用于检测微生物的镧系元素掺杂的纳米颗粒组合物
阅读：826发布：2024-02-07
专利汇可以提供用于检测微生物的镧系元素掺杂的纳米颗粒组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种包含无机主体 荧光 体和镧系元素离子 掺杂剂 的颗粒状镧系元素掺杂的材料。在镧系元素掺杂的材料处于 氧 化态的情况下， 光致发光 被抑制。材料的光致发光可以通过还原性物质的存在而被激活，所述还原物质在氧化还原相互作用中还原镧系元素掺杂的材料。该镧系元素掺杂的材料可用于 生物 检测(例如检测样品中 微生物 的存在)。这可以有许多应用，例如检测样品中(例如在食品产品或 化妆品 产品中)的污染微生物的存在。，下面是用于检测微生物的镧系元素掺杂的纳米颗粒组合物专利的具体信息内容。
1.一种用于测试样品的生物检测试剂盒，包括：
颗粒状镧系元素掺杂的无机材料，包括：
无机主体荧光体，其处于第一氧化态并能够被还原成第二氧化态，所述第二氧化态为比所述第一氧化态相对更低的氧化态；和
分散在所述无机主体荧光体中的镧系元素离子掺杂剂；
用于保存所述样品的样品容器，所述样品容器的至少一部分是光学透明的。
2.根据权利要求1所述的生物检测试剂盒，其中所述样品容器里设置有颗粒状镧系元素掺杂的无机材料。
3.根据权利要求1所述的生物检测试剂盒，其还包含有液体生长培养基。
4.根据权利要求2所述的生物检测试剂盒，其中所述样品容器中含有所述生长培养基。
5.根据权利要求2所述的生物检测试剂盒，其中所述液体生长培养基中含有所述颗粒状镧系元素掺杂的无机材料。
6.根据权利要求2所述的生物检测试剂盒，其中所述样品容器中设有所述生长培养基和所述颗粒状镧系元素掺杂的无机材料。
7.根据权利要求1所述的生物检测试剂盒，其中所述镧系元素离子掺杂剂是铽(III)离子或铕(III)离子。
8.根据权利要求1所述的生物检测试剂盒，其中所述镧系元素离子掺杂剂的摩尔量在所述无机主体荧光体的摩尔量的0.5～30％的范围内。
9.根据权利要求1所述的生物检测试剂盒，其中所述颗粒状镧系元素掺杂的无机材料中的颗粒的平均尺寸在1～600nm的范围内。
10.根据权利要求1所述的生物检测试剂盒，其中所述镧系元素离子掺杂剂是第一镧系元素离子，所述无机主体荧光体是与所述第一镧系元素离子不同的第二镧系元素离子。
11.根据权利要求10所述的生物检测试剂盒，其中所述无机主体荧光体包括铈离子。
12.根据权利要求1所述的生物检测试剂盒，其中所述颗粒状镧系元素掺杂的无机材料还包含与所述无机主体荧光体反应的氧化剂以将所述无机主体荧光体保持在第一氧化态。
13.一种样品中的生物检测方法，包括：
使样品与权利要求1的颗粒状镧系元素掺杂的无机材料接触；
将所述镧系元素掺杂的无机材料暴露于激发光；和
检测来自镧系元素掺杂的无机材料发出的光。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述样品包含生长培养基。
15.根据权利要求13所述的方法，还包括向所述样品中加入生长培养基。
16.根据权利要求13所述的方法，其中检测发光的步骤包括在从镧系元素掺杂的无机材料暴露于激发光完成之时起一段延迟时间之后进行的检测读数。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述延迟时间为在暴露于激发光完成之时以后至少100纳秒。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述检测发光的步骤包括经过一段时间间隔进行多次检测读数。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括孵育所述样品，并且其中所述时间间隔为在开始孵育后的2至72小时的范围内。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法用于检测样品中的细胞，并且其中所述样品中包含用于促进细胞生长的生长培养基。
用于检测微生物的镧系元素掺杂的纳米颗粒组合物
背景技术
[0001] 检测食物和其他环境中的细菌污染通常使用琼脂皮式培养皿培养细菌。这种技术耗时且依赖于劳动密集型方法，如提取，稀释，分离，富集，计数等。结果可能细菌测定需要3‐5天或酵母和霉菌测定超过7天。为了更快地获得结果，已经开发了各种不同的替代技术。
一种技术是标准皮式培养皿的简化版，如纸片(Petrifilm)法，微生物快速测试皿(Compact Dry)等。这种技术在世界各地已经很好地实行，但结果仍然需要2‐4天。
一种技术是标准皮式培养皿的简化版，如纸片(Petrifilm)法，微生物快速测试皿(Compact Dry)等。这种技术在世界各地已经很好地实行，但结果仍然需要2‐4天。
