技术领域
[0001] 本
发明属于分子辅助诊断领域,涉及鉴别甲状腺良恶性结节的基因片段及其应用,具体涉及BIN1基因和DNM2基因甲基化在甲状腺结节良恶性鉴别中的应用。
背景技术
[0002] 甲状腺结节(Thyroid nodules)是甲状腺细胞异常增生后在甲状腺组织中形成的团
块。甲状腺结节非常常见,尽管大多数甲状腺结节是良性的,但还是有一小部分甲状腺结
节进展为甲状腺癌。为了更早期诊断和
治疗甲状腺癌,同时降低非必要的手术,需要对甲状
腺结节进行良恶性鉴别。
[0003] 目前对甲状腺结节的评估主要通过超声检查(ultrasonography,US)和
细针穿刺活检(fine needle aspiration biopsy,FNAB)。在甲状腺结节的诊断程序中,US是目前敏
感性最高的检查方法,可测量结节的大小、确定结节的内部结构等。提示甲状腺结节为恶性
的US征象包括:结节的高度大于宽度(OR=10.15)、缺乏声晕(OR=7.14)、微小
钙化(OR=
6.76)、边界不规则(OR=6.12)、回声减低(OR=5.07)、实性结节(OR=4.69)、结节内部血流丰富(OR=3.76)等。直径>1cm,且超声检查有恶性征象的结节再行FNAB判断结节性质。细
胞学检查结果中还有高达20%的结节为不确定甲状腺结节(indeterminate thyroid
nodules),这部分结节需要结合分子检测。市面上已有 Gene Expression
Classifier和ThyroSeqv2产品,前者阳性预测值(positive predictive value,PPV)很低,
只有46%;后者PPV也只有42%-77%。因此需要更精确的
分子诊断工具。
[0004] DNA甲基化是表观遗传的一种机制,是真核细胞基因组常见的表观遗传学修饰,也是
脊椎动物DNA在不改变DNA序列的情况下重要的自然化学修饰方式,在
细胞增殖、分化、发
育等方面起重要作用,与
肿瘤的发生、发展关系密切。DNA甲基化在体内有着重要作用,其效应有转录抑制、
染色质结构调节、X染色体失活、基因组印记等,DNA甲基化异常可以通过影
响染色质结构以及癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤的发生和进展。
[0005] CpG二核苷酸是
哺乳动物发生DNA甲基化的最主要靶点,分布于整个染色体组。健康人基因组中,CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态,而在CpG岛外的CpG位点则通常
高甲基化,这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定保留。当肿瘤发生时,通常抑癌
基因非CpG岛区的CpG位点甲基化程度降低,而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,导致染
色质结构改变及抑癌基因表达的降低。
[0006] 随着过去十几年来遗传学和表观遗传学的不断发展,越来越多的研究者认识到肿瘤的发生并不完全由遗传基因决定,表观遗传学的后天影响同样发挥重要作用。甲状腺癌
中的表观遗传学改变主要体现为抑癌基因和甲状腺相关基因的异常甲基化。研究甲状腺癌
的DNA甲基化可以为我们提供新的分子标志物,为早期诊断、
治疗方案选择和
预后评估提供
可靠依据。
[0007] 目前DNA甲基化检测方法有:亚
硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing,BS)、甲基化特异的PCR法(Methylation-specific PCR,MSP)、甲基化敏感高
分辨率熔解曲线法
(Methylation-sensitivity High-resolution Melting,MS-HRM)和高通量测序法等。相对
于其他的检测方法而言,亚硫酸氢盐测序法是DNA甲基化检测中的“金标准”,检测较为精
准,但其检测灵敏度相对较低,且操作较繁琐、成本高。甲基化敏感高分辨率熔解曲线法在
PCR扩增中通过观察熔解曲线的变化来判断DNA是否发生甲基化,此类方法结果分析相对复
杂。高通量测序检测方法主要涉及到的成本太高,周期长,不利于临床上的推广。本领域亟
需甲状腺结节良恶性鉴别的高特异性、高灵敏度
试剂盒。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的组合物,通过运用该组合物检测BIN1基因、DNM2基因中目标位点的甲基化情况,实现甲状腺结节的良恶性鉴别。
[0009] 本发明提供一种核酸分子,选自:(1)由SEQ ID NO:1和2或与其有至少90%相同性的序列作为引物扩增得到的BIN1基因的片段;(2)由SEQ ID NO:3和4或与其有至少90%相
同性的序列作为引物扩增得到的DNM2基因的片段;和(3)(1)和(2)所述片段的混合物。
[0010] 在一个或多个实施方案中,所述片段中未甲基化的胞嘧啶被转化为不与
鸟嘌呤结合的
碱基。
[0011] 本发明还提供一种引物分子,选自:(1)SEQ ID NO:1和2所示的序列或与其有至少90%相同性的序列;(2)SEQ ID NO:3和4所示的序列或与其有至少90%相同性的序列;和
