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磁小体促进微 生物电 发酵还原CO2制备甲烷的方法

阅读：986发布：2020-05-11

专利汇可以提供磁小体促进微生物电发酵还原CO2制备甲烷的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及生物质能利用技术，旨在提供一种磁小体促进微生物电发酵还原CO2制备甲烷的方法。该方法包括以下步骤：(1)从处于对数生长期的磁螺菌中提取纯化的磁小体；(2)微生物电发酵系统采用三电极体系；取小分子有机酸盐作为碳源，与厌氧活性污泥一并加入系统中，以磁小体作为外源性导电添加剂；将系统密封通入纯氮排除空气，然后连接电化学工作站，启动运行后小分子有机酸盐在石墨棒阳极被电解产生CO2，CO2在石墨棒阴极被还原产生甲烷。本发明能够有效提升生物甲烷浓度，减少后续沼气提纯成本；能够有效优化系统的电子传递性能，使具有氧化还原活性的胞外聚合物含量提高，有效富集负责还原CO2产甲烷的微生物。，下面是磁小体促进微生物电发酵还原CO2制备甲烷的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种磁小体促进微生物电发酵还原CO2制备甲烷的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)从处于对数生长期的磁螺菌中提取纯化的磁小体；
(2)微生物电发酵系统采用三电极体系，其工作体积为50mL；以两个石墨棒电极作为阴极和阳极，以Ag/AgCl电极作为参比电极；取1g小分子有机酸盐作为电发酵系统的碳源，与作为接种菌体的厌氧活性污泥一并加入系统中，厌氧活性污泥与小分子有机酸盐的总挥发性固体物质量比例为2:1；调节系统中混合物的pH值至7.5，然后将磁小体作为外源性导电添加剂加入系统中，控制加入量使其在系统中的浓度为100mg/L；
(3)将微生物电发酵系统密封，通入纯氮10分钟排除空气；然后将系统连接电化学工作站，在37℃条件下施加电势-0.6V～-0.8V，启动运行，小分子有机酸盐在石墨棒阳极被电解产生CO2，CO2在石墨棒阴极被还原产生甲烷；利用气相色谱仪测试甲烷产物浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，通过超声波破碎提取法从磁螺菌中提取纯化磁小体，具体包括：将磁螺菌培养至对数生长期，将菌体离心收集并重新悬浮于磷酸缓冲液；在冰浴环境中超声破碎细胞，控制功率100W、破碎10s、间隔10s，共重复50次；用磁铁吸附分离磁小体，以磷酸缓冲液洗涤5次，得到纯化的磁小体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，以摩尔浓度为6mol/L的NaOH和HCl溶液调节混合物的pH值。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述小分子有机酸盐是乙酸盐、丙酸盐或丁酸盐中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述厌氧活性污泥取自稳定运行的电发酵产甲烷反应器，富含电活性细菌和产甲烷古菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述石墨棒电极的直径为
0.5cm，长度为7.5cm。

说明书全文

磁小体促进微 生物电 发酵还原CO2制备甲烷的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物质能利用技术，特别涉及一种磁小体促进微生物电发酵还原CO2制备甲烷的方法。

背景技术

[0002] 在能源危机和环境污染不断加剧形势下，利用可替代原料生产先进的生物能源日益引起人们关注。厌氧发酵是一种应用广泛的有机废弃物处理并且能源化利用制生物甲烷的方式，它是在多种微生物协同作用下的多阶段多相的生物化学过程。复杂大分子有机物(如多糖、蛋白质、脂质等)首先由水解细菌降解为单糖、氨基酸等小分子有机物，再在产酸菌作用下继续降解为小分子挥发性脂肪酸和醇。酸化阶段产生的挥发性脂肪酸和醇可以在产乙酸菌作用下转化为乙酸、CO2、H2等，进而被产甲烷菌利用转化为甲烷。在产乙酸菌与产甲烷菌的互营代谢阶段，近年发现一种不需要电子传递载体(如氢气、甲酸等)的传递机制——种间直接电子传递(Direct Interspecies Electron Transfer，DIET)。此电子传递方式更有利于节约能量，吉布斯自由能更低故更有利于热力学反应。