[0002] 还有从通过小型化生化试剂盒、基于抗体和核酸的测定以及改进的常规测试产生的数据中计算统计最可能数(MPN)的快速微生物学技术。使用这种方法的产品的实例包括Vidas(来自BioMeriuex)和SimPlate(来自BioControl)。基于生长的技术通过测量二氧化碳水平(如Neogen的Solaris/Biolumix系统)或氧气消耗(如Mocon/Luxcel Bioscience的绿光系统)来监测微生物的生长。这些测试系统通常更适合高度污染的样品。
[0003] 这些技术使用仪器快速计算的自动检测，代替了细菌菌落的视觉计数和多次稀释步骤的需要。然而，这些自动化技术也有其缺点。例如在Vidas和SimPlate产品中使用的抗体和/或酶试剂具有高成本。测量由细菌在气密环境中呼吸产生的CO2引起的间接pH变化的CO2检测方法在与厌氧微生物和有色样品一起使用时具有局限性。使用荧光绿色氧探针的氧气消耗系统可能受到具有固有自发荧光的生物样品的干扰而受到损害。
[0004] 发明概述
[0005] 一方面，本发明是颗粒状镧系元素掺杂的无机材料。该材料包括能够光激发的无机主体荧光体。原样提供的无机主体荧光体处于氧化态，以使得其光致发光能力被抑制。无机主体荧光体可以通过与氧化剂的氧化还原反应而达到该氧化态。在一些实施例中，镧系元素掺杂的无机材料包括氧化剂。该颗粒材料还包含分散在无机主体荧光体中的镧系元素离子掺杂剂，并且能够接收来自无机主体荧光体的光激发能量的转移。当无机主体荧光体处于还原态时，允许向镧系元素离子掺杂剂的能量转移，并且在吸收能量之后，镧系元素离子掺杂剂发光。在一些实施例中，无机主体荧光体包括铈。在“原样提供的”氧化态中，铈是氧化铈(IV)，即四价铈。当铈被还原时，铈被还原为铈(III)，即三价铈。
[0006] 另一方面，本发明是一种生物检测方法。该方法包括使样品与本发明的颗粒状镧系元素掺杂的无机材料接触。然后将该镧系元素掺杂的无机材料暴露于激发光。样品中还原该无机主体荧光体的生物化学物质的存在，可以激活镧系元素掺杂的材料的光致发光。从镧系元素掺杂的无机材料发射的光被检测。在一些实施例中，这种发光检测结合样品的孵育进行。
[0007] 另一方面，本发明是用于生物检测的检测试剂盒。该生物检测试剂盒包括颗粒状镧系元素掺杂的无机材料和用于盛装样品的样品容器。样品容器的至少一部分是光学透明的。颗粒状镧系元素掺杂的无机材料可以单独提供或容纳在样品容器内。在一些实施例中，试剂盒还包含液体生长培养基。液体生长培养基可以单独提供或容纳在样品容器内。在一些实施例中，提供的液体生长培养基中含有颗粒状镧系元素掺杂的无机材料。在一些实施例中，样品容器中容纳有生长介质和颗粒状镧系元素掺杂的无机材料(例如，颗粒状镧系元素掺杂的无机材料与液体生长培养基混合在一起)。
[0008] 再一方面，本发明是可向其中施加样品用于检测的细胞培养基板。该细胞培养基板包括平面基础和在该平面基础上的生长支持涂层。该细胞培养基板还包括本发明的颗粒状镧系元素掺杂的无机材料，其可以被分散在生长支持涂层内、层铺在生长支持涂层之上或二者兼具。
[0010] 图1‐4示出了我们的发明如何操作用于生物检测的实例。图1示出了镧系元素掺杂的无机材料的概念图。图2显示了主体荧光体中的光激发。图3示出了在含有生物材料的样品存在下的镧系元素掺杂的无机材料。图4示出了镧系元素离子掺杂剂的光发射。
[0011] 图5示出了包含生物材料样品和镧系元素掺杂的无机材料颗粒的样品瓶。
[0012] 图6示出了用于读取来自样品的荧光的荧光检测仪器的示意图
[0013] 图7是细胞培养基板的剖面侧视图。
[0014] 图8示出了大肠杆菌在BPW(缓冲蛋白胨液)中的不同接种水平(cfu/mL)下的浓度‐时间关系曲线。
[0015] 图9示出了假单胞菌属(Pseudomonas spp)在TSB(胰酶大豆培养基)中不同接种水平(cfu/mL)下的浓度‐时间关系曲线。
[0016] 图10显示了BPW中碎牛肉和牛肩胛肉中细菌总数的时间曲线。
[0017] 发明详述
[0018] 本发明涉及颗粒状镧系元素掺杂的无机材料，其光致发光能力对化学环境敏感。本发明中使用的镧系元素掺杂的无机材料为颗粒形式，即包含颗粒。单个颗粒可以是纳米或微米尺寸范围。在一些实施例中，颗粒材料的平均粒径范围为直径1～999nm；在某些情况下，为1～600nm的范围；在某些情况下，为1～500nm的范围；在某些情况下，为50～400nm的范围。本文的定义，粒径由扫描电子显微照片的测量视图确定。粒径分布范围可以根据诸如制造方法、所施加的离心、筛分或过滤技术、颗粒组成等各种因素或宽或窄。颗粒可以具有任何合适的形状。使材料以颗粒形式制成可有利于促进在液体中的分散性。此外，使颗粒的尺寸足够小(例如在纳米级范围内)可以有利于使颗粒进入细胞内并检测细胞内代谢物(例如反映细胞健康的代谢物)的存在。