(3)(1)和(2)所述序列的混合物。
[0012] 在一个或多个实施方案中,所述引物分子还包括检测内参基因ACTB的引物,其中,检测内参基因ACTB的引物能扩增出由SEQ ID NO:5和6或与其有至少90%相同性的序列作
为引物扩增得到的ACTB基因的片段。优选地,检测内参基因ACTB的引物为SEQ ID NO:5和6
或与其有至少90%相同性的序列。
[0013] 本发明还提供一种探针分子,所述探针分子能与选自以下的一个或多个片段杂交:由SEQ ID NO:1和2作为引物扩增得到的BIN1基因的片段、由SEQ ID NO:3和4作为引物
扩增得到的DNM2基因的片段、和任选的由SEQ ID NO:5和6作为引物扩增得到的ACTB基因的
片段。
[0014] 有宣读,探针分子包含SEQ ID NO:7和8所示的序列或与其有至少90%相同性的序列和任选的SEQ ID NO:9所示序列或与其有至少90%相同性的序列。
[0015] 本发明还提供了一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的组合物,所述组合物包括分别用于检测样品中与甲状腺结节良恶性相关的BIN1基因和DNM2基因的核酸分子,以及任选的
检测内参基因的核酸分子。
[0016] 在一个或多个实施方案中,所述检测是检测甲基化
水平。
[0017] 具体地,本发明提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的组合物,所述组合物包括分别用于检测待检样品中与甲状腺结节良恶性相关的甲基化区域的BIN1基因的核酸序列
和DNM2基因的核酸序列,以及内参基因的核酸序列。
[0018] 在一个或多个实施方案中,检测BIN1基因的核酸分子包含SEQ ID NO:1-2中任一所示序列,检测DNM2基因的核酸分子包含SEQ ID NO:3-4中任一所示序列。具体序列如下:
[0019] BIN1基因正向引物F:
[0020] AGGCGGTTTAGTTTGGGTTTTAG(SEQ ID NO:1),
[0021] BIN1基因反向引物R:
[0022] AAACCCCGCCTAAAAAAACTTCC(SEQ ID NO:2),
[0023] DNM2基因正向引物F:
[0024] GAAGATGAGTTGTAGAATGAGAGGT(SEQ ID NO:3),
[0025] DNM2基因反向引物R:
[0026] CCCTCACAAAAACTTCCTTCCC(SEQ ID NO:4)。
[0027] 在一个或多个实施方案中,所述内参基因是ACTB。在一个或多个实施方案中,检测内参基因的核酸分子包含SEQ ID NO:5-6中任一所示序列。具体序列如下:
[0028] 内参基因正向引物F:
[0029] CCCTTAAAAATTACAAAAACCACAACC(SEQ ID NO:5),
[0030] 内参基因反向引物R:
[0031] AGGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTG(SEQ ID NO:6)。
[0032] 在一个或多个实施方案中,所述核酸分子是引物。
[0033] 在一个或多个实施方案中,所述组合物还包括BIN1基因的探针、DNM2基因的探针以及内参基因的探针,所述探针分别识别相应核酸分子的扩增片段。优选地,BIN1基因的探
针包含SEQ ID NO:7所示序列,DNM2基因的探针包含SEQ ID NO:8所示序列。具体探针序列
如下:
[0034] BIN1基因探针:TTTGAGAACGTGAGGTTGTTGGCGGGA(SEQ ID NO:7)
[0035] DNM2基因探针:TCGGGTGACGATTTTTGAATCGCGGGGA(SEQ ID NO:8)。
[0036] 在一个或多个实施方案中,所述内参基因是ACTB。在一个或多个实施方案中,内参基因的探针包含SEQ ID NO:9所示序列。具体序列如下:
[0037] 内参基因探针:ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA(SEQ ID NO:9)。
[0038] 在一个或多个实施方案中,所述各探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中,所述可检测物是5’端
荧光报告基团和3’端标记淬灭基团。在一个或多个实施方案中,所述荧光报告基因选自Cy5、FAM和VIC。
[0039] 优选地,所述探针序列如下:
[0040] BIN1基因探针:
[0041] Cy5-TTTGAGAACGTGAGGTTGTTGGCGGGA-BHQ2
[0042] DNM2基因探针:
[0043] FAM-TCGGGTGACGATTTTTGAATCGCGGGGA-BHQ1
[0044] 内参基因探针:
[0045] VIC-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1。
[0046] 本发明还提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的甲基化检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括引物分子和任选的探针分子,其中,所述引物分子能扩增出由SEQ ID