[0003] 为了强化甲烷菌通过直接电子传递方式获得电子还原CO2产甲烷，可以在发酵系统中插入电极并施加一定电势以提供电子。有学者发现外加电流可有效提高不同目标产物的产量，这是因为生物电化学系统中通过调节胞外氧化还原电位(ORP)可以影响微生物代谢路径进而影响产物生成。而为了强化厌氧发酵微生物间的互养代谢和协同作用能力，可以向厌氧发酵系统中添加导电材料，如金属纳米颗粒和碳基导电材料等(包括颗粒活性炭、生物炭和炭布在内的碳基导电材料以及赤铁矿、磁铁矿等)，以缩短产甲烷启动的迟滞时间，提高甲烷生产速率产量和对抑制条件的抵抗能力。有研究报道添加导电材料后反应器中的产电微生物(如Geobacter)丰度显著提高，产电细菌与接收电子还原CO2的产甲烷古菌可以通过DIET互养代谢产甲烷，在这种模式下产甲烷速率不受反应器中氢分压的限制。

[0004] 上述在发酵系统中插入电极外加电流的技术虽然可以改善微生物与电极之间的电子传递，但是微生物的种间直接电子传递仍有待通过添加外源性导电物质进行强化；上述向发酵系统中添加导电物质的技术也存在一些缺点，例如金属纳米颗粒分散性较差、生物相容性不佳，传统碳基导电材料比表面积相对较小、难以回收循环利用等，限制了其在厌氧发酵中的应用。总的来说，单独施加一定电势或者添加导电材料的技术对发酵系统性能提升效果有限，系统产生的生物甲烷浓度不够高，需要进一步沼气提纯，工艺繁琐；系统中微生物的电子传递性能不佳，难以满足还原CO2的电子传递需求；在微生物胞外电子传递中发挥重要作用的氧化还原活性胞外聚合物的含量不高；系统中负责还原CO2产甲烷的微生物有待进一步富集等。因此，本发明提出选用分散性好、生物相容性好、比表面积大、可通过磁力分离等方式回收循环利用的磁小体作为外源性导电添加剂，采用外加电势与添加磁小体协同强化微生物电子传递的技术手段，有望解决上述技术问题。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种磁小体促进微生物电发酵还原CO2制备甲烷的方法。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：

[0007] 提供一种磁小体促进微生物电发酵还原CO2制备甲烷的方法，具体包括以下步骤：

[0008] (1)从处于对数生长期的磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)中提取纯化的磁小体；

[0009] (2)微生物电发酵系统采用三电极体系，其工作体积为50mL；以两个石墨棒电极作为阴极和阳极，以Ag/AgCl电极作为参比电极；取1g小分子有机酸盐作为电发酵系统的碳源，与作为接种菌体的厌氧活性污泥一并加入系统中，厌氧活性污泥与小分子有机酸盐的总挥发性固体物(TVS)质量比例为2:1；调节系统中混合物的pH值至7.5，然后将磁小体作为外源性导电添加剂加入系统中，控制加入量使其在系统中的浓度为100mg/L；

[0010] (3)将微生物电发酵系统密封，通入纯氮10分钟排除空气；然后将系统连接电化学工作站，在37℃条件下施加电势-0.6V～-0.8V，启动运行，小分子有机酸盐在石墨棒阳极被电解产生CO2,CO2在石墨棒阴极被还原产生甲烷，利用气相色谱仪测试甲烷产物浓度。

[0011] 本发明中，在步骤(1)中，通过超声波破碎提取法从磁螺菌中提取纯化磁小体，具体包括：将磁螺菌培养至对数生长期，将菌体离心收集并重新悬浮于磷酸缓冲液；在冰浴环境中超声破碎细胞，控制功率100W、破碎10s、间隔10s，共重复50次；用磁铁吸附分离磁小体，以磷酸缓冲液洗涤5次，得到纯化的磁小体。