[0019] 镧系元素掺杂的材料包括无机主体荧光体和镧系元素离子掺杂剂。镧系元素掺杂的材料能够光致发光(吸收光子后发光)，其对周围环境的化学成分非常敏感。因为光致发光活性(例如强度，寿命等)取决于周围的化学成分，镧系元素掺杂的材料的光致发光可用于检测样品中感兴趣的物质。
[0020] 无机主体荧光体。镧系元素掺杂的材料的光致发光依赖于无机主体荧光体的光激发和随后将光激发能量转移到镧系元素离子掺杂剂。任何合适的无机荧光体在本发明中都可以使用，包括可产生荧光或磷光发光的那些，并且包括发射比它们吸收的光能量更低的光的下变频荧光体，以及发射比它们吸收的光能量更高的光的上变频荧光体。在结构上，主体荧光体提供镧系元素离子掺杂剂分散在其中的基体材料。主体荧光体可以具有任何合适的结构形式，包括无定形的或结晶的(例如形成掺杂剂离子分散在其中的晶格)或两者的组合。
[0021] 无机主体荧光体将其光激发能转移到镧系元素离子掺杂剂的能力取决于主体荧光体的氧化态。无机主体荧光体能够通过与氧化或还原物质的氧化还原反应而被氧化和还原。如在生物检测中使用的，主体荧光体处于相对氧化状态。虽然主体荧光体能够进行光激发，但是在该相对氧化状态下，光激发能力被抑制。但是在还原性物质的存在下，主体荧光体被还原成了较低的氧化态。在这种相对较低的氧化态(还原态)下，镧系元素掺杂的无机材料的光致发光被激活，因为主荧光体的激发能被转移到掺杂剂离子(下面将进行解释)。
[0022] 在镧系元素中，铈可以用作主体荧光体。其原因是，与其他镧系元素不同，铈能够从其Ce3+三价形式氧化为Ce4+四价形式，同样也可以从Ce4+四价形式还原成其Ce3+三价形式。在一些实施例中，无机主体荧光体是磷酸铈。在一些实施例中，无机主体荧光体包括不同于镧系元素离子掺杂剂的镧系元素离子。
[0023] 氧化剂。无机主体荧光体可以通过与氧化剂的氧化还原反应而变成其氧化态。在一些实施例中，组合物包含一种或多种能够通过氧化还原反应氧化无机主体荧光体的氧化剂。可以使用的氧化剂的实例包括：过碳酸钠，过氧化氢，过氧化氢和过渡金属混合物，过硼酸钠，亚氯酸钠，氯酸钠，过二硫酸钠，过氧化钙，过氧化氢加合物如聚(乙烯基吡咯烷酮)过氧化氢络合物，尿素过氧化氢，尿素过氧化氢加合物，高锰酸钾，重铬酸钠，过氧单硫酸，过二硫酸钠，高氯酸钠，过二硫酸，硝酸，过氧化苯甲酰，高氯酸，臭氧，高碘酸钠，四氧化锇，过乙酸，高碘酸，过二硫酸钾，溴酸钠，二氯碘酸钠，次氯酸钠，和醋酸铅(IV)。优选的是强氧化剂如过碳酸钠，过氧化氢，过氧化氢和亚铁盐混合物，过硼酸钠，亚氯酸钠，氯酸钠，过二硫酸钠，聚(乙烯基吡咯烷酮)过氧化氢络合物，尿素过氧化氢和过氧化钙。
[0024] 镧系元素离子掺杂剂。一种或多种不同类型的镧系元素离子作为掺杂剂材料分散在组合物中。一种或多种不同类型的镧系元素可以用作组合物中的掺杂剂。在镧系元素中，钐Sm(III)，铕Eu(III)，铽Tb(III)和镝Dy(III)离子是荧光应用中最常使用的。在一些实施例中，镧系元素离子掺杂剂是铽(III)离子或铕(III)离子。
[0025] 镧系元素离子掺杂剂通过吸收来自无机主体荧光体的光激发能量作为发射体。特别地，无机主体荧光体被激发光激发，然后将该激发能转移到掺杂剂离子。掺杂剂离子吸收这种转移的能量后被激发并产生荧光或磷光发光。
[0026] 在一些实施例中，组合物中镧系元素离子掺杂剂的摩尔量在无机主体荧光体的摩尔量的0.5～30％的范围内。对于不同的镧系元素，最佳摩尔量可能不同。使用在这些范围内的掺杂剂量可以避免由于相邻的掺杂剂离子之间的相互作用导致的光子性能差的问题，如果掺杂剂量太高，则这会发生。当使用铽(III)离子作为掺杂剂时，在某些情况下，摩尔量相对于主体物质为5～25％，优选为10～15％。当使用铕(III)离子作为掺杂剂时，在某些情况下，摩尔量为0.5～10％，优选为1～5％。
[0027] 镧系元素掺杂的材料可以包括无机主体荧光体和镧系元素离子掺杂剂的各种组合。在一些实施例中，镧系元素掺杂的材料为CeXPO4：Lny(x+y＝1；Ln＝元素Sm，Eu，Tb或Dy)。在一些实施例中，镧系元素掺杂的材料是LaXCeyPO4：Lnz(x+y+z＝1；Ln＝元素Sm，Eu，Tb或Dy)。掺杂剂y或z的量优选为0.005～0.3(0.5％～30％)。
[0028] 对于CeXPO4：Tby(x+y＝1)，在一些实施例中，掺杂剂量y在0.05～0.2(5～20％)的范围内，优选在0.1～0.15(10～15％)的范围内。对于CeXPO4：Euy(x+y＝1)，在一些实施例中，掺杂剂y的量在0.005～0.1(0.5～10％)的范围内，优选为0.01～0.05(1～5％)。
[0029] 光致发光。颗粒状镧系元素掺杂的无机材料的发光可以是荧光或磷光发光。关于镧系元素掺杂的材料的光致发光的术语“抑制”和“激活”并不意味着发光的绝对量，而是相对于彼此的相对发光强度。“抑制”状态下的发光强度低于“激活”状态下的发光强度。处于“抑制”状态并不一定意味着完全不存在发光。但通常，在“抑制”状态下非常低或不可检测的发光，在“激活”状态下更高得多的发光强度时，本发明的操作更有效。镧系元素掺杂的材料从“抑制”状态转换为“激活”的光致发光状态的这种能力有时被称为“荧光性”。
