(一)技术领域：

本发明涉及一种模拟膝关节物理环境培养软骨的方法及生物反应器，特别 是指滚压载荷、双频振动载荷以及低氧条件下模拟关节物理环境应用于细胞、 组织培养和保存的方法及相关的生物反应器，属于生物医学工程技术领域。

(二)背景技术：

关节软骨损伤是外科常见的疾病之一，通常由外伤、手术切除、骨性关节 炎等慢性疾病引起。临床表现为顽固性疼痛，关节活动障碍，严重者可完全丧 失关节功能，成为肢残和劳动力丧失的主要原因之一。大量研究结果表明，由 于软骨组织再生能力极为有限，软骨损伤自我修复几乎不可能。目前临床上较 多采取“关节钻孔”、“微骨折”等方法治疗软骨缺损近期能缓解疼痛，但远不 令人满意。组织工程正成为一种永久修复组织缺损的理想方法，在种子细胞、 支架材料、生长调节因子、组织构建方面都已取得辉煌成就的今天，仍然缺乏 合适的生物反应器构建人工软骨。

软骨组织工程的基本方法是将自体或异体细胞经体外培养、扩增后，接种 到一种组织相容性好、可降解吸收的生物材料上，形成细胞—生物材料复合体 后，将细胞—生物材料植入体内组织缺损部位，生物材料逐渐被降解吸收，而 细胞就形成了新的有功能的组织，达到修复组织或器官缺损的目的。

软骨组织是人体的承力结构，软骨细胞对力学环境较敏感。关节软骨的力 学条件不正常就可能使软骨组织退化或变性。在关节软骨的物理环境中除低氧 条件外，力学条件是最重要的影响因素。

最近几年相关研究者对不同的力学刺激，以优化培养物的结构和功能做了 大量研究：国内有研究者采用静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应进行研究， 实验表明细胞增殖数量随静张应力增高而升高[华西口腔医学杂志，2003，21 (1)，57-60]；也有研究空气压应力对体外培养软骨细胞分泌细胞因子的影响 [解剖学报，2001，32(4)，385-387]；离心力在体外构建组织工程软骨中的作 用[中华实验外科杂志。2005，22(3)，281-283]；周期性流体应力刺激对组织 工程软骨分化影响的实验研究[骨与关节损伤杂志，2003，18(9)，620-622]。 这些加载方法可以促进细胞增殖或功能发挥，但和真正软骨受载是有差别的。 Mauck等[J Biomech Eng，2000；122(3)：252-260]把软骨细胞接种在琼脂糖 凝胶进行动态直接施压，载荷大小是使复合体变形10％，频率为1Hz，探索功 能化软骨组织工程的培养，4周后发现GAG(氨基葡聚糖)升高45％，胶原含量 增加37％，明显高于未加载组。Buschmann(Journal of Cell Science 108(Pt 4)(1995)1497-1508)等施加1Hz，应变3％的动态压载荷进行软骨构建，实 验表明硫酸软骨素增加15％-25％，脯氨酸增加10％-25％，同时，在这种力学条件 下研究不同培养时间培养物弹性模量的变化。以上流体剪应力、液体压力、拉 伸、直接压缩、变形剪应力等分别都是活体软骨受力状态的微观部分体现，人 体在行走中膝关节的股骨远端和胫骨近端相互接触，有滑动和滚动两种运动。 其中关节软骨受到压缩和剪切，压缩应变平均超过13％，应力甚至可达20MPa， 这是人体在行走等活动中软骨组织等受到的是低频高幅载荷，同时肌肉为保持 身体形态对骨施加高频低幅载荷，因此从仿生角度，我们提出采用滚压载荷和 双频振动载荷模拟关节的力学条件。这种加载方式可能优化软骨组织工程或组 织保存的力学环境。

(三)发明内容：

本发明的目的旨在提供一种模拟膝关节物理环境培养软骨的方法及生物反 应器，以解决现有技术中的不足。采用滚压载荷或/和双频振动载荷和低氧环境 的物理条件模拟人体关节软骨环境，用于软骨培养物培养的方法及生物反应器。

本发明一种模拟膝关节物理环境培养软骨的方法，是在生物反应器内进行， 其具体方法如下：

将软骨培养物固定于所述的生物反应器的培养室底板；通过计算机控制灌 流系统，保证培养室内培养液的更换，使软骨培养物处于细胞可生长的生物环 境下，软骨培养物的培养箱内氧气含量为1％-10％；通过滚压加载机构对软骨培 养物施加滚压载荷，使软骨培养物被辊子来回滚动，受到滚压载荷，其中：滚 动速度载荷为0.01-15cm/s，加载体(即辊子)往复滚动频率为0.001-3Hz，辊 子滚动接触处软骨培养物变形1％-60％；另外双频振动机构对软骨培养物施加 双频振动载荷，两种载荷频率范围均为0.001-100Hz，应变幅值为 0.000001-0.6；加载时间为每24小时加载1-6次，每次10分钟-360分钟， 培养1-60天；在此种力学环境使组织生长、发育，完成培养物的培养。