[0012] 本发明中，在步骤(2)中，以摩尔浓度为6mol/L的NaOH和HCl溶液调节混合物的pH值。

[0013] 本发明中，在步骤(2)中，所述小分子有机酸盐是乙酸盐、丙酸盐或丁酸盐中的任意一种。

[0014] 本发明中，在步骤(2)中，所述厌氧活性污泥取自稳定运行的电发酵产甲烷反应器，富含电活性细菌和产甲烷古菌。

[0015] 本发明中，在步骤(2)中，所述石墨棒电极的直径为0.5cm，长度为7.5cm。

[0016] 发明原理描述：

[0017] 磁小体是在趋磁细菌胞内合成的磁性纳米颗粒，尺寸约为20-120nm，成分为四氧化三铁或四硫化三铁，磁小体的尺寸形态和成分组成取决于趋磁菌种类，每种趋磁细菌合成的磁小体尺寸形态是均一的。本发明使用的磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense strain MSR-1)是一种较为典型的趋磁细菌，螺旋状细胞含有数量不等的40-45nm立方体磁铁矿，磁小体呈链状排列，是十分优良的生物磁性纳米材料。与一般人造磁铁矿相比，磁小体不易聚集，具有良好的分散性，带有大量生物活性基团，可用于与其他分子的共价连接，具有良好的生物相容性和安全性。另外，磁小体能通过磁力分离等方式从电发酵系统中有效回收再利用。作为一种厌氧发酵生物反应器添加剂，导电磁小体具有促进细菌胞外的电子传递潜力，能强化电活性细菌和产甲烷古菌的种间直接电子传递。

[0018] 以往研究表明在发酵系统中施加电流或添加导电材料可以改善系统性能，提高目标产物的生成量。但是微生物电发酵系统添加磁小体强化直接电子传递过程促进CO2还原制备甲烷尚未见文献报道。在添加磁小体的微生物电发酵系统中存在着直接电子传递方式：(1)直接接触传递机制，附着在电极表面的微生物通过生物膜上的电子传递蛋白接收或释放电子；(2)纳米导线传递机制，电活性细菌(如地杆菌)通过自身生长的菌毛(pili)或纳米导线(conductive nanowire)与其他微生物或电极接触传递电子；(3)电子穿梭体传递机制，微生物通过分泌具有氧化还原活性的胞外聚合物(EPS)作为电子穿梭体进行电子传递；(4)导电材料传递机制，微生物之间通过外加的导电材料介导电子传递。在磁小体和外加电流协同作用下的胞外电子传递方式、菌群结构以及产甲烷代谢路径的演变机制值得深入研究。

[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0020] 1、本发明能够有效提升生物甲烷浓度：从46％提高到73％～87％，有利于减少后续沼气提纯成本；

[0021] 2、本发明能够有效优化系统的电子传递性能：基于循环伏安特性曲线的表观电子-1传递常数从0.030提高到0.092～0.108s ，系统中厌氧活性污泥导电能力从6.9μs/cm提高到18.6～21.9μs/cm，用来满足还原CO2的电子需求；

[0022] 3、本发明能够使具有氧化还原活性的胞外聚合物含量提高：氧化还原活性胞外聚合物在微生物胞外电子传递中发挥着重要作用，本发明能够使具有氧化还原活性的胞外聚合物——类黄腐酸含量从11.2％提高到19.1～20.0％，类腐殖酸含量从11.7％提高到12.2～12.8％；

[0023] 4、本发明能够有效富集负责还原CO2产甲烷的微生物：电活性细菌主要为地杆菌，其相对丰度从15.1％提高到32.9～36.8％；产甲烷古菌主要为甲烷八叠球菌，其相对丰度从15.8％提高到33.9～34.8％。附图说明

