一种元麦提取物的制备方法及其在细胞抗氧化方面的用途
专利汇可以提供一种元麦提取物的制备方法及其在细胞抗氧化方面的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种元麦提取物的制备方法及其在抗 氧 化方面的用途，属于食品功能开发领域。以新鲜元麦为原料，用 乙醇 提取其中的活性物质，并通过有机 试剂 萃取、浓缩、 真空 冷冻干燥 ，制备元麦提取物；建立H2O2诱导细胞损伤模型，采用MTT法、 试剂盒 检测法发现，元麦提取物对氧化应激下的细胞存活率有显著提高，能够明显降低细胞中ROS 水 平，提高超氧化物歧化酶酶活、还 原型 谷胱甘肽含量，降低细胞外乳酸脱氢酶的释放量，在抗氧化方面的用途十分显著。本发明处理方式简单，深度利用元麦资源，以接近于体内生理状况的方式发明了元麦提取物在细胞抗氧化方面的作用；提取物为固体粉末，不仅易于运输，而且可作为辅料添加在食品中，应用范围十分广泛。，下面是一种元麦提取物的制备方法及其在细胞抗氧化方面的用途专利的具体信息内容。
1.一种元麦提取物的制备方法及其在抗氧化方面的用途，其特征在于，以新鲜元麦为原料，从中提取、制备高活性物质，通过H2O2诱导建立细胞氧化损伤模型，采用MTT的方法测定元麦提取物对细胞活力的保护作用；采用试剂盒检测的方法研究细胞ROS水平、细胞抗氧化酶酶活(如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、细胞中关键抗氧化剂含量(如还原型谷胱甘肽(GSH))、以及表征细胞膜完整性重要酶酶活(如乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH))的变化情况，发现了元麦提取物在细胞抗氧化方面的显著效果。具体方法如下：
(1)元麦的预处理：称取颗粒饱满、洗净晾干的元麦仁，粉碎后过40-80目筛，得到元麦粉末；
(2)提取液的制备：称取元麦粉末，按照1∶10-1∶20料液比(以元麦粉末质量倍数计)加入浓度为40-80％乙醇-水溶液(以乙醇-水溶液体积百分比计)，充分搅拌混匀，在30-50℃水浴条件下超声处理2-8h，再以3000-8000rpm/min条件离心5-10min，重复提取2-5次，收集上清为元麦提取液；
(3)提取液的浓缩：将提取液装入体积合适的圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪，以80-
150rpm/min为转速，恒温25-50℃为水浴条件进行蒸干，加入1-5mL纯水，反复摇晃震荡烧瓶，使瓶底的残余物溶解，收集溶解后的液体为浓缩液；
(4)提取液的萃取：在浓缩液中加入少量饱和食盐水，再按1∶1比例(以浓缩液体积倍数计)加入乙酸乙酯进行萃取，震荡摇匀、静止5-15min，待完全分层，重复萃取3-5次，收集上层萃取液；
(5)提取物的制备：将萃取液置于旋转蒸发仪，以80-150rpm/min为转速，恒温25-50℃为水浴条件进行蒸干，加入1-5mL纯水，反复摇晃震荡烧瓶，使瓶底的残余物溶解，收集液体于零下20-80℃预冷24-60h，再以零下40-65℃条件真空冷冻干燥18-60h，得到元麦提取物；
(6)细胞的培养：取出保存于-80℃液氮中的细胞冻存管，在37℃温水中轻轻摇动，将融化后的细胞冻存液移至离心管中，加入2-5mL含有100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、1％
1mol/L Heps缓冲液的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose(DMEM)培养基(分别以DMEM培养基体积浓度、体积浓度、体积百分比计，以Heps缓冲液体积浓度计)，
1000rpm/min条件下离心3-7min，舍弃上清液，之后加入5-30mL含有20％胎牛血清的上述培养基(以加入血清后培养基体积百分比计)，吹打均匀，转移细胞悬液至底面积为25-75cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积浓度计)进行培养；
(7)细胞的传代：在步骤(6)培养瓶中加入2-10mL胰蛋白酶，轻轻摇晃后放入步骤(6)恒温箱，消化贴壁细胞1-5min，期间取出培养瓶，在物镜为10倍的显微镜下观察，直至细胞基本由贴壁条状或片状变为游离状即可，加入5-15mL步骤(6)不含血清培养基终止反应，
3000rpm/min离心5min后，在沉淀中加入5-30mL步骤(6)含血清培养基，吹打成细胞悬液，转移至新培养瓶，待细胞长满至瓶底面积70-90％时进行下一次传代；
