量半胱天冬酶的活性。
[0246] 另一种基于半胱天冬酶的细胞凋亡的分析方法是FLICA(带荧光素的半胱天冬酶
抑制剂分析)。这种分析法采用与荧光探针连接的半胱天冬酶特异性抑制剂序列，检测细胞内活化的半胱天冬酶。非细胞毒性的半胱天冬酶特异性抑制剂是细胞渗透性的并可穿过完整的细胞质膜，且可在活化的半胱氨酸异质二聚体的大亚基处与反应性半胱氨酸残基共价结合。没有结合的半胱天冬酶特异性抑制剂扩散出细胞外并被冲走，因此不存在前体半胱天冬酶或未活化酶形式的干扰。因此，测量荧光相当于直接测量整个活细胞中活化的半胱天冬酶量。
[0247] 用FLCA定量半胱天冬酶活性，用选定的与荧光探针连接的半胱天冬酶特异性抑制剂序列孵育被测细胞。冲洗细胞以去除未结合的抑制剂并用本发明的装置测定细胞的荧光，从而可以测量单个细胞水平上的半胱天冬酶活性。用于活细胞/所有细胞的染色剂如DACM或AO和/或无活力细胞的染色剂如DAPI/PI也可用于本分析。
[0248] 材料与方法、CHO细胞用RPMI(Invitogen，Cat，No.61870)补以10％热-激活的胎牛血清(Invitogen，Cat.No.10108-165)，于37℃，含5％CO2的湿润空气条件下培养。当克隆率为80％时，将细胞用1μM诺考达唑(Sigma，Cat.no.M1404)处理，或者不作处理。细胞培养16小时后用冰磷酸盐缓冲液(PBS)收集并用SR-VAD-FMK多聚半胱天冬酶FLICA(Immunochemistry Technologies，#91)按照生产商的操作说明染色。染色后，将所有活细胞用DACM((N-(7-二甲氨基-4-甲基-3-豆香素)-马来酰亚胺，WAKO Pure Chemical Industries，CAS no.55145-14-7))共染色，而无活力的细胞用SYTOX绿(Invitogen，S7020)染色。将染色的细胞置于NC-Slide中。将NC-Slide置于本发明的装置中，并用所述装置及其内部开发的软件进行细胞计数和研究。还用Olympus IX50荧光显微镜研究染色细胞。用U-MWG2(绿色长通)滤光块(Olympus)检测红色荧光(凋亡阳性)细胞，用U-MNUA2(UV带通)滤波块(Olympus)检测DACM阳性细胞，用U-MWIBA3(蓝色带通)滤波块(Olympus)检测SYTOX绿色荧光。
[0249] 结果、用与所述装置相关的软件，基于半胱天冬酶的活性-检测诺考达唑处理和未处理的细胞中凋亡细胞的浓度。基本上，与未处理的细胞相比，更多的诺考达唑处理过的细胞显示强烈的红色荧光(如图23所示)。此结果得到荧光显微镜目视观察结果的支持。
[0250] 实施例20、TUNEL
[0251] 细胞凋亡晚期的一个特征是核染色质断裂，其导致大量3’-羟基DNA末端产生。因此常用于检测凋亡晚期的方法是TUNEL(转移酶介导的三磷酸脱氧
鸟苷-生物素刻痕末端标记)。TUNEL法包括用末端脱氧核苷转移酶将生物素-dUTP或荧光标记的dUTP转移到断裂的DNA的链断裂处。使用生物素-dUTP时，生物素-标记的断裂位点进一步与荧光偶联的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素(如FITC抗生物素蛋白)反应从而对DNA的降解及由此引起的凋亡进行检测和定量。这可以直接用荧光标记-dUTP完成。由于未凋亡细胞中不存在暴露的3’-羟基DNA末端，未凋亡细胞与标记的dUTP
结合水平低。
[0252] 由于末端脱氧核苷转移酶必须进入到细胞内，因此酶反应前必须先将细胞质膜进行渗透化处理。为了避免因此导致的DNA片段丢失，渗透化处理前细胞先用甲
醛或戊二醛固定。该固定使DNA与其它细胞内组分交联并阻止其在渗透化期间被抽走。因此用本发明的装置检测凋亡晚期的程序如下：固定被测细胞然后渗透化。然后用末端脱氧核苷转移酶和dUTP-标记的优选标记物(生物素，荧光探针或
抗体)孵育细胞。孵育期间末端脱氧核苷转移酶催化dUTP与DNA的3’-羟基末端结合。染色细胞冲洗之后用所述装置进行研究，从而可以在单个细胞水平上测量凋亡。用于所有细胞的染色剂如DAPI，PI或AO可用于本分析(由于细胞被渗透化处理，渗透性以及不渗透性的染色剂都适用)。