[0024] 图1为本发明的实现流程图。

具体实施方式

[0025] 首先需要说明的是，本发明所用各设备(如微生物电发酵系统、电化学工作站)均为现有技术，本领域技术人员可通过公开途径购置或自行搭建。本发明所用各菌种(例如磁螺菌、电活性细菌、产甲烷古菌等)均为现有技术，本领域技术人员可通过公开途径购置或自行培育获得，本发明对菌种的培育方法不再赘述。

[0026] 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0027] 实施例1

[0028] 将磁螺菌培养至对数生长期，离心收集菌体并重新悬浮于磷酸缓冲液，在冰浴环境中超声破碎细胞(功率100W，破碎10s，间隔10s，重复50次)，用磁铁吸附分离磁小体，用磷酸缓冲液洗涤5次得到纯化的磁小体样品，将磁小体作为外源性导电添加剂强化微生物电发酵系统中的电子传递性能。采用小分子有机酸盐作为电发酵系统的碳源，选取富含电活性细菌和产甲烷古菌的厌氧活性污泥(取自稳定运行的电发酵产甲烷反应器)作为接种菌体。微生物电发酵系统采用三电极体系，选取两个石墨棒电极(Φ0.5cm×7.5cm)作为阴极和阳极，Ag/AgCl电极作为参比电极。将1g小分子有机酸盐和厌氧活性污泥加入工作体积为50mL系统中，活性污泥与小分子有机酸盐的总挥发性固体物(TVS)质量比例为2:1。以摩尔浓度为6mol/L的NaOH和HCl溶液调节此混合物的pH值至7.5，再加入浓度为100mg/L的磁小体。将系统密封后通入高纯氮气10分钟排除空气，再将该系统连接电化学工作站，在温度37℃条件下施加电势-0.6V启动运行。电活性细菌(主要为地杆菌)在石墨棒阳极表面形成生物膜，分解-乙酸盐产生电子：CH3COO-+2H2O→2CO2+7H++8e-；产甲烷古菌(主要为甲烷八叠球菌)在石墨棒阴极表面形成生物膜，利用电极产生的电子还原CO2(由阳极生物膜电解乙酸盐产生)转化为甲烷：CO2+8H++8e-→CH4+2H2O，利用气相色谱仪测试甲烷产物浓度。在磁小体和外加电流协同作用下，甲烷浓度从46％提高到73％；微生物电发酵系统的电化学性能得到有效提升：基于循环伏安特性曲线的表观电子传递常数从0.030提高到0.092s-1，系统中活性污泥导电能力从6.9μs/cm提高到18.6μs/cm；胞外聚合物类黄腐酸含量从11.2％提高到19.1％，类腐殖酸含量从11.7％提高到12.2％；微生物群落和产甲烷代谢分析表明：电活性细菌主要为地杆菌，其相对丰度从15.1％提高到32.9％，产甲烷古菌主要为甲烷八叠球菌，其相对丰度从15.8％提高到33.9％。