NO:1和2或与其有至少90%相同性的序列作为引物扩增得到的BIN1基因的片段和由SEQ ID
NO:3和4或与其有至少90%相同性的序列作为引物扩增得到的DNM2基因的片段,所述探针
分子包含SEQ ID NO:7和8所示的序列或与其有至少90%相同性的序列。
[0047] 在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括检测内参基因ACTB的引物和任选的检测内参基因ACTB的探针分子,其中,检测内参基因ACTB的引物能扩增出由SEQ ID NO:5和
6或与其有至少90%相同性的序列作为引物扩增得到的ACTB基因的片段,检测内参基因
ACTB的探针分子包含SEQ ID NO:9所示序列或与其有至少90%相同性的序列。
[0048] 在一个或多个实施方案中,所述试剂盒包含本文所述的引物分子、任选的本文所述的核酸分子和任选的本文所述的探针分子。
[0049] 在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括经转化的阳性标准品,其中未甲基化的胞嘧啶转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。在一个或多个实施方案中,所述阳性标准品是
完全甲基化的。
[0050] 在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括PCR反应试剂。优选地,所述PCR反应试剂包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg2+。
[0051] 在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的试剂,所述试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂:基于重亚
硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性
PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化
图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。优选地,所述试剂选自以下一种或多种:重亚硫酸盐及其
衍
生物、甲基化敏感或不敏感的限制性内切酶、酶切缓冲液、
荧光染料、荧光淬灭剂、荧光报告剂、外切核酸酶、碱性
磷酸酶、内标、对照物。
[0052] 在一个或多个实施方案中,甲状腺结节良恶性鉴别的判读方法为:根据BIN1和DNM2的甲基化水平计算得分,得分大于0则判定结果为阳性,即甲状腺结节为恶性结节。在
一个或多个实施方案中,得分小于0则判定结果为阴性,即甲状腺结节为良性结节。
[0053] 优选地,得分=3.80–0.07×BIN1甲基化水平–0.02×DNM2甲基化水平。
[0054] 在PCR实施方案中,优选地,甲基化水平=2–ΔCt待检样品/2–ΔCt阳性标准品×100其中,ΔCt=Ct目的基因–Ct内参基因。
[0055] 本发明还提供本文所述的核酸分子、引物分子、探针分子在制备甲状腺结节良恶性鉴别试剂中的应用。在一个或多个实施方案中,所述试剂用于检测样品中DNA的BIN1甲基
化水平和DNM2甲基化水平,所述鉴别包括根据所述甲基化水平判读甲状腺结节良恶性。
[0056] 在一个或多个实施方案中,所述样品来自哺乳动物的组织、细胞或者体液,例如甲状腺组织或血液。所述哺乳动物优选为人。在一个或多个实施方案中,所述样品是甲状腺结
节活检物,优选是细针穿刺活检物。在一个或多个实施方案中,所述样品是
血浆。
[0057] 在一个或多个实施方案中,所述样品来自具有甲状腺良性或恶性结节的对象。在一个或多个实施方案中,所述样品来自甲状腺肿大的患者。
[0058] 在一个或多个实施方案中,所述DNA是全基因组DNA和/或cfDNA。
[0059] 在一个或多个实施方案中,所述DNA经转化,其中未甲基化的胞嘧啶转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。所述转化使用酶促方法进行,优选脱
氨酶处理,或所述转化使用非酶促方
法进行,优选用亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理,更优选使用亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸
氢
钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重
硫酸钾和重硫酸铵处理。
[0060] 在一个或多个实施方案中,所述检测包括但不限于:基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化
测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线