[0030] 并不是所有主体荧光体被氧化都会引起镧系元素掺杂的材料的光致发光的抑制。可能只有少部分主体物质的氧化导致光致发光抑制。同样地，并不是所有主体荧光体被还原都会引起镧系元素掺杂的材料的光致发光的激活，可能只有少部分主体荧光体的还原导致光致发光激活。
[0031] 在本发明中，光致发光对化学环境的敏感性源自于光致发光操作依赖于无机主体荧光体的氧化态的事实。通过暴露于合适波长的激发光，无机主体荧光体被光激发，然后将该光激发能转移到镧系元素离子掺杂剂。则镧系元素离子掺杂剂将该转移的能量作为光发射。这就是镧系元素掺杂的无机材料发出的光致发光。
[0032] 然而，在激发的主体荧光体和镧系元素离子掺杂剂之间是否发生能量转移取决于主体荧光体的氧化态。在相对较高的氧化态下，从主体荧光体到镧系元素离子掺杂剂的能量转移被阻断或基本上阻止。然而，该能量转移能力能够通过还原主体荧光体的氧化态来恢复。通过与化学环境的氧化还原相互作用可以将主体荧光体转换到相对还原的状态。因此，当镧系元素掺杂的无机材料与氧化还原性的还原物质接触时，镧系元素掺杂的无机材料的光致发光可以变得被激活。
[0033] 图1‐4示出了我们的发明如何用于生物检测的一个实例。图1示出了镧系元素掺杂的无机材料的概念图，其包括形成分散有镧系元素离子掺杂剂12的结晶基质的无机主体荧光体10。在操作中，镧系元素掺杂的无机材料暴露于激发光20。如图2所示，这导致主荧光体10中的光激发22。这个光激发能22否则就会被转移(由箭头24示出)到镧系元素离子掺杂剂
12。然而，由于主体荧光体10的氧化态，该能量转移不会发生并且不存在来自镧系元素离子掺杂剂12的发光(相应地，镧系元素掺杂的无机材料没有光致发光)。因此，镧系元素掺杂的无机材料的光致发光被抑制。
12。然而，由于主体荧光体10的氧化态，该能量转移不会发生并且不存在来自镧系元素离子掺杂剂12的发光(相应地，镧系元素掺杂的无机材料没有光致发光)。因此，镧系元素掺杂的无机材料的光致发光被抑制。
[0034] 在图3中，镧系元素掺杂的无机材料已经放置在含有生物材料的样品的液体中。生物材料产生能够通过氧化还原相互作用而还原主体荧光体10的生物化学产物(R)。对照图2，主体荧光体10的光激发22被转移到镧系元素离子掺杂剂12。结果如图4所示，镧系元素离子掺杂剂12吸收该能量，随后发射其自身的发光26。
[0035] 检测方法。由于镧系元素掺杂的材料可以检测到还原性生化物质的存在，其可用于生物检测。如下面更详细地解释，生物检测的实例包括检测样品中微生物的存在，定量样品中微生物的量，测试抗生素敏感性，筛选抗生素药物以及评估细胞活力或功能。如本文所使用，关于样品的发光或含量的术语“检测”还包括测量样品的发光或含量。样品与光致发光能力被抑制的颗粒状镧系元素掺杂的无机材料接触。与样品接触可导致无机主体荧光体的还原(例如通过与样品中的生化物质的氧化还原反应)。在还原状态下，颗粒状镧系元素掺杂的无机材料的光致发光被激活。
[0036] 然后将镧系元素掺杂的材料暴露于激发光，激发光可以具有任何合适的波长，这取决于材料的光学特性。激发光可以经任何合适的时间框架上提供，例如稳定曝光(例如用于检测稳定荧光)或脉冲激发曝光(例如用于荧光的时间延迟检测)。在激活状态下，颗粒状镧系元素掺杂的无机材料能够响应于激发光照射而发光。该发光可以指示样品中感兴趣的生化物质的存在。
[0037] 图5示出了如何将该检测方法应用于样品瓶10中包含的微生物样品的示例。样品瓶10还含有用于支持微生物生长的生长培养基32。将镧系元素掺杂的无机材料纳米颗粒34放入样品瓶10并分散在其中。将微生物孵育以允许其生长和释放代谢产物到样品材料中。一种或多种代谢产物用于在氧化还原反应中还原镧系元素掺杂的纳米粒子34。在适当的时间，将样品暴露于激发光。由于镧系元素掺杂的无机材料的光致发光现在被激活，所以镧系元素掺杂的无机材料响应于激发光发射光致发光。
[0038] 可以读取发光信号的单次读数或可以进行多个读数。可以使用用于读取发光信号的任何合适的时间参数。例如，读数可以连续地、间歇地或以其他方式进行。在一些实施例中，在延迟时间之后获取一个或多个检测读数，或者经一段时间间隔获取多个检测读数(例如，如在时间分辨荧光光谱或荧光寿命成像中)。如本文所使用的，关于发光信号读数的术语“多个”包括随时间的连续读数、随时间的离散读数以及其它方式。