其中，所述的培养液是生物学细胞培养常规培养液，可从市场上购买。所 述的培养箱是生物学细胞培养常规使用的，可从市场上购买。

其中，所述的培养箱内氧气含量是通过在培养箱内加入50％-95％的CO2实 现；

其中，所述的软骨培养物是：软骨细胞、软骨组织、软骨细胞与支架复合 体或软骨移植组织。

其中，通过滚压加载机构对软骨培养物施加滚压载荷，是指在培养物上表 面直接施加。

其中，双频振动机构对软骨培养物施加双频振动载荷，是指在培养物下表 面直接施加。

其中，所述的双频振动载荷包括低频高幅叠加高频低幅的特征，各载荷波 形为方波、正弦波、三角波。

本发明一种模拟膝关节物理环境培养软骨的生物反应器，主要是针对本发 明所提出的方法而设计，该生物反应器包括培养箱、培养液灌流系统、滚压加 载机构、双频振动加载机构、培养室和计算机等；

所述的滚压加载机构是使一个辊子滚压培养物的纯滚动的机构，包括圆柱 型辊子2，其两侧同心有大小相等的齿轮，另有齿条，步进电机和丝杠；齿轮1 在齿条上运动，齿轮与辊子同轴，丝杠连接辊子的轴，步进电机与丝杠连接。 其中，所述的辊子为不锈钢材料，表面为均匀厚度0-4mm的硅胶膜；

所述的双频振动加载机构主要包括导向轴承、挺杆、凸轮和一个压电陶瓷 驱动器、电机等；凸轮的轴与电机同轴，凸轮与挺杆接触，挺杆另一侧和压电 陶瓷驱动器连接，压电陶瓷驱动器另一端连接加载头。复位弹簧套在加载头上， 使加载头复位。

培养室内底面固定培养物，培养室壁上有灌流接口，将培养室与灌流系统 连接。

所述的灌流系统，包括培养液储存瓶，通过硅胶管与培养室连接，由蠕动 泵提供流动动力；

所述的计算机装有压电陶瓷驱动器软件系统及蠕动泵控制系统，可对压电 陶瓷驱动器及蠕动泵进行自动控制。

滚压加载机构及双频振动加载机构、培养液灌流系统和培养室都放在培养 箱内；且滚压加载机构的辊子置于培养室内；培养室底板底面与双频振动加载 机构连接，培养室通过灌流接口与培养液灌流系统相通；计算机通过导线进入 培养箱内连接滚压加载机构及双频振动加载机构、培养液灌流系统。

本发明一种模拟膝关节物理环境培养软骨的方法及生物反应器，其优点及 功效在于：本发明方法中对软骨培养物所施加滚压载荷或/和双频振动载荷加载 方式及低氧环境更接近关节生理条件。

(四)附图说明：

图1为本发明所述的方法总框图；

图2为本发明生物反应器的立体示意图；

图3为本发明生物反应器中放置了培养物后的俯视图；

图4为本发明生物反应器中的灌流系统示意图；

图5为图2的剖面示意图；

图6为每种压电陶瓷驱动器可加载的四种波形示意图；

图中具体标号如下：

1齿轮；     2辊子；    3压条；    4培养室；

5拉杆；     6丝杠；    7步进电机；8灌流接口；

9支架；     10上底板； 11齿条；   12支柱；

13导向轴承；14挺杆；   15凸轮；   16电机；

17底板平台；18压电陶瓷驱动器；    19培养物；

20培养箱； 21复位弹簧；22加载头

(五)具体实施方式：

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的说明。

一种本发明模拟膝关节物理环境培养软骨的方法，是在生物反应器内进 行，如图1所示，它包括具备低氧和37度温度调节的细胞培养培养箱，及灌流等 条件，在无菌条件下把培养物转移到消毒过的培养室内，按细胞、组织培养标准 过程操作，将培养物固定于培养室底板，由蠕动泵驱动培养液灌注，保持培养 液新鲜，培养液中加入活性因子(如，生长因子等)。由计算机控制，软骨培养 物的培养箱内氧气含量为1％-10％，通过在培养箱内加入50％-95％的CO2实现；辊 子2为不锈钢材料，表面为均匀厚度0-4mm的硅胶膜；通过滚压加载机构使辊子 来回滚动，培养物被受到滚压载荷，其中：滚动速度载荷为0.01-15cm/s，加载 体往复滚动频率为0.001-3Hz，辊子滚动接触处软骨培养物变形1％-60％；另外 双频振动加载机构在软骨培养物下表面施双频振动载荷，两种载荷频率范围均 为0.001-100Hz，应变幅值为0.001-0.6。该双频振动载荷包括低频高幅叠加高 频低幅的特征，如，其低频范围为0.01-10Hz，高幅应变范围为0.001-0.4；高 频范围为5-100Hz，低幅应变范围为0.000001-0.01；各载荷波形为方波、正弦 波、三角波；这样培养物受到的是低频高幅叠加高频低幅载荷作用，如图6所示。 加载时间为每24h加载1-6次，每次10min-360min，培养1-60天。在此种力学环 境使组织生长、发育，完成培养物的培养。