法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。
[0061] 在一个或多个实施方案中,所述检测是亚硫酸氢盐测序法检测。
[0062] 在一个或多个实施方案中,所述检测是荧光定量PCR检测,还包括使用本文所述探针。
[0063] 在一个或多个实施方案中,PCR的反应液包含Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg2+。优选地,Taq DNA聚合酶为
热启动Taq DNA聚合酶。优选地,Mg2+终浓度为1.0-10.0mM。
[0064] 在一个或多个实施方案中,PCR中各引物浓度为200-700nM。
[0065] 在一个或多个实施方案中,PCR中各探针浓度为100-400nM。
[0066] 在一个或多个实施方案中,PCR反应条件为,95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃
退火延伸1min,45个循环。
[0067] 在一个或多个实施方案中,判读方法为:根据两个基因的甲基化水平计算得分,得分大于0则结果为阳性,即甲状腺结节为恶性结节。在一个或多个实施方案中,得分小于0则
结果为阴性,即甲状腺结节为良性结节。
[0068] 优选地,得分=3.80–0.07×BIN1甲基化水平–0.02×DNM2甲基化水平。
[0069] 在PCR实施方案中,优选地,甲基化水平=2–ΔCt待检样品/2–ΔCt阳性标准品×100,其中,ΔCt=Ct目的基因–Ct内参基因。
[0070] 在测序实施方案中,优选地,甲基化水平=甲基化碱基数/总碱基数。
[0071] 本发明还提供了一种甲状腺结节良恶性鉴别的方法,包括:
[0072] (1)用本文所述引物检测样品中DNA的BIN1甲基化水平和DNM2甲基化水平,
[0073] (2)根据(1)的甲基化水平判读甲状腺结节良恶性。
[0074] 在一个或多个实施方案中,所述方法在步骤(1)之前还包含DNA抽提和/或质检。
[0075] 在一个或多个实施方案中,所述样品来自哺乳动物的组织、细胞或者体液,例如甲状腺组织或血液。所述哺乳动物优选为人。在一个或多个实施方案中,所述样品是甲状腺结
节活检物,优选是细针穿刺活检物。在一个或多个实施方案中,所述样品是血浆。
[0076] 在一个或多个实施方案中,所述样品来自具有甲状腺良性或恶性结节的对象。在一个或多个实施方案中,所述样品来自甲状腺肿大的患者。
[0077] 在一个或多个实施方案中,所述DNA是全基因组DNA和/或cfDNA。
[0078] 在一个或多个实施方案中,所述DNA经转化,其中未甲基化的胞嘧啶转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。所述转化使用酶促方法进行,优选脱氨酶处理,或所述转化使用非酶促方
法进行,优选用亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理,更优选使用亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸
氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵处理。
[0079] 在一个或多个实施方案中,所述检测包括但不限于:基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化
测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线
法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。
[0080] 在一个或多个实施方案中,所述检测是亚硫酸氢盐测序法检测。
[0081] 在一个或多个实施方案中,所述检测是荧光定量PCR检测,还包括使用本文所述探针。
[0082] 在一个或多个实施方案中,PCR的反应液包含Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg2+。优选地,Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。优选地,Mg2+终浓度为1.0-10.0mM。
[0083] 在一个或多个实施方案中,PCR中各引物浓度为200-700nM。
[0084] 在一个或多个实施方案中,PCR中各探针浓度为100-400nM。
[0085] 在一个或多个实施方案中,PCR反应条件为,95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃退火延伸1min,45个循环。
[0086] 在一个或多个实施方案中,判读方法为:根据两个基因的甲基化水平计算得分,得分大于0则结果为阳性,即甲状腺结节为恶性结节。在一个或多个实施方案中,得分小于0则
结果为阴性,即甲状腺结节为良性结节。
[0087] 优选地,得分=3.80–0.07×BIN1甲基化水平–0.02×DNM2甲基化水平。
[0088] 在PCR实施方案中,优选地,甲基化水平=2–ΔCt待检样品/2–ΔCt阳性标准品×100,其中,ΔCt=Ct目的基因–Ct内参基因。