[0029] 实施例2

[0030] 将磁螺菌培养至对数生长期，离心收集菌体并重新悬浮于磷酸缓冲液，在冰浴环境中超声破碎细胞(功率100W，破碎10s，间隔10s，重复50次)，用磁铁吸附分离磁小体，用磷酸缓冲液洗涤5次得到纯化的磁小体样品，将磁小体作为外源性导电添加剂强化微生物电发酵系统中的电子传递性能。采用小分子有机酸盐作为电发酵系统的碳源，选取富含电活性细菌和产甲烷古菌的厌氧活性污泥(取自稳定运行的电发酵产甲烷反应器)作为接种菌体。微生物电发酵系统采用三电极体系，选取两个石墨棒电极(Φ0.5cm×7.5cm)作为阴极和阳极，Ag/AgCl电极作为参比电极。将1g小分子有机酸盐和厌氧活性污泥加入工作体积为50mL系统中，活性污泥与小分子有机酸盐的总挥发性固体物(TVS)质量比例为2:1。以摩尔浓度为6mol/L的NaOH和HCl溶液调节此混合物的pH值至7.5，再加入浓度为100mg/L的磁小体。将系统密封后通入高纯氮气10分钟排除空气，再将该系统连接电化学工作站，在温度37℃条件下施加电势-0.7V启动运行。电活性细菌(主要为地杆菌)在石墨棒阳极表面形成生物膜，分解丙酸盐产生电子：CH3CH2COO-+2H2O→CH3COO-+CO2+6H++6e-；产甲烷古菌(主要为甲烷八叠球菌)在石墨棒阴极表面形成生物膜，利用电极产生的电子还原CO2(由阳极生物膜电解丙酸盐产生)转化为甲烷：CO2+8H++8e-→CH4+2H2O，利用气相色谱仪测试甲烷产物浓度。
在磁小体和外加电流协同作用下，甲烷浓度从46％提高到81％；微生物电发酵系统的电化学性能得到有效提升：基于循环伏安特性曲线的表观电子传递常数从0.030提高到0.102s-1，系统中活性污泥导电能力从6.9μs/cm提高到20.7μs/cm；胞外聚合物类黄腐酸含量从
11.2％提高到19.7％，类腐殖酸含量从11.7％提高到12.6％；微生物群落和产甲烷代谢分析表明：电活性细菌主要为地杆菌，其相对丰度从15.1％提高到33.9％；产甲烷古菌主要为甲烷八叠球菌，其相对丰度从15.8％提高到34.1％。

[0031] 实施例3

[0032] 将磁螺菌培养至对数生长期，离心收集菌体并重新悬浮于磷酸缓冲液，在冰浴环境中超声破碎细胞(功率100W，破碎10s，间隔10s，重复50次)，用磁铁吸附分离磁小体，用磷酸缓冲液洗涤5次得到纯化的磁小体样品，将磁小体作为外源性导电添加剂强化微生物电发酵系统中的电子传递性能。采用小分子有机酸盐作为电发酵系统的碳源，选取富含电活性细菌和产甲烷古菌的厌氧活性污泥(取自稳定运行的电发酵产甲烷反应器)作为接种菌体。微生物电发酵系统采用三电极体系，选取两个石墨棒电极(Φ0.5cm×7.5cm)作为阴极和阳极，Ag/AgCl电极作为参比电极。将1g小分子有机酸盐和厌氧活性污泥加入工作体积为50mL系统中，活性污泥与小分子有机酸盐的总挥发性固体物(TVS)质量比例为2:1。以摩尔浓度为6mol/L的NaOH和HCl溶液调节此混合物的pH值至7.5，再加入浓度为100mg/L的磁小体。将系统密封后通入高纯氮气10分钟排除空气，再将该系统连接电化学工作站，在温度37℃条件下施加电势-0.8V启动运行。电活性细菌(主要为地杆菌)在石墨棒阳极表面形成生- - + -
物膜，分解丁酸盐产生电子：CH3(CH2)2COO +2H2O→CH3CH2COO+CO2+6H+6e；产甲烷古菌(主要为甲烷八叠球菌)在石墨棒阴极表面形成生物膜，利用电极产生的电子还原CO2(由阳极生物膜电解丁酸盐产生)转化为甲烷：CO2+8H++8e-→CH4+2H2O，利用气相色谱仪测试甲烷产物浓度。在磁小体和外加电流协同作用下，甲烷浓度从46％提高到87％；微生物电发酵系统的电化学性能得到有效提升：基于循环伏安特性曲线的表观电子传递常数从0.030提高到
0.108s-1，系统中活性污泥导电能力从6.9μs/cm提高到21.9μs/cm；胞外聚合物类黄腐酸含量从11.2％提高到20.0％，类腐殖酸含量从11.7％提高到12.8％；微生物群落和产甲烷代谢分析表明：电活性细菌主要为地杆菌，其相对丰度从15.1％提高到36.8％；产甲烷古菌主要为甲烷八叠球菌，其相对丰度从15.8％提高到34.8％。

[0033] 最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

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