[0039] 在延迟时间之后获得一个或多个检测读数或经一段时间获取多个检测读数可以有各种方式的用途。例如，如下所述，以这种方式获取检测读数能用于含有细胞的样品来获取关于细胞生长的数据。在另一个实例中，如果样品含有生物材料，则可以选择时间参数以避免来自许多生物样品中存在的背景自发荧光的干扰。这可利用镧系元素掺杂的无机材料可以具有相对长的发光寿命的事实。而典型的有机荧光染料(如存在于生物材料中的那些)具有在纳秒级别的发光寿命，镧系元素掺杂的无机材料可以具有从微秒到毫秒数量级的发光寿命。因此，通过选择用于发光检测的合适的时间参数，生物样品的背景自发荧光可以避免。在一些实施例中，该方法包括在完成激发光曝光之后在至少100纳秒的时间延迟之后进行检测读数；在某些情况下，至少500纳秒后；在一些情况下，至少1微秒之后。
[0040] 选择发光检测的时间参数也可用于镧系元素掺杂的材料的发光寿命对化学环境敏感的情况。例如，诸如旋转扩散，共振能量转移和动态淬灭的事件可以在与荧光衰减相同的时间尺度上发生。因此，可以选择用于发光检测的时间参数来研究这些过程并获得对样品的化学成分的深入了解。
[0041] 有用的应用。由于镧系元素掺杂的无机材料的光致发光对其化学环境敏感，因此其可用于检测样品中还原性生化物质的存在。样品可能来自各种来源，包括食品(包括饮料、酒水和食品添加剂)、临床标本、漂洗或擦拭标本、供水、环境测试样品、化妆品，或来自样品收集器如海绵、擦拭布、棉签(例如Q‐端型)等。样品可以是任何合适的物理形态，包括液体或固体。
[0042] 除了存在还原性生化物质本身外，该生化物质的存在可能指示其他事情，例如关于样品中存在的细胞信息。如本文所用，术语“细胞”是指生物真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞、微生物细胞和植物细胞。微生物包括酵母、霉菌和细菌(包括致病菌、非致病菌和背景微生物群落)。细胞具有代谢活性，并且其代谢中的一种或多种产物(例如副产物或废物)可在氧化还原反应中与镧系元素掺杂的材料相互作用。可以检测到的这些代谢生化物质的实例包括NADH、糖、氢、还原的硫化合物、乙醇、乙酸盐、乳酸盐和丁酸盐。
[0043] 因此，发光检测读数可用于鉴定样品中细胞(例如微生物)的存在。此外，发光检测读数也可用于估计样品中细胞的数量。关于测量细胞的术语“数量”包括用于确定细胞数目的各种类型的方法中的任何一种，包括绝对数、密度(如cfu/mL)、浓度、重量、功能单位等。
[0044] 对于含有细胞的样品，可以向样品中加入生长培养基。可以根据情况选择生长培养基和培养条件。例如，为了获得总存活数(TVC)，可以使用支持可能存在于样品中的所有微生物生长的生长培养基。或者，在另一个实例中，可以选择支持特定微生物种属或菌株生长的生长培养基。可以使用的生长培养基的实例包括缓冲蛋白胨液、胰蛋白胨大豆液体培养基和平板计数液体培养基(Difco，Becton Dickinson)。还有各种类型的适合于酵母和霉菌生长的选择性生长培养基，或选择性的微生物群如大肠杆菌、丝氨酸球菌、假单胞菌属、沙门氏菌属和李氏菌属或乳酸产细菌。
[0045] 可以选择培养条件以最佳条件生长感兴趣的特定类型的微生物。例如，大肠杆菌的生长可以在约37℃的温度下被最佳地支持，而酵母或霉菌的生长可以在较低的温度例如24℃下被最佳地支持。在另一个实例中，可以通过选择合适的有氧条件来支持需氧微生物的生长，并且可以通过选择厌氧条件如CO2气氛来支持厌氧微生物的生长。
[0046] 样品可能需要孵育时间才能使微生物生长繁殖。随着微生物(如果存在)繁殖并释放其代谢产物，更多的镧系元素掺杂的材料被激活以发光。如上所述，镧系元素掺杂材料的增加光致发光输出被检测。
[0047] 如上所述，选择用于发光检测的时间参数在各种情况下也是有用的。对于含有细胞的样品，在延迟时间之后采取一个或多个检测读数或经一段时间间隔进行多个检测读数可以提供有用的信息。例如，在含有细胞的样品中，随时间跟踪光致发光输出可提供有关微生物生长模式、生长速率、微生物初始数目等有用数据。例如，光致发光输出与时间的关系曲线可能类似于经过滞后期、指数期和最终静态生长阶段的微生物的模式。因此，初始光致发光激活时间可能与样品中存在的微生物当从滞后期转变为指数生长期时的初始数量相关。较早的活化时间与样品中存在的微生物较多数目相关。该活化时间可能取决于微生物的类型、生长培养基或温度。通过固定可控的生长条件(例如孵育温度和优化的生长培养基)，特定类型的微生物可以显示与样品中微生物的初始数量成比例的可再现的活化时间。
[0048] 用于发光检测的时间参数的选择可对应于含细胞样品的孵育的时间段。在一些实施例中，多个检测读数在开始孵育样品后经长达72小时的时间间隔内进行；在某些情况下，在2‐72小时内；在某些情况下，在2‐24小时内；在某些情况下，在2‐12小时内。经这些时间段的多个检测读数可以间歇地进行。例如，可以在5分钟至1小时(例如每15分钟或每30分钟)的范围内的一个或多个间隔(不一定相同)隔开的时间点读取读数。样品的孵育可以在任何合适的温度下进行以生长细胞。在一些实施例中，将样品在高于20℃的温度下孵育。