[0089] 在测序实施方案中,优选地,甲基化水平=甲基化碱基数/总碱基数。
[0090] 本发明的主要优点在于:通过同时进行多个靶序列的检测,提高了甲状腺结节良恶性鉴别的灵敏度和特异性。采用PCR法,操作简单,结果易于判读,对仪器要求不高,以试剂盒的形式更方便临床上的推广应用。
附图说明
[0091] 图1是本发明BIN1基因和DNM2基因在37例甲状腺癌和37例甲状腺良性结节中的甲基化水平分析。
[0092] 图2是本发明BIN1基因和DNM2基因联合检测22例甲状腺癌和22例甲状腺良性结节的ROC曲线分析。
具体实施方式
[0093]
发明人发现BIN1和DNM2基因的甲基化水平与恶性甲状腺结节相关。提及甲状腺结节时,本文所述“良性”和“恶性”表示甲状腺结节的性质。通常,良性表现为结节生长缓慢、质地均匀、
活动度好、表面光滑、呈囊性改变、无淋巴结肿大、无钙化等。恶性表现为不可控的恶性细胞生长、扩散和组织浸润。提示甲状腺结节为恶性的超声征象包括:结节的高度大
于宽度、缺乏声晕、微小钙化、边界不规则、回声减低、实性结节、结节内部血流丰富等。在一些实施方式中,恶性甲状腺结节包括甲状腺癌。
[0094] 本文中,检测DNA甲基化的方法本领域周知,例如基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP))、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序
(Bisulfite sequencing,BS)、全基因组甲基化测序(Whole-genome bisulfite
sequencing,WGBS)、简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,
RRBS))、芯片、甲基化敏感的限制性内切酶分析法(Methylation-Sensitive Dependent
Restriction Enzymes)、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(Methylation-
sensitivity High-resolution Melting,MS-HRM)、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例
如飞行质谱)。在一个或多个实施方案中,检测包括检测基因或位点处的任一条链。
[0095] 因此,本发明涉及检测DNA甲基化的试剂。本领域周知上述检测DNA甲基化的方法中所用的试剂。此外,在涉及DNA扩增的检测方法中,检测DNA甲基化的试剂包括引物。所述
引物序列为甲基化特异的或非特异的。优选地,所述引物的序列包括非甲基化特异的封闭
序列(Blocker)。封闭序列可以提高甲基化检测的特异性。
[0096] 示例性地,当使用荧光定量PCR时,检测DNA甲基化的试剂还可包括探针。所述探针的序列的5’端标记荧光报告基团,3’端标记淬灭基团。通常,PCR的反应液包含Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg2+。优选地,Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。示例性地,Mg2+终浓度为1.0-10.0mM;各引物浓度为200-700nM;各探针浓度为100-400nM;PCR反应条件为,95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃退火延伸1min,45个循环。
[0097] 本文术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比,通过一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代使核酸序列发生变化同时保留其与其他核酸杂交能
力的多核苷酸。本文任
一实施方案所述的突变体包括与参照序列具有至少70%,优选至少80%,优选至少85%,优
选至少90%,优选至少95%,优选至少97%的序列相同性并保留参照序列的生物学活性的
核苷酸序列。可采
用例如NCBI的BLASTn计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还
包括在参照序列的核苷酸序列中具有一个或多个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留参
照序列生物学活性的核苷酸序列。所述多个突变通常指1-10个以内,例如1-8个、1-5个
或1-3个。取代可以是嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸之间的取代,也可以是嘌呤核苷酸之间或
嘧啶核苷酸之间的取代。取代优选是保守性取代。例如,在本领域中,用性能相近或相似的
核苷酸进行保守性取代时,通常不会改变多核苷酸的
稳定性和功能。保守性取代例如嘌呤
核苷酸之间的(A与G)的互换,嘧啶核苷酸之间的(T或U与C)的互换。因此,在本发明多核苷
酸中用来自同一残基替换一个或几个位点,将不会在实质上影响其活性。此外,本发明的变