(8)细胞氧化损伤模型的建立：选取步骤(7)培养至3-6代的细胞进行建模，向消化后的
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细胞沉淀中加入适量培养基，吹打成单细胞悬液，浓度为1×10-1×10个/mL(以单细胞悬液体积浓度计)，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液，最外圈用100μL无菌蒸馏水替代加入，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积百分比计)培养24-48h，之后待细胞长满至96孔板底部，加入终浓度为400-2400μmol/L的H2O2-水溶液(以H2O2-水溶液体积浓度计)，培养2-48h；
(9)元麦提取物的保护作用：选取步骤(7)培养至3-6代的细胞，制成1×105-1×106个/mL单细胞悬液(以单细胞悬液体积浓度计)，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液，最外圈用
100μL无菌蒸馏水替代加入，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积百分比计)培养24-48h，待细胞长满至96孔板底部，取出，加入终浓度为1-20μg/mL的元麦提取物(以提取物溶液的体积浓度计)，培养时间6-48h；
(10)具有抗氧化活性食品的制备：将本发明的元麦提取物以一定比例直接加入液体饮料中，制成功能性饮料，也可以加入固体食品中，用于面包、面条、饼干、糖果、固体饮料等的制作。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照1∶10-1∶20料液比加入浓度为40-80％乙醇-水溶液，充分搅拌混匀，在30-50℃条件下水浴超声2-8h，3000-8000rpm/min条件离心
5-10min，重复提取2-5次，收集上清，料液比以元麦粉末质量倍数计，乙醇浓度以乙醇-水溶液体积百分比计。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将提取液装入圆底烧瓶，置于旋转蒸发仪，
80-150rpm/min、25-50℃条件下水浴蒸干，加入1-5mL纯水，反复摇晃，使瓶底残余物溶解，收集溶解后的液体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在浓缩液中加入少量饱和食盐水，按照1∶1比例加入乙酸乙酯，萃取、震荡摇匀，待完全分层，重复萃取3-5次，收集上层萃取液，乙酸乙酯加入量以浓缩液体积倍数计。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将萃取液置于旋转蒸发仪，以80-150rpm/min为转速，恒温25-50℃为水浴条件进行蒸干，加入1-5mL纯水，反复摇晃，使瓶底残余物溶解，收集液体于零下20-80℃预冷24-60h，再以零下40-65℃条件真空冷冻干燥18-60h，得到元麦提取物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在37℃水浴中复苏细胞，转移至离心管中，加入2-5mL含有100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、1％1mol/L Heps缓冲液的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose(DMEM)培养基，1000rpm/min条件下离心3-7min，舍弃上清，加入5-30mL含有20％胎牛血清的上述培养基，吹打均匀，转移细胞悬液至底面积为25-75cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱进行培养，青霉素、链霉素、Heps缓冲液的加入量分别以DMEM培养基体积浓度、体积浓度、体积百分比计，胎牛血清加入量以加入双抗、Heps缓冲液、胎牛血清之后的培养基体积百分比计，二氧化碳浓度以培养箱体积浓度计，所述细胞可以是人肝癌细胞、人脐静脉内皮细胞、人视网膜色素上皮细胞等常用细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选取培养至3-6代的细胞，待细胞长满至瓶底面积70-90％时，建立细胞氧化损伤模型，向消化后的细胞沉淀中加入适量培养基，吹打成单细胞悬液，浓度为1×105-1×106个/mL，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液，最外圈用