[0049] 还原性生化物质的检测可以应用于多种不同的环境中，例如检测微生物的存在，估计微生物的量，鉴定微生物的类型，监测细胞的代谢健康状况。能够检测微生物的能力可以有许多有用的应用。一个例子是检测食品中的微生物污染。在这种情况下，样品包括食物产品。
[0050] 我们的生物检测方法也可以量化样品中存在的细胞数量。可以选择培养条件，使得样品的孵育结果是产生与样品中存在的活细胞数成正比的信号。在这种情况下，样品将包含细胞(例如微生物)。
[0051] 我们的生物检测方法也可用于测试微生物对抗生素药物的敏感性。例如，存在于临床标本中的微生物可以与本发明的颗粒状镧系元素掺杂的材料一起在含有所感兴趣的抗生素药物的生长培养基中孵育。可以改变抗生素药物的浓度以确定用于抑制微生物生长的最小有效浓度(有时称为最小抑制浓度或MIC)。光致发光激活的缺乏(与没有抗生素药物的对照样品相比)可以表明微生物的生长受到抗生素药物的抑制。在这种情况下，样品将包含微生物和抗生素药物。
[0052] 我们的生物检测方法也可用于在药物开发过程中筛选抗生素药物，包括初步筛选或二次筛选新的抗生素药物。例如，高通量筛选被广泛用于制药工业用于筛选药物库以找到抑制特定微生物生长的候选药物。可将感兴趣的微生物与含有候选抗生素药物的生长培养基以及本发明的颗粒状镧系元素掺杂的材料一起孵育。如果缺少光致发光激活(与没有抗生素药物的对照样品相比)，这表明微生物的生长被候选抗生素药物抑制。这种候选药物可以被选为进一步临床开发的“主导”候选药物。在这种情况下，样品将包含微生物和抗生素药物。
[0053] 我们的生物检测方法也可用于确认医疗器械或药物等医疗产品的无菌性(或检测污染)。例如，本发明的颗粒状镧系元素掺杂的材料可以添加到药物冲洗样品或医疗器械冲洗样品中，该样品含有支持样品中所有微生物的非选择性生长培养基。孵育样品后，可以读取光致发光信号，以确定微生物的存在或不存在以及总活菌数。呈现指数增长期的正光致发光信号可能表明样品被污染。在这种情况下，样品将包含漂洗样品。
[0054] 本发明的生物检测方法也可用于细胞活力或功能测定。在这种情况下，样品将包含细胞。当细胞死亡时，它们迅速失去将底物转化成产物的能力。因此，测量细胞的代谢产物可以作为细胞活力，细胞增殖和许多重要的活细胞功能(包括凋亡、细胞粘附、趋化性、多抗药性、内吞作用、分泌和信号转导)的标志物。一种或多种这样的代谢产物可以通过我们的生物检测方法来测定以评价细胞活力或功能。因为镧系元素掺杂的材料可以是无毒的或具有相对低的毒性(例如，如CeP04:Tb或CeP04:Eu的情况)，该材料可用于细胞活力或功能测定。
[0055] 如本文所示，我们的发明具有许多应用。本发明可以检测到的微生物的例子包括细菌(例如大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、李斯特菌、梭菌、假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、支原体等)和真菌(如曲霉菌、念珠菌、霉菌等)。我们的发明可用于检测多种不同情况下的这些微生物，包括食品安全、水安全、化妆品安全、药物筛选、临床诊断、细胞活力测定、工业微生物学(例如通过发酵生产的化学品)、营养食品安全、动物饲料污染、药物污染、环境安全评估和检疫控制(例如海关筛检)。
[0056] 测试工具包。任何合适的仪器都可用于光致发光检测。这些仪器的实例包括荧光光谱仪、荧光成像系统、微量滴定板读数器、荧光显微镜、微孔板读数器、流式细胞仪等。这样的仪器的实例包括由BioTek，PerkinElmer，TECAN，MolecularDevices等制造的96‐孔微量滴定板荧光读数器。我们的发明还包括可用于与这种光致发光检测仪器结合使用的用于生物检测的试剂盒。该生物检测试剂盒包括本发明的颗粒状镧系元素掺杂的无机材料。
[0057] 生物检测试剂盒进一步包括用于保存待测样品的样品容器。样品容器可以是适于保存用于光致发光分析的液体材料的任何类型的容器。可以使用的样品容器的实例包括小瓶、瓶子、罐子或盘子。样品容器可以设计成容纳单个样品或多个样品(例如多孔板)。样品容器可以容纳任何合适体积的液体。例如，样品容器可以容纳在0.5～15mL的范围内的体积。可以使用的这种体积的实例包括约0.5、约1、约1.5、约2、约3、约10和约15mL。对于设计用于容纳多个样品的样品容器，每个孔的体积可以在5～300μL的范围内。可以使用的示例性孔体积包括约5、约10、约50、约100、约150、约200、约250和约300μL。
[0058] 样品容器有至少一部分是光学透明的(例如用透明玻璃或塑料制成)以允许激发光或光致发光的透射。例如，整个样品容器可以由透明玻璃制成。在另一实例中，样品容器可以具有一个或多个透明窗口(例如在容器的侧面或底部)。在一些情况下，样品容器是具有或不具有透气盖的封闭容器。样品容器可以是单次使用的、一次性的、可重复使用的等。
