技术领域
[0001] 本
发明属于
农作物分子遗传育种学领域，涉及水稻抗稻瘟病基因的分子标记方法。
背景技术
[0002] 水稻是我国最重要的粮食作物之一，对保障我国粮食安全和国民经济增长具有重要意义。稻瘟病是我国水稻生产上最严重的病害，具有传播快、发生广、危害重等特点(凌忠专等，1989，我国北方稻区稻瘟病菌生理小种研究冲国农业科学，22(3)：7-13)。进一步发掘和利用我国抗稻瘟病基因资源，培育和种植抗病品种是控制稻瘟病发生和减少水稻产量损失最经济有效的途径。
[0003] 迄今，各国科学家从水稻中鉴定了70多个抗稻瘟病基因，其中有17个抗病基因被成功克隆。这些抗病基因可以引入或聚合到现代品种，选育出高抗、广谱的品种。但传统育种方法费时、费
力、表型鉴定困难、育种效率低，由于抗病基因多为显性、基因间往往存在上位性互作，抗病基因聚合更为困难。通过分子标记辅助育种可以有效解决这一问题。
[0004] 我国太湖流域稻作历史悠久，被认为是粳稻起源地之一，蕴藏有丰富的稻种资源，李培富等(1999，两个太湖流域粳稻地方品种抗稻瘟病的遗传研究.中国水稻科学，13(1)：11-14)报道我国太湖流域粳稻地方品种薄稻对稻瘟病菌的抗性表现广谱和高抗的特点。从我国特有的种质资源中鉴定和克隆抗稻瘟病基因，可以获得具有自主知识产权的基因，对提高我国水稻抗稻瘟病育种水平，尤其是粳稻的抗稻瘟病育种有重大意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的是：提供水稻品种薄稻抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)的分子标记方法。通过检测与抗病基因Pi-bd1(t)紧密连
锁的分子标记，可以确定有无抗病基因Pi-bd1(t)，并预测水稻植株的的稻瘟病抗性，加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进度。
[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0007] 水稻薄稻抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)的分子标记方法，包含如下操作步骤：
[0008] (1)取水稻样品，提取水稻样品基因组DNA；
[0009] (2)利用表1中的任意一对或两对与水稻薄稻抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)紧密连锁的分子标记引物，对所述的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行
电泳检测，如果扩增出对应大小的分子标记DNA
片段，标志着Pi-bd1(t)基因的存在：
[0010] 表1
[0011]
[0012] 其中，所述的PCR扩增的反应体系为：10×缓冲液(含Mg2+)1.0μl，4pmol/μl的表1中所述的分子标记引物对1μl，2.5mM dNTPs 0.2μl，5U/μl的Taq酶0.1μl，10ng/μl的水稻样品基因组模板DNA 1μl，加水至10μl；反应程序为：DNA94℃预变性5分钟后；94℃变性30秒，55℃
退火30秒，72℃延伸展1分钟，循环35次；最后72℃延伸10分钟。
[0013] 有益效果
[0014] 本发明所提供的水稻薄稻抗稻瘟病基因的分子标记方法，具有以下优点：
[0015] (1)薄稻为太湖流域粳稻地方品种，具有广谱高抗稻瘟病的特征，其主效抗病基因Pi-bd1(t)为一个新的抗病基因，筛选获得与之紧密连锁的分子标记RM6091和RM26632，为分子标记辅助选择育种和克隆Pi-bd1(t)基因奠定了
基础。利用本发明任意一对与水稻薄稻抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)紧密连锁的分子标记，进行抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)的
鉴别，选择效率都达到98.8％以上，利用两对分子标记引物的选择效率达99.98％。
[0016] (2)通过本发明分子标记
定位的基因位点精确，鉴定方便。由于这些标记与抗病基因Pi-bd1(t)的重组率低(≤1.2％)，通过检测这些与抗病基因Pi-bd1(t)紧密连锁的分子标记，可以确定抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)的存在与否，预测水稻植株的稻瘟病抗性，从而快速抗病育种
进程。
[0017] (3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统抗病育种方法中，对育种材料的稻瘟病抗性进行表型鉴定，一般在苗期或抽穗期，受接种环境影响较大，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)，可以在苗期取样，提取DNA，利用上述标记就可鉴定出抗稻瘟病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本、控制育种群体规模，而且大大提高抗稻瘟病个体的选择效率。