[0254] 细胞增殖是测定培养基中分裂的细胞数量。快速且准确的评估细胞增殖是许多实验机构的基本要求，对于评估如化合物对真核细胞的细胞毒性、诱变或癌致作用，以及对于评估细胞倍增时间和验证细胞培养物的健康状况非常有用。评估这些参数的一种方法是测定生长曲线，然而，这不仅乏味且耗时间。分析细胞增殖的第二种方法是把DNA合成作为增殖的标记物。这些分析中，都对掺入DNA中的核酸-类似物进行定量。核酸-类似物掺入DNA中能直接与培养基中细胞分裂数量成比例。
[0255] 在一种分析方法中，在细胞孵育的最后2～24小时加入溴脱氧尿苷(Brd U)进行孵育。Brd U将掺入分裂中的细胞DNA中并可用抗-Brd U抗体进行检测和定量。为了便于抗体与掺入的Brd U相结合，细胞被渗透化且用一步固定/降解溶液使DNA变性。抗体孵育之后未结合的抗体被冲洗走，并加入识别抗Brd U抗体的荧光偶联第二抗体(如FITC标记的抗体)。未结合的第二抗体被冲洗走，并用本发明的装置对细胞内的荧光进行检测和定量。荧光信号强度与细胞中掺入的Brd U量成比例。除了评估细胞增殖外，可以在单细胞水平上从同一样品中获得如细胞数量以及细胞内
抗原等信息。
[0256] 第三种分析细胞增殖的方法包括用荧光染料标记细胞，所述荧光染料将留在细胞中但不影响细胞功能。细胞每分裂一轮，荧光强度减半。
[0257] 在一种分析方法中，用可自由向细胞内弥散的胺激活二
醋酸盐琥珀酰亚胺脂(通常称SE)孵育细胞。该荧光染料与细胞内蛋白以及细胞表面上的蛋白反应。一旦反应，荧光染料与蛋白共价连接并留在细胞内。用本发明的装置对细胞内荧光进行检测和定量，当细胞分裂时荧光强度随之减半。除了评估细胞增殖以外，可以在单细胞水平上从同一样品中获得如细胞数量、活力和细胞内抗原等信息。如细胞不渗透DNA染色剂(如DAPI)可用于本分析以测定死细胞比例。
[0258] 实施例22、荧光蛋白的检测和定量，以下称FRET分析
[0259] 现已开发出多种荧光蛋白变体，其荧光发射光谱几乎跨度整个可视光谱范围。分离自水母Aequorea victoria的原始绿色荧光蛋白的突变产生新的荧光探针，其
颜色从蓝色到黄色是生物研究中最常用的体外报告分子。已经从海莲Discosoma striate和珊瑚虫(Anthozoa)类的珊瑚礁中开发出波长较长的发橙色和红色光谱的荧光蛋白。本发明的装置可用于检测已知的荧光蛋白，包括BFP、CFP、GFP、GFP-uv、YFP、HcRed1、KFP1、mRFP1、mCherry和源于dsRED的其他变体。
[0260] 在一个分析方法中，荧光蛋白的编码区域与目的基因启动子(或增强子)相连接。融合结构转染到寄主细胞中，用所述装置很容易对所产生的荧光蛋白发出的荧光进行检测和定量。荧光信号强度与荧光蛋白表达水平成比例，这也是对目的基因的活性测量。因此本方法可用于研究不同生长条件下，目的基因的转录活性。
[0261] 在第二个分析方法中，荧光蛋白的编码区域与目的基因的编码区或部分编码区相连接。所述结构转染到寄主细胞中，用本发明的装置很容易对所产生的荧光蛋白发出的荧光进行检测和定量。荧光信号强度与荧光蛋白表达水平成比例，这也是对目的蛋白质水平的测量。本方法可用于研究不同生长条件下，目的蛋白质的动力学，如测量蛋白质的
稳定性和蛋白质的
半衰期。
[0262] 用荧光蛋白可以研究活细胞内蛋白-蛋白反应的分子动力学。一种检测分子相互反应的方法包括利用两种荧光蛋白之间或一种荧光蛋白与第二荧光团之间的荧光共振能量转移(FRET)。比如说，YFP和CFP可以作为FRET的供体受体，其中供体(青色)分子的激发引起受体(黄色)分子的发射，只要蛋白质间接近到足以发生能量转移。因此FRET可用于监测细胞中EYFP和ECFP融合蛋白之间直接的蛋白-蛋白相互作用。在一种分析方法中，青色荧光蛋白(CFP)的编码区与一种目的基因的编码区或部分编码区相连接。同样，黄色荧光蛋白(YFP)的编码区与第二目的基因的编码区或部分编码区相连接。两种融合蛋白在寄主细胞中共表达。用紫外光激发CFP并检测和定量YFP发出的黄色光。
[0263] 实施例23、用FISH进行DNA和RNA标记物的检测和定量