[0059] 在我们的试剂盒中，样品容器内可以容纳有颗粒状镧系元素掺杂的无机材料；或者可以单独提供颗粒状镧系元素掺杂的无机材料(例如，使用者在使用时将材料倒入样品容器)。生物检测试剂盒还可以包含液体生长培养基。样品容器可以设置有包含在其中的生长培养基；或生长培养基可以单独提供(例如，使用者在使用时将生长培养基倒入样品容器中)。如上所述，生长培养基可以从可用的各种类型的生长培养基中选择。
[0060] 在一些实施例中，生长培养基含有本发明的颗粒状镧系元素掺杂的无机材料(例如镧系元素掺杂的纳米粒子可与生长培养基预混合)；或颗粒状镧系元素掺杂的无机材料可以与生长培养基分开提供(例如，使用者在使用时将材料倒入生长培养基中)。生长培养基可以是任何合适的形态，包括无水、半固体或液体形态。
[0061] 图6显示了如何使用本发明的生物检测试剂盒的实例。试剂盒包括根据所提供的含有生长介质和预混合在其中的颗粒状镧系元素掺杂的无机材料的样品瓶40。在使用时，使用者打开样品瓶40上的盖42并将样品放置在其中。混合后确保颗粒材料充分分散，将样品在合适的温度下孵育。孵育后，将样品瓶40放置在荧光检测仪器50上。仪器50的激发光源52被接通以将样品暴露于激发光56。仪器的光检测器54检测从颗粒材料发出的荧光58。
[0062] 本发明的另一个实施例是样品可以在其上进行测试的细胞培养基板。细胞培养基板包括平面基础(例如纸，薄膜，片，盘等)和平面基础上的生长支持涂层。平面基础可以具有任何合适程度的柔性或刚度，并且由任何合适的材料制成，例如纸或塑料。生长支持涂层包括促进细胞(例如微生物)生长的材料或提供细胞生长的结构支撑。例如，生长支持涂层可以包含营养物、脱水生长培养基、粘合剂或胶凝剂(例如水凝胶)。生长支持涂层可以是单层或由多个单独的层组成。可用于本发明的平面基础和生长支持涂层的实例描述于美国专利4,565,783、5,364,766和8,846,335，其通过引用并入本文。
[0063] 细胞培养基板还包含本发明的颗粒状镧系元素掺杂的无机材料，其可以分散在生长支持涂层内，层铺在生长支持涂层上或兼具两者。图7示出了本发明的细胞培养基板的一个实例。细胞培养基板包括用于其基底的片材60。在该片材60上，有生长支持涂层，其包含一层脱水生长培养基62和一薄层胶凝剂64。镧系元素掺杂的无机材料的纳米颗粒66分散在胶凝剂层64内。可以通过将微生物的液体样品施加到胶凝剂层64上然后孵育以使微生物生长而使用该细胞培养基板。随着纳米颗粒66的光致发光激活，可以通过暴露于激发光来显现微生物的菌落并进行计数。发光也能够使用如上所述的发光检测仪器被检测。实施例
[0064] 可用于本发明的镧系元素掺杂的无机材料的一个实例为掺杂三价铽离子的磷酸铈(CePO4:Tb3+)。在这种材料中，Tb3+通过从吸收光的Ce3+转移来的能量而被激发。当铈离子处于三价态时，Ce3+→Tb3+的能量转移就会发生。然而，如果铈离子被氧化成四价Ce4+，这种能量转移不再发生。因此光致发光的抑制和活化可以通过Ce3+/Ce4+氧化还原反应来控制。
[0065] 实施例1‐制备含有15％(摩尔)Tb(III)的荧光CeP04:Tb纳米颗粒。将3.689克的Ce(NO3)4·6H2O(Sigma‐Aldrich)和0.68克的Tb(NO3)6·6H2O(Sigma‐Aldrich)在室温不断搅拌下溶解在含有250mL去离子水的1000mL烧杯中。在另一烧杯中，将2.4克磷酸二氢钠一水合物(Sigma‐Aldrich)溶于250mL水中。在持续搅拌下，用一夜的时间向第一溶液中缓慢滴加磷酸二氢钠溶液。将反应分成两半，每个具有约250mL的体积。向第一烧杯中加入10克过碳酸钠。向第二烧杯中加入5克过硼酸钠。在室温反应下持续4小时。将得到的溶液等分到50mL锥形离心管中，并以3000rpms离心15分钟。倒掉每个管中的上层清液，所得沉淀用45mL水洗涤三次。然后使用乙醇作为溶液将含有碳酸钠的多个管合并到一个管中。对于过硼酸钠样品应用相同的程序处理。然后将样品在3000rpm下再次离心15分钟。将得到的上层清液倒掉，用一夜的时间将管底部的固体物质在60℃持续干燥。
[0066] 实施例2‐制备含有10％(摩尔)Tb(III)的荧光CeP04:Tb纳米颗粒。将2.46克的Ce(NO3)4·6H2O(Sigma‐Aldrich)和0.374克的Tb(NO3)6·6H2O(Sigma‐Aldrich)在室温不断搅拌下溶解在含有200mL去离子水的1000mL烧杯中。在另一烧杯中，将1.18克磷酸二氢钾一水合物(Sigma‐Aldrich)溶于200mL水中。在持续搅拌下，用一夜的时间向第一溶液中缓慢滴加磷酸二氢钠溶液。向该反应中加入20克过碳酸钠，使反应在室温下继续4小时。将得到的溶液等分到50mL锥形离心管中，并以3000rpms离心15分钟。倒掉每个管中的上层清液，所得沉淀用45mL水洗涤三次。然后使用乙醇作为溶液将各管合并成一个管并再次在3000rpm下离心15分钟。将得到的上层清液倒掉，用一夜的时间将管底部的固体物质在60℃持续干燥。