100μL无菌蒸馏水替代加入，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱培养24-48h，之后待细胞长满至96孔板底部，加入终浓度为400-2400μmol/L的H2O2-水溶液，培养2-48h，细胞浓度以单细胞悬液体积浓度计，二氧化碳浓度以培养箱体积百分比计，H2O2浓度以96孔板每孔中细胞培养液体积浓度计。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选取培养至3-6代的细胞，待细胞长满至瓶底面积70-90％时，制成1×105-1×106个/mL单细胞悬液，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液，最外圈用100μL无菌蒸馏水替代加入，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱培养
24-48h，待细胞长满至96孔板底部，取出分组：(1)对照组为既不暴露于元麦提取物保护，又不受H2O2刺激的细胞；(2)氧化损伤组为仅受H2O2刺激的细胞，即权利要求8处理的细胞；(3)实验组为先暴露于终浓度1-20μg/mL元麦提取物，培养6-48h，再受终浓度400-2400μmol/L H2O2-水溶液刺激的细胞，培养时间为2-48h，细胞浓度以单细胞悬液体积浓度计，二氧化碳浓度以培养箱体积百分比计，元麦提取物浓度、H2O2浓度以96孔板每孔中细胞培养液体积浓度计。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将本发明的元麦提取物以一定比例直接加入液体饮料中，制成功能性饮料，也可以加入固体食品中，用于面包、面条、饼干、糖果、固体饮料等的制作，一般优选1-20％，优选5-10％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，元麦提取物对氧化应激下的细胞存活率有显著提高，能够明显降低细胞中ROS水平，提高超氧化物歧化酶酶活、还原型谷胱甘肽含量，降低细胞外乳酸脱氢酶的释放量，在抗氧化方面的用途十分显著。
一种元麦提取物的制备方法及其在细胞抗氧化方面的用途
一、技术领域
1000rpm/min条件下离心3-7min，舍弃上清液，之后加入5-30mL含有20％胎牛血清的上述培养基(以加入血清后培养基体积百分比计)，吹打均匀，转移细胞悬液至底面积为25-75cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积浓度计)进行培养；
后的细胞沉淀中加入适量培养基，吹打成单细胞悬液，浓度为1×10 -1×10 个/mL(以单细胞悬液体积浓度计)，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液，最外圈用100uL无菌蒸馏水替代加入，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱(以培养箱体积百分比计)培养24-48h，之后待细胞长满至96孔板底部，加入终浓度为400-2400μmol/L的H2O2-水溶液(以96孔板中每孔细胞培养液体积浓度计)，培养2-48h；
75cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温培养箱进行培养。待细胞长满至瓶底面积70-90％时，加入3mL胰蛋白酶，消化贴壁细胞2min，期间取出培养瓶，在物镜为
10倍的显微镜下观察，直至细胞基本由贴壁条状或片状变为游离状即可，加入5mL不含血清培养基终止反应，3000rpm/min离心5min后，向细胞沉淀中加入适量培养基，吹打成单细胞悬液，浓度为1×105-1×106个/mL。
(1)对照组为既不暴露于元麦提取物保护，又不受H2O2刺激的细胞；(2)氧化损伤组为仅受到H2O2刺激的细胞；(3)实验组为先暴露于1、2、5、10μg/mL元麦提取物，再受到2400μmol/L H2O2刺激的细胞。元麦提取物的保护时间为6h，H2O2氧化损伤时间为2h。通过MTT法测定元麦提取物对人肝癌HepG2细胞的保护作用。结果表明，H2O2损伤后的细胞活力下降至71.10％，提取物浓度与细胞活力的增加呈正相关，最大活力达到94.21％(图1)。
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