[0264] 荧光原位杂交(FISH)中，使用低放大率的荧光显微镜对获得准确且精准的有关细胞群内基因扩增和RNA标记物的表达水平的信息很有用。
[0265] 在一种分析方法中，细胞被渗透化且DNA用一步固定/降解溶液变性，有助于与特定核酸探针杂交，如荧光(如FITC标记抗体)标记的DNA、RNA、PNA和LNA。杂交后，未结合的荧光偶联探针被冲洗走并用本发明的装置进行细胞内荧光检测和定量。荧光信号强度与细胞内存在的DNA或RNA标记物的量成比例。本方法可用于DNA扩增，如HER2和TOP，以及RNA水平，如TERT mRNA的检测和定量。除了评估NDA和RNA标记物外，还可以在单细胞水平上从同一样品中获得有关细胞数量、DNA含量和抗原等的信息。
[0266] 实施例24、药物对哺乳动物细胞中DNA含量的影响(参考图21)
[0267] 以DAPI作为DNA染色剂测定诺考达唑(M期抑制剂)处理的CHO细胞以及喜树碱(S期抑制剂)处理的JM细胞的DNA含量。
[0268] 材料与方法、CHO细胞生长于RPMI+10％FCS到克隆率为80-90％时用0.5μM诺考达唑处理24小时。细胞用PBS冲洗一次，使胰蛋白酶化并离心收集后用乙醇固定。JM细胞5
生长于RPMI+10％FCS到浓度为5.0×10 个细胞/ml时用5μM喜树碱处理16小时。离心收集细胞并用PBS冲洗一次后用乙醇固定。CHO和JM细胞充分重悬于0.5ml BPS中，并向各细胞悬液加入4.5ml冰冻70％乙醇固定剂。细胞在固定剂中至少保持两小时后用DAPI染色。DAPI染色细胞于200×g离心5分种后收集，并用PBS冲洗一次。再一次离心后细胞重悬于DAPI染色溶液(100ml含0.1％(V/V)Triton X-100的PBS中加入0.1mg 4′，6二脒基-2-苯基吲哚；DAPI)并直接用本发明的装置进行分析。
[0269] 结果、用所述装置分析用影响不同细胞周期的药物处理的CHO和JM细胞的DNA含量。如图21所示，所述装置提供了准确且精准的细胞内DNA含量数据，可用于评估不同药物对细胞周期的影响。另外，所述装置可用于鉴别带DNA碎片的细胞(称sub-G1细胞)。DNA片段化是凋亡细胞死亡的一个标志。
[0270] 实施例25、凋亡分析Annexin V(参考图22)
[0271] 在此本发明的装置用于分析荧光标记的annexin V，以染色凋亡和坏死细胞；以及SYTOX绿，区分凋亡/坏死细胞的早期或晚期。另外，DACM用于染色所有活细胞。
[0272] 材料与方法、Jurkat细胞用RPMI(Invitogen，Cas.No.61870)补以10％热-激活的胎牛血清(Invitogen，Cas.No.10108-165)，于37℃、含5％CO2的湿润空气条件下培养。将细胞用1μM诺考达唑(Sigma，Cat.No.M1404)处理，或者未作处理。孵育(37℃，5％CO2)16小时后，细胞用冰BPS收集并用AlexaFluor 594-标记的annexin V(分子探针，A-13203)按生产商的操作说明染色。Annexin V使所有活细胞染色后，用DACM(N-(7-二甲氨基-4-甲基-3-豆香素)-马来酰亚胺，WAKO Pure Chemical Industries，CAS no.55145-14-7)共染色，无活力细胞用SYTOX绿(Invitogen，S7020)染色。将染色的细胞上样至NC-Slide内。NC-Slide置于本发明的装置中，并用所述装置及其内部开发的软件进行细胞计数和分析。还用Olympus IX50荧光显微镜分析染色细胞。用U-MWIBA3(蓝带通)滤光块(Olympus)检测SYTOX绿色荧光，用U-MWG2(绿长通)滤光块(Olympus)检测Annexin VAF594共轭物，用U-MNUA2(UV带通)滤光块(Olympus)检测DACM。
[0273] 结果、用与所述装置相关的软件测定诺考达唑处理和未处理细胞中凋亡细胞(Annexin V偶联细胞)的浓度。基于SYTOX绿染色计算无活力细胞的数量。对活细胞的分析显示，对照组细胞中小于10％是Annexin V阳性，诺考达唑处理细胞中有40％是Annexin V阳性(见图22)，而活细胞几乎不受影响。本结果得到荧光显微镜目视观察结果的支持。