附图说明
[0018] 图1.水稻抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)紧密连锁SSR标记RM6091的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0019] 其中：M：分子量Marker；B：薄稻；S：苏御糯；F：杂合型；1-6：感病重组自交系；7-13：
[0020] 抗病重组自交系。
[0021] 图2.水稻抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)紧密连锁SSR标记RM26632的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0022] 其中：M：分子量Marker；B：薄稻；S：苏御糯；F：杂合型；1-5：感病重组自交系；6-13：抗病重组自交系。
具体实施方式
[0024] (一)材料与方法：
[0025] 1.李培富等利用抗稻瘟病水稻地方品种薄稻(♀)与感病品种苏御糯( )杂交获得F1，自交获得F2分离群体，用于遗传分析，明确薄稻对“北1”菌系的抗性是由一对主效显性基因控制的，进一步将薄稻与12个日本稻瘟病鉴别品种杂交进行等位性测定，结果表明，薄稻对北1菌系的抗性基因与12个鉴别品种所携带的已知抗病基因是不等位的，将该基因命名为Pi-bd1(t)(遗传，2007，29(10)：1249～1255)。本发明在此基础上，采用单粒传法构建F2∶6重组自交系群体，即两亲本杂交获得F1，自交获得F2，F2随机选取166个单株，单株自交产生株系，连续自交5代，最终构建成包括166个株系的F2∶6重组自交系群体。利用该群体进一步将Pi-bd1(t)定位于第11条
染色体RM6091和RM26632之间，并与这两个标记紧密连锁，遗传距离均为1.2CM。
[0026] 2.菌种培养和接种鉴定方法，参照李培富等(中国水稻科学，2007，21：579～584)。
[0027] 3.DNA提取方法：用SDS法提取分离群体各单株的DNA。
[0028] 4.紧密连锁分子标记的确定：
[0029] (1)标记多态性筛选：以亲本薄稻和苏御糯的DNA为模板，用Gramene
网站上公布的水稻SSR标记(http://www.gramene.org)，经PCR反应进行多态性分析。
[0030] (2)多态性标记的抗感池筛选：在重组自交系群体中，随机选择10个接种鉴定为抗病表型的家系材料(抗病重组自交系)和10个接种鉴定为感病表型的家系材料(感病重组自交系)，提取DNA后分别混合，形成抗病池和感病池，对多态性标记进行筛选分析其与抗感之间的关系，如果某一标记的抗病池电泳结果和抗病亲本一致，感病池电泳结果和感病亲本一致，则说明该标记可能与抗病基因紧密连锁。
[0031] (3)紧密连锁分子标记的验证：将可能与抗病基因紧密连锁的分子标记分别在构成抗感池的10个家系材料中进行验证，如果连锁关系确实存在时，再在所有的家系材料中进行验证，根据连锁的多态性标记与对应的抗感表型，分析标记与基因间的重组
频率，计算出标记对抗性的选择效率。
[0032] 5.PCR反应体系：体积为10μl，其中10×缓冲液(含Mg2+)1.0μl，分子标记引物对(4pmol/μl)1μl，2.5mM dNTPs 0.2μl，Taq酶(5U/μl)0.1μl，模板DNA(10ng/μl)1μl，加水至10μl。反应程序为：DNA94℃预变性5分钟后，(94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸展1分钟)循环35次，最后72℃延伸10分钟。在biometre扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。
[0033] (二)结果与分析：
[0034] 研究结果发现，SSR标记RM6091、RM26632与抗病基因Pi-bd1(t)紧密连锁(图1，图2)，在亲本中的扩增条带大小如表2所示。在重组自交系166个家系材料中(332个配子中)，选择效率计算方法如下
[0035] SSR标记RM6091与抗病基因Pi-bd1(t)之间出现2个交换型配子，重组率仅为1.2％，该标记对抗性的选择效率达98.8％；
[0036] SSR标记RM26632与抗病基因Pi-bd1(t)之间出现2个交换型配子，重组率仅为1.2％，该标记对抗性的选择效率达98.8％；
[0037] SSR标记RM6091和RM26632双标记筛选的选择效率为1-1.2％*1.2％＝99.98％；
[0038] 通过上述2个分子标记可以高效鉴定抗稻瘟病基因Pi-bd1(t)存在与否，单标记选择效率均达到98.8％，双标记组合的选择效率达99.98％。可用于分子标记辅助选择有效提高水稻抗病品种的育种进程，控制育种群体规模。
[0039] 表2.
[0040]