本发明所述的培养液是生物学细胞培养常规培养液，可从市场上购买。所 述的培养箱是生物学细胞培养常规使用的，可从市场上购买。

本发明所述的培养物是：细胞、组织、细胞与支架复合体或移植组织。所 述的通过滚压加载机构对软骨培养物施加滚压载荷，是指在培养物上表面直接 施加。所述的双频振动机构对软骨培养物施加双频振动载荷，是指在培养物下 表面直接施加。

本发明一种模拟膝关节物理环境培养软骨的生物反应器，主要是针对本发 明所提出的方法而设计，如图2至图5所示，该生物反应器包括培养箱、培养 液灌流系统、滚压加载机构、双频振动加载机构、培养室、上底板10、底板平 台17、支柱12及计算机等；

所述的上底板10及底板平台17通过四根支柱12固定成一个框架结构，所 述的滚压加载机构和培养室4通过两个竖向的平板状的支架9固定于上底板10 上。

所述的滚压加载机构是使一个辊子滚压培养物的纯滚动的机构，包括圆柱 型辊子2，其两侧同心有大小相等的齿轮1；两齿条11沿支架9内侧底部固定 于支架9上；齿轮1在齿条11上运动，齿轮1与辊子2同轴，丝杠6连接辊子 2的轴，步进电机7与丝杠6连接。其中，辊子2为不锈钢材料，表面为均匀 厚度0-4mm的硅胶膜，模拟关节中另一面的软骨。

所述的双频振动加载机构主要包括导向轴承13、挺杆14、凸轮15和一个 压电陶瓷驱动器18、电机16等；凸轮15的轴与电机16同轴，凸轮15与挺杆 14接触，挺杆14另一侧和压电陶瓷驱动器18连接，压电陶瓷驱动器18另一 端连接加载头22。复位弹簧21套在加载头22上，使加载头复位，如图5所示。

培养室4内底面固定培养物19，培养室壁上有灌流接口8，将培养室4与 灌流系统连接。

所述的灌流系统，包括培养液储存瓶23，通过硅胶管24与培养室4连接， 由蠕动泵25提供流动动力；

所述的计算机装有压电陶瓷驱动器软件系统及蠕动泵控制系统，可对压电 陶瓷驱动器及蠕动泵进行自动控制。

滚压加载机构及双频振动加载机构、培养液灌流系统和培养室都放在培养 箱内；且滚压加载机构的辊子置于培养室内；培养室底板底面与双频振动加载 机构连接，培养室通过灌流接口8与培养液灌流系统相通；计算机通过导线进 入培养箱内连接滚压加载机构及双频振动加载机构、培养液灌流系统。

该生物反应器工作时，由计算机控制，软骨培养物的培养箱内氧气含量为 1％-10％，通过在培养箱内加入50％-95％的CO2实现；对于滚压加载机构，辊子2与 其两侧大小相等的齿轮1固定在同一轴上，齿轮1在齿条11上由步进电机7通过丝 杠6控制往复运动，这样带动辊子在培养室内往复纯滚动。同时压条3压在辊子 的轴上，向下调节压条3，给辊子的轴向下的力，辊子2向下运动，给培养物19 一定压缩量。对于双频振动机构，导向轴承13中有挺杆14、压电陶瓷驱动器18、 加载头22依次相互连接，其中挺杆14一面与凸轮15接触，加载头17直接与培养 室4底板底面接触。电机16带动凸轮15旋转，引起挺杆14、压电陶瓷驱动器18、 加载头22和培养室4上下振动，同时压电陶瓷驱动器18被输入不同电压信号，引 起压电陶瓷驱动器18不同伸缩位移，辊子2的高度固定，使培养物19同样受到振 动载荷，复位弹簧21使双频振动加载机构复位。两种振动叠加形成双频振动载 荷。灌流系统保证培养液的更换。这样实现对培养物的滚压载荷或/和双频振动 载荷和低氧条件下培养。