[0067] 实施例3‐大肠杆菌培养。将96孔黑边的考斯塔板(Corning)用25μl的实施例1的2mg/ml的荧光纳米颗粒在异丙醇中的悬浮液无菌涂覆。在异丙醇悬浮液中处理纳米颗粒使得在每个孔中更准确地分配相同量的纳米颗粒。将板干燥过夜将异丙醇从板上蒸发掉。将新鲜的大肠杆菌(ATCC#51813)培养物在缓冲蛋白胨液(BPW)中孵育过夜。通过将1mL原始样品混合到9mL的BPW溶液中将细菌培养物进行10倍稀释。这种10倍稀释从每个在先稀释系列中重复连续9次，得到一系列稀释9次10倍稀释液。
[0068] 250μL每种稀释样品的两份用于接种每个孔。将96孔板在37℃下孵育，并在BioTek Synergy H1微量滴定板读数器中测量，激发光设定为300nm波长，发射检测设定在544nm波长处，以30分钟为间隔。为了与传统的纸片(Petrifilm)法计数技术进行比较，两种AC纸片也接种了第七次稀释(102)液，以得出样品中总活菌数(TVC)的估计值。将纸片在37℃下孵育24小时，然后计数。使用从AC板获得的计数来回算每个稀释样品中的大肠杆菌浓度。结果示于图8，其示出了每个稀释样品测量的荧光强度随时间的曲线图。
[0069] 实施例4‐假单胞菌培养。以与实施例3相同的方式用荧光纳米颗粒涂覆96孔黑边的考斯塔板(Corning)。将新鲜的假单胞菌属物种(ATCC#51821)培养物在30℃下在胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB)中孵育32小时。细菌培养物以与实施例3所述相同的方式在TSB中连续稀释9次。将250μl每种稀释的样品两份用于接种每个孔。将板在30℃孵育，然后以与上述实施例3相同的方式读取。为了与传统的纸片(Petrifilm)法计数技术进行比较，以与上述实施例3相同的方式将两种AC纸片接种细菌。然后将纸片在30℃下孵育48小时，然后计数。使用从AC板获得的计数来回算每个稀释样品中的假单胞菌属的浓度。结果示于图9，其示出了每个稀释样品测量的荧光强度随时间的曲线图。
[0070] 实施例5‐对碎牛肉和牛肩胛肉进行测试。以与实施例3相同的方式用荧光纳米颗粒涂覆96孔黑边的考斯塔板(Corning)。从当地超市购买碎牛肉和牛肩胛肉作为实验样品。按照肉类测试的标准微生物技术，将10克牛肉产品装在7×12”无菌聚乙烯袋中并滴加进
90mL的BPW并掺混1分钟，并在Stomacher 400(A.J.Seward)中以250rpm混合2分钟。
90mL的BPW并掺混1分钟，并在Stomacher 400(A.J.Seward)中以250rpm混合2分钟。
[0071] 每个孔用250μl稀释样品接种。将96孔板在30℃下孵育，并在BioTek SynergyH1微量滴定板读数器中用300nm的激发测量荧光，并以30分钟的间隔读取在544nm处发射检测。样品在BPW中连续稀释10倍。每个稀释液对于接种的AC纸片平板重复两次。将样品在30℃下孵育至少24小时，然后计算细菌的总活菌数(TVC)。结果示于图10，其示出了测量的荧光强度随时间的曲线图。
[0072] AC纸片板显示，牛肩胛肉样品具有约1×103cfu/克，而碎牛肉样品有约6 3
4.3x10cfu/克。关于荧光信号，碎牛肉样品(确定为具有1×10cfu/克细菌负荷)在约3.5小时时显示初始“开启”时间；而牛肩胛肉样品(确定为4.3x106cfu/克细菌负荷)在10.5小时左右显示初始“开启”时间。碎牛肉样品的较早开启时间(与牛肩胛肉样品相比)与其较高的细菌污染负荷有关。
4.3x10cfu/克。关于荧光信号，碎牛肉样品(确定为具有1×10cfu/克细菌负荷)在约3.5小时时显示初始“开启”时间；而牛肩胛肉样品(确定为4.3x106cfu/克细菌负荷)在10.5小时左右显示初始“开启”时间。碎牛肉样品的较早开启时间(与牛肩胛肉样品相比)与其较高的细菌污染负荷有关。
[0073] 在替代实施例中，作为无机主体是荧光材料的替代，无机主体可以是其中发光由电流驱动的电致发光材料。前面的描述和实施例仅仅是为了说明本发明而提出的，而不是限制性的。本发明的每个公开的方面和实施例可以单独考虑或结合本发明的其它方面、实施例和变体来考虑。另外，除非另有说明，本发明方法的步骤不限于任何特定的实施顺序。结合本发明的精神和实质对公开的实施例的修改对本领域技术人员而言是可以想到的，并且这样的修改在本发明的范围内。
[0074] 除非上下文另有明确规定，本文使用“或”一词的目的是包含性的，等同于“和/或”一词。因此，例如，表达“A或B”是指A或B，或A和B。类似地，例如“A，B或C”表示A或B或C或任何其组合。
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