体中的甲基化位点(例如连续的CG)未发生突变。即本发明方法检测的是相应序列中的可甲
基化位点的甲基化情况,对于非可甲基化位点的碱基可以发生突变。
[0098] 本发明还提供一种用于甲状腺结节良恶性鉴别的甲基化检测试剂盒,所述试剂盒包括引物分子和任选的探针分子,其中,所述引物分子能扩增出由SEQ ID NO:1和2或与其
有至少90%相同性的序列作为引物扩增得到的BIN1基因的片段和由SEQ ID NO:3和4或与
其有至少90%相同性的序列作为引物扩增得到的DNM2基因的片段,所述探针分子包含SEQ
ID NO:7和8所示的序列或与其有至少90%相同性的序列。所述试剂盒还可包括检测内参基
因ACTB的引物和任选的检测内参基因ACTB的探针分子,其中,检测内参基因ACTB的引物能
扩增出由SEQ ID NO:5和6或与其有至少90%相同性的序列作为引物扩增得到的ACTB基因
的片段,检测内参基因ACTB的探针分子包含SEQ ID NO:9所示序列或与其有至少90%相同
性的序列。
[0099] 所述试剂盒还可包括经转化的阳性标准品,其中未甲基化的胞嘧啶转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。所述阳性标准品可以是完全甲基化的。所述试剂盒还可包括PCR反应试
剂。优选地,所述PCR反应试剂包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg2+。试剂盒还可包括检测DNA甲基化的试剂,所述试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂:基
于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组
甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。所述试剂可
选自以下一种或多种:重亚硫酸盐及其衍生物、甲基化敏感或不敏感的限制性内切酶、酶切
缓冲液、荧光染料、荧光淬灭剂、荧光报告剂、外切核酸酶、碱性磷酸酶、内标、对照物。
[0100] 本发明还提供了一种甲状腺结节良恶性鉴别的方法,包括:(1)用本文所述引物检测样品中DNA的BIN1甲基化水平和DNM2甲基化水平,和(2)根据(1)的甲基化水平判读甲状
腺结节良恶性。通常,所述方法在步骤(1)之前还包括DNA抽提和/或质检。
[0101] 本文所述“DNA”或“DNA分子”即脱
氧核糖核酸。DNA的碱基(bp)主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。DNA形式包括cDNA、基因组DNA、片段化DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0102] 本文所述“尿嘧啶”或“U”是RNA的组成部分。“RNA”或“RNA分子”即核糖核酸。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。RNA的碱基主要有4种,即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)。在RNA的碱基
配对中,U取代了DNA中的T的
位置,即A与U经氢键配对,G与C经氢键配对。
[0103] DNA或RNA的碱基之间可发生转化。本文所述“转化”、“胞嘧啶转化”或“CT转化”是利用非酶促或酶促方法处理DNA,将未修饰的胞嘧啶碱基(cytosine,C)转化为不与鸟嘌呤结合的碱基(例如尿嘧啶碱基(uracil,U))的过程。本领域周知进行胞嘧啶转化的非酶促或
酶促方法。示例性地,非酶促方法包括亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理,例如亚硫酸氢钙、亚硫
酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵等。示例性地,酶促方法包括脱氨酶处理。经转化的DNA任选经纯化。适用于本文的DNA纯化方法本领域周知。
[0104] 在一个或多个实施方案中,甲状腺结节良恶性判读过程为:对所测基因的甲基化水平进行数学分析,计算得分,当得分满足某一
阈值时,则鉴定为恶性结节。本领域知晓常
规数学分析的方法以及确定阈值的过程,示例性的方法是二元Logistic回归分析。通常,该
阈值为0。即,得分大于0则结果为阳性,即甲状腺结节为恶性结节。在一个或多个实施方案
中,得分小于0则结果为阴性,即甲状腺结节为良性结节。优选地,通过下述公式计算得分:
得分=3.80–0.07×BIN1甲基化水平–0.02×DNM2甲基化水平,其中得分≥0则甲状腺结节
为恶性;得分<0则甲状腺结节为良性。
[0105] 本领域知晓甲基化水平的计算方法。示例性地,在通过PCR检测甲基化的实施方案中,甲基化水平=2–ΔCt待检样品/2–ΔCt阳性标准品×100,其中ΔCt=Ct目的基因–Ct内参基因。或者,在通过测序检测甲基化的实施方案中,甲基化水平=甲基化碱基数/总碱基数。
[0106] 本文中,样品来自哺乳动物,优选人。样品可来自任何器官(例如甲状腺)、组织(例如上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织)、细胞(例如甲状腺结节活检物)或者体液(例