[0274] 实施例26、通过监测线粒体膜电位变化检测凋亡早期(参考图24)
[0275] 已知线粒体膜电位的损失是凋亡和化学-缺氧-诱导坏死的前奏。亲脂性阳离子染料JC-1(5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物)在线粒体中呈现电位依赖性聚集，从而提供一种简便的基于荧光的方法以区分健康和凋亡细胞。在健康细胞中，完整线粒
体细胞膜形成的负电荷性电位有利于JC-1在线粒体基质中的聚集。浓度高时JC-1形成聚合体并变成红色荧光。在凋亡细胞中的线料体电位崩解，JC-1以单体绿色荧光形式存在于细胞质中。细胞不渗透的DNA染色剂(如DAPI)可用于染色坏死和凋亡晚期细胞。
[0276] 材料与方法、Jurkat细胞生长于RPMI+10％FCS至浓度为5.0×105个细胞/ml，并用10μM喜树碱(诱导凋亡药物)处理5小时。于37℃下用2.5μg/ml JC-1使细胞染色10分钟，用PBS冲洗，重悬于PBS+1μg/ml DAPI并用本发明的装置分析。
[0277] 结果、用所述装置分析JC-1和DAPI染色的Jurkat细胞(图24)。对红色和绿色荧光定量以鉴别凋亡细胞(图24A)。通过计数DAPI(蓝色)阳性细胞以评估坏死/凋亡晚期的细胞数量(图24B)。如图24所示，所述装置可用于鉴别线粒体膜电位崩解的细胞和鉴别处于凋亡早期的细胞。
[0278] 实施例27、抗原的检测和定量(参考图25)
[0279] 放大率低的荧光显微镜对从细胞种群中获得准确且精准的有关抗原(如细胞内和细胞表面蛋白)表达水平的信息很有用。
[0280] 这种实施例如下所述。细胞用识别抗原的一级抗体孵育。抗体孵育后，未结合的抗体被冲洗走，并向溶液中加入识别一级抗体的荧光偶联的二级抗体(如FITC或PE标记的抗体)。未结合的二级抗体被冲洗走并用本发明的装置检测和定量细胞内荧光。荧光信号的强度与细胞内的抗原量成比例。此方法可用于检测和定量不同的细胞内抗原，如HER2、EGFR、VGFR、UPR和CD分子包括CD3、CD4和CD8。除了评估抗原，还可以在单细胞水平上获得如细胞数量、活力和DNA含量等信息。通过类似的方法，将细胞进行固定和渗透化处理后用抗体孵育，可以检测细胞内抗原如癌症标记TERT、TOP和Survivin。细胞内标记的检测不是与活力测定相结合，它可以与定量如DNA含量，以及细胞周期描述相结合。
[0281] 材料与方法、按生产商的操作说明通过阳性选择以抗-CD3微球(Miltenyi Biotec)，从含有淋巴细胞部分的淋巴细胞分离剂(Axis-Shield，#1114544)分离的血块黄层中纯化CD3+阳性T细胞。然后将细胞用一级CD3特异性抗体染色，并且在孵育30分钟后冲洗细胞，然后用R-藻红蛋白(PE)标记的二级抗体(抗体购自BD BioSciences)染色。孵育30分钟后再次冲洗细胞并用DACM((N-(7-二甲氨基-4-甲基-3-豆香素)-马来酰亚胺，WAKO Pure Chemical Industries，CAS no.55145-14-7))共染色所有的活细胞。将染色的细胞装入NC-Slide。将NC-Slide置于本发明的装置中，并用所述装置及其内部开发的软件进行细胞计数和研究。
[0282] 结果、用所述装置分析使用CD3-选择性微球纯化的细胞，我们发现95％的细胞被PE偶联抗体染色，说明所有细胞中有95％表达CD3(如图25)。这与通过微球纯化进行阳性筛选的细胞经流式细胞仪正常得到的数据一致。
[0283] 本
说明书提到的“一个实施方式”或“一种实施方式”是指本发明的至少一个实施方式中包括了与所述实施方式相关的特定的性质、结构或特征。因此，在此强调并需要理解的是，本说明书中不同部分提到的两个或多个“一个实施方式”或“一种实施方式”或“一种替代实施方式”不一定全部指相同实施方式。此外，特定的性质、结构或特征可适当地在本发明的一个或多个实施方式中相结合。
[0284] 综上所述，为了解释说明，已经列出大量具体细节以便充分理解本发明。然而，很明显对本领域技术人员来说，在没有这些具体细节的情况下也可以实施本发明。
[0285] 相应地，本发明的范围和精神应该由所附
权利要求限定。