如血液、血浆、血清、组织液、尿液)。通常,只要所述样品包含基因组DNA或cfDNA
(Circulating free DNA or Cell free DNA)即可。cfDNA称为循环游离DNA或者细胞游离
DNA,是释放到血浆中的降解的DNA片段。示例性地,所述样品是甲状腺结节活检物,优选是
细针穿刺活检物。或者,所述样品是血浆、血液或血清。
[0107] 在一个具体实施方案中,所述方法包括:(1)样本准备:包括DNA抽提、质检;(2)DNA转化:对步骤(1)得到的DNA进行重亚硫酸盐转化,未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)经过转化变为尿嘧啶(uracil,U);甲基化的胞嘧啶转化后不发生改变;(3)反应
混合液准备:包括
PCR反应液,引物混合物,探针混合物;(4)PCR混合物准备:向步骤(3)中加入步骤(2)重亚硫酸盐转化的模板DNA,以及阳性标准品、阴性对照或者非模板对照(NTC);(5)PCR反应:进行
PCR反应,收集荧光。所述PCR反应液包括:Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(buffer)、dNTPs、Mg2+;
Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶;Mg2+终浓度为1.0-10.0mM。引物混合物为待扩增基
因引物组成的混合物,其中每一条引物终浓度为200-700nM。探针混合物为待扩增基因探针
组成的混合物,其中每一条探针终浓度为100-400nM。PCR反应条件为,95℃预变性5min;95
℃变性15s,60℃退火延伸1min,45个循环。
[0109] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。下列实施例中,未注明具体条件的实验方法,通常按常规条件中所述的方法进行。
[0110] 实施例1,简化甲基化测序筛选甲状腺结节良恶性差异的基因。
[0111]
申请人对37例甲状腺癌和37例甲状腺良性结节的组织进行简化甲基化测序,发现BIN1基因和DNM2基因在甲状腺癌和甲状腺良性结节病例中的甲基化水平具有差异,结果如
图1所示。
[0112] 实施例2,验证甲状腺结节良恶性与基因甲基化的关系
[0113] 2.1,样本准备
[0114] 使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN,货号:51304)对22例甲状腺癌和22例甲状腺良性结节的组织进行DNA抽提;使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo,货号:Q32854)检测DNA的浓度;使用1%琼脂糖凝胶
电泳进行质检。
[0115] 2.2,DNA转化
[0116] 使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo,货号:MECOV50)对步骤1得到的DNA进行重亚硫酸盐转化,未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)经过转化变为尿嘧啶
(uracil,U);甲基化的胞嘧啶转化后不发生改变。
[0117] 2.3,PCR混合物准备
[0118] 使用本发明提供的试剂盒,包括PCR反应液、引物混合物(SEQ ID NO:1-6)、探针混合物(SEQ ID NO:7-9),进行单个样本的配制如表1:
[0119] 表1,PCR反应体系组成
[0120]
[0121] 2.4,荧光定量PCR
[0122] 设置PCR程序为95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃退火延伸1min,45个循环。60℃退火延伸阶段收集荧光
信号。
[0123] 2.5,检测结果分析
[0124] 利用下式和实施例1中的公式计算各样品得分:
[0125] 甲基化水平=2–ΔCt待检样品/2–ΔCt阳性标准品×100。
[0126] ΔCt=Ct目的基因–Ct内参基因。
[0127] 得分=3.80–0.07×BIN1甲基化水平–0.02×DNM2甲基化水平。
[0128] BIN1和DNM2基因的得分如表2,ROC曲线分析如图2所示(AUC为0.901)。根据本发明试剂盒提供的判读标准,22例甲状腺良性结节有2例阳性,22例甲状腺癌有18例阳性,特异
性达到90.9%,灵敏度为81.8%。
[0129] 表2BIN1基因和DNM2基因联合用于甲状腺结节良恶性判别的得分
[0130]
[0131]
[0132] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明
专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,
在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干
变形和改进,这些都属于本发明的保护范
围。因此,本发明专利的保护范围应以所附
权利要